人工多菌體系的設計與構建：合成生物學研究新前沿

劉裕，韋惠玲，劉驥翔，王少杰，2，蘇海佳

（1北京化工大學化學資源工程國家重點實驗室，北京生物過程重點實驗室，北京軟物質科學與工程先進創新中心，北京 100029；2上海交通大學電子信息與電子工程學院納米生物醫學與工程研究所，上海 200240）

過去的幾十年中，人類對各種化學品的需求不斷上升。因為以化石能源得到目標產品的方法存在能耗高、污染大、對環境不友好等缺點，于是人們將研究重點轉移到微生物的開發和應用上［1-2］。微生物的細胞工廠中具有各種各樣的催化酶，可以為物質的合成和轉化提供合適的反應條件和環境［3-4］。此外，合成生物學和代謝工程等新興領域的快速發展大大提升了研究人員對微生物進行編程的能力，降低了利用微生物進行各種化學品生物合成的難度［5-6］。目前，大多數生物合成都是在單菌體系中完成的，這種通過微生物純培養得到目標產物的方式為代謝工程的發展起到了奠基作用［圖1（a）］。然而，面對日益增長的產品需求，單菌體系通過純培養完成復雜產物的合成中逐漸顯露出一些缺陷。例如，在單個細胞中表達冗長的生物合成途徑可能會大大增加宿主的代謝負擔，進而使得能量在細胞生長與途徑表達之間的分配失衡，不利于目標產物的合成［7-9］。

幸運的是，人們在自然界中找到了克服能量分配受限的重要線索。為了平衡自然界中的代謝通量，高等生物會將代謝途徑模塊化后分布在各個細胞器中，而結構簡單的微生物會形成各種功能菌群。微生物菌群一直在直接或間接地影響著人類的生活。常見的自然微生物菌群包括厭氧微生物菌群、光自養微生物菌群、嗜酸微生物菌群以及腸道或口腔微生物菌群［10-11］。借鑒自然界中的多菌體系，研究者們開始對人工多菌體系進行開發和研究。人工多菌體系就是將復雜的生物合成途徑和功能分布到不同菌種中，然后將這些具有不同功能的菌株共培養后得到目標產物［12］［圖1（b）］。與自然界的多菌體系相比，人工多菌體系的優勢在于其組成更簡單，分工更明確，并且可針對目標產物進行個性化定制。在人工多菌體系中，代謝途徑和功能被合理地分割并分配給合適的宿主，使得復雜的底物和中間產物有效地被轉化為最終產物，減少了交叉反應的不利影響，并減輕細胞代謝負擔［13-15］。因此，與單菌體系相比，人工多菌體系是一個更加開放和高效的生物合成平臺。本文全面分析和對比了單菌體系和人工多菌體系在代謝工程中的優缺點，突出了人工多菌體系的優勢，并結合應用實例詳細地闡述了人工多菌體系的設計原則。最后以全局調控為出發點，對人工多菌體系未來的發展提出了構想。

圖1 單菌體系和人工多菌體系Fig.1 Schematic diagrams of mono-culture and synthetic consortia

1 人工多菌體系的優勢

單菌體系之所以被廣泛地應用在生物合成中，是因其代謝網絡和遺傳背景清晰，方便作為實驗和研究對象，所以研究難度較低［16-17］。而且單菌體系的培養條件、改造方法等有針對性，易于變化和控制［18］。目前越來越多的針對微生物基因組進行改造的分子生物學工具已經被開發出來，在實現單菌多功能化的同時，降低了工業開發成本［19-21］。盡管單菌體系為代謝工程的發展奠定了堅實的基礎，但隨著目標產物需求的不斷上升，其弊端已逐漸顯現出來。首先，單菌體系在使用前需要對培養儀器和環境進行嚴格滅菌，以防止染菌對發酵結果的不利影響，這會大大增加工業成本。而且在單菌體系中表達復雜的生物合成途徑會造成細胞內資源分布不均，代謝負擔增大［22-23］。在底物利用方面，單菌體系可使用的底物種類較為單一，在針對復雜的可再生生物質時，單菌體系的底物利用效率低，穩定性差。此外，單菌體系在生物合成中易造成中間產物和副產物的積累，而這種積累會造成細胞應激，使細胞消耗更多的ATP和NADH。代謝負擔和細胞應激的協同作用導致“代謝懸崖”現象的出現，不利于目標產物的合成。隨著合成生物學等新興生物學科的快速發展，為了解決單菌體系在生物合成中所遇到的問題，人們開始重視人工多菌體系的設計和開發。與單菌體系相比，人工多菌體系優點具體如下：

1.1 細胞環境多樣

人工多菌體系中包含了不同的菌種，可以為生物合成途徑中的各個酶提供多樣的催化環境。首先，生物合成途徑中包含的酶可能具有不同的最適表達環境，而單個細胞提供的環境較為單一，無法滿足所有酶表達的最適條件。相比之下，人工多菌體系中包含多個菌株，具有細胞環境多樣性，方便為途徑中各個酶的表達提供合適的環境。Zhang 等［24］在構建出E.coli-E.coli人工多菌體系后，為了進一步提高目標產物3-氨基苯甲酸的產量，對10 種不同的E.coli進行測試后，選出了最適合下游途徑表達的菌株，成功將3-氨基苯甲酸的產量提高了30多倍［圖2（a）］。此外，如果途徑中的基因來自不同物種，在人工多菌體系中運用不同物種的菌株，更能為酶的表達提供合適的環境，有效地提升酶的表達效果和目標產物合成效率。而且不同物種之間的菌株相互作用更加多樣，對產物合成也有促進作用。例如，在設計E.coli-S.cerevisiae人工多菌體系之前，研究人員也在E.coli-E.coli體系中成功實現氧化紫杉烷的合成，但是產量很低，原因就在于E.coli之間的相互作用較少［25］。

1.2 代謝負擔降低

人工多菌體系中途徑和功能的合理分配，有利于減少菌種的代謝負擔，平衡途徑中各個模塊的工作強度［26］。來自于植物和真菌的天然產物往往有較長的合成途徑，若將整條合成途徑在一個細胞中表達，細胞在維持自身基本的生長代謝的同時，還要額外運行復雜的合成途徑，而細胞本身的能量有限。因此細胞會將原本供給基本生長代謝的能量分配出一部分給異源途徑的表達，使得最終底盤細胞的基本生長代謝受到影響，目標產物的產量也會隨之降低［27-28］。經過途徑分配后的人工多菌體系中，每個菌株需要運行的途徑明顯變短，細胞代謝壓力也明顯小于單菌體系時的代謝壓力。Jones等［29］設計了一個E.coli-E.coli-E.coli-E.coli人工多菌體系用于從頭合成花青素，值得注意的是，體系中運行的途徑包含了15 個來自不同物種的基因。由于該途徑過長，研究人員對其進行了合理分配，最大程度緩解了宿主細胞的代謝壓力，經過一系列優化后，花青素的產量達到了（9.5±0.6）mg/L［圖2（b）］。此外，在人工多菌體系中，可以通過簡單地改變菌種接種比例的方式增加某個關鍵中間代謝產物的合成與轉化效率，達到平衡途徑中各個模塊的工作強度的目的，這相比于在傳統的單菌體系內進行優化更加容易［30-34］。在E.coli-E.coli人工多菌體系合成原兒茶酸的實驗中，研究人員發現關鍵中間產物4-羥基苯甲酸的轉化效率不高，通過簡單地調整上游細胞UY2 和下游細胞BLA 的接種比例后，將原兒茶酸的產量從43 mg/L增加到260 mg/L 的同時，完成4-羥基苯甲酸的全轉化［35］。

圖2 人工多菌體系在生物合成中的優勢Fig.2 Schematic diagram of synthetic consortia advantages in biosynthesis

1.3 底物轉化能力高

人工多菌體系具有高效的底物轉化能力。盡管單菌體系經過改造后可以同時利用多種底物，但是不同底物的轉化途徑會相互干擾，造成細胞代謝壓力增大，能量分配混亂。而且碳分解代謝抑制作用（CCR）也會嚴重降低每種底物的利用率［36］。而在人工多菌體系中，可以將不同的底物利用功能進行分配，使每個菌種具有不同的底物利用偏好，這樣既消除了單個細胞利用多種底物的干擾，又提高了整體的底物利用率。Flores等［37］設計了一個E.coli-E.coli人工多菌體系，體系包含了野生型E.coliW和產乙醇菌LY180，這兩種菌經過改造后分別只利用葡萄糖和木糖。該人工多菌體系在葡萄糖∶木糖=2∶1 的混合底物中生產了46 g/L 乙醇，明顯高于產乙醇菌LY180的單菌體系產量（36 g/L）。這說明底物利用偏好分離的人工多菌體系有高效的生產能力。

除了高效利用多種底物，人工多菌體系還可以利用單菌體系無法利用的復雜底物。經過改造的單菌體系雖然能合成目標產物，但是其可以利用的底物種類有限。對于微生物普遍可以利用的葡萄糖等糖類，單菌體系可以將其輕而易舉地轉化為目標產物，而對于自然界中存在較多的淀粉、纖維素等復雜底物，許多單菌體系往往不能對其進行轉化［38］。針對這些復雜底物，人工多菌體系表現出更優秀的底物轉化能力。某些菌株可以將這些復雜底物分解成小分子糖，這些糖類便可被體系中其他菌株利用，這種互利共生的菌間關系使得人工多菌體系既有效地完成了目標產物的合成，又可以利用這些難被利用卻含量豐富的復雜底物［39］。本實驗室Wang 等［40］在篩選出兩株高效產氫細菌Bacillus cereusA1 和Brevundimonas naejangsanensisB1 后，利用B.cereusA1 可以將淀粉快速分解成寡糖和B.naejangsanensisB1 快速產氫的功能，構建出具有利用淀粉高效產氫能力的人工雙菌厭氧產氫體系，該雙菌體系中淀粉酶活比單菌體系提高了1.5倍。

1.4 “即插即用”特性

人工多菌體系具有“即插即用”特性，可以靈活地完成多種產物的合成。人工多菌體系中，每種菌株包含的途徑和功能較為獨立，正是菌株之間這種正交的關系，增加了人工多菌體系在產物合成方面的能力，即通過添加或更換體系中包含的菌株，方便快捷地對體系進行優化并改變合成的產物種類，這便是“即插即用”特性［41-42］。Zhang 等［43］在成功構建出順，順-黏康酸（cis，cismuconic acid，MA）的人工多菌體系后，繼續用同樣的上游細胞，將下游細胞包含的途徑更換成從3-脫氫莽草酸到4-羥基苯甲酸的合成途徑，成功產出4-羥基苯甲酸，且產量達到了2.3 g/L。此外，在現有的多菌體系的基礎上，可以往體系中繼續添加功能菌株，將產物進一步轉化，完成體系的功能拓展［圖2（c）］。Jones 等［29］在成功構建出花青素人工多菌體系后，計劃在體系中繼續添加菌株，進行體系功能的延伸，這足以體現出人工多菌體系具有強大的生物合成潛力。

1.5 反饋抑制的消除

人工多菌體系可以很好地消除反饋抑制。細胞在表達合成途徑時會產生一些副產物，這些副產物的生成既消耗了菌株本身的能量，還會反過來對菌株本身的生長造成不利影響，進而降低目標產物的合成效率。若想在單菌體系中消除這種反饋抑制，通過敲除副產物途徑基因阻斷該途徑是較為常用的方法，但是這種阻斷方式可能會影響其他途徑的正常工作。而在人工多菌體系中，研究人員可以利用菌間的交叉喂養消除反饋抑制，且不會影響其他途徑的正常運行。Zhou等［25］在構建E.coli-S.cerevisiae人工多菌體系用于生產氧化紫杉烷時，為了消除以葡萄糖為單底物時的底物競爭和乙醇對E.coli的反饋抑制，將底物更換成了酵母無法利用的木糖。此時E.coli利用木糖生成前體物質紫杉二烯和乙酸鹽，S.cerevisiae以乙酸鹽為碳源生存并將紫杉二烯轉化成氧化紫杉烷。此時S.cerevisiae便不再產生乙醇，反饋抑制消失，并且減少了乙酸對E.coli生長的不利影響［圖2（d）］。E.coli-Pseudomonas putida人工多菌體系在生產中鏈長度的聚羥基鏈烷酸酯（mcl-PHA）時，P.putida會利用E.coli分泌的乙酸鹽和細胞外游離脂肪酸（FFA）合成mcl-PHA。此時P.putida可以為E.coli提供有利的生長環境，E.coli又為P.putida提供了合成mcl-PHA 的原料。正是人工多菌體系中的“交叉喂養-解毒”的互作關系，將反饋抑制的消除最大化［44］。

2 人工多菌體系設計原則

2.1 途徑分工的理性設計

將體系中的功能進行合理的分割和分配，對途徑進行理性設計是設計人工多菌體系一條重要的原則。但是途徑的分割與分配，必然會造成其物理上的隔離，而這種物理隔離對中間產物濃度和傳質效率有不利影響，造成傳質障礙。為了將傳質障礙的影響降到最低，需要選擇合適的中間產物作為途徑分割的標準［45］。首先，中間產物的合成或轉化過程最好是限速步驟，這樣就可以通過途徑分割，有針對性地進行優化，將限速的不利影響降到最低。其次，該中間產物必須可以通過細胞膜，保證物理隔離不會影響其正常地外排和吸收［46-47］。此外，使用合適的膜轉運蛋白或調節細胞膜的通透性可以提高中間產物的傳質效率，例如3-脫氫莽草酸的轉運蛋白ShiA 的發現及應用推動了一系列相關產物的合成以及產量的提升［43，48-49］。盡管人工多菌體系可減輕細胞代謝負擔，但途徑的過度分割也會大大降低中間產物的濃度和傳質效率［50］。而且如果菌群中的菌種過多，對菌群的控制和優化的難度將增大，所以要合理對途徑進行設計。

2.2 菌群互作關系的理性設計

2.2.1 底盤細胞的選擇

底盤細胞的選擇是菌群互作關系理性設計的基礎。除了選擇具有合適催化表現的菌株外［51］，還需要考慮是否可以與其他菌株共生。理想情況下，多菌體系可以利用每種菌株獨特能力很好地完成目標產物的合成。但是，要使這些菌株在系統中長期穩定存在，需要考慮許多問題，例如引起種間排斥問題的外毒素和不利于其他菌種存活的副產物。為了解決種間排斥問題，可以設計包含單一物種的人工多菌體系。如果體系中必須使用不同物種，應選擇不分泌外毒素或具有抵抗外毒素能力的菌株［52］。其次，選擇突變率低的菌株也有利于體系的穩定。隨著時間的流逝，經過或未經過改造的菌株都可能出現不可預測的突變，進而對目標產物的合成產生不利影響。因此，有必要選擇具有低突變率的宿主，維持體系的穩定。Xiao 等［53］開發了體內種群質量控制（PopQC）機制來連續選擇具有高效率和非遺傳變異的細胞，該機制已成功用于酪氨酸和游離脂肪酸的生物合成，使得產量翻倍。

2.2.2 底物協同利用

設計人工多菌體系，使其可以同時利用多種底物，既可以有效避免體系內菌株利用單一底物時產生的底物競爭，又可以增加體系的底物利用能力。在設計時，需要全面分析菌株本身和目標產物合成途徑，根據菌株底物代謝途徑和氧化還原平衡等一系列約束條件，合理設計菌株的底物偏好。此外，底物功能互補也被廣泛地用于人工多菌體系中以增加菌株之間的協作關系。當底物為淀粉或纖維素等復雜的底物時，某些菌株無法對其直接轉化，此時需要將此類菌株與可以將這些復雜底物分解為小分子糖的菌株共同培養［54］。這種功能上的互補，使得人工多菌體系能更好地利用復雜底物進行生物合成［圖3（a）］。例如人工多菌體系Clostridium phytofermentans-E.coli中的C.phytofermentans可以將底物纖維二糖分解成葡萄糖供E.coli生產生物燃料［55］；E.coli-Trichoderma reesei中的T.reesei分泌的纖維素酶將木質纖維素水解成可以被E.coli利用的可溶性糖，E.coli將可溶性糖轉化為異丁醇［56］；E.coli-C.glutamicum中的E.coli可以分泌淀粉酶，將淀粉分解成葡萄糖供C.glutamicum利用合成L-賴氨酸等產物［57］。

2.2.3 菌間互利共生

由于人工多菌體系中包含多個菌株，確保菌株之間互利共生的需求關系是聯系各個功能模塊，高效完成生物合成的關鍵［58］。確保菌間互利共生的基礎是一種必需關系的確立，即對菌株進行改造，使得菌株在體系中其他菌株不存在的情況下無法正常地生長和生物合成［59-60］。比較常見的是營養缺陷型互補的改造。將系統內菌種改造為營養缺陷型，并且菌株之間可以為對方提供缺陷的氨基酸，這種互補方式有助于增加菌種之間的協同作用，從而增加途徑和功能之間的聯系［61］［圖3（b）］。Liu 等［62］在設計紅景天苷人工多菌合成體系時，將體系中兩個菌株分別改造成苯丙氨酸和酪氨酸缺陷型，既為對方菌株的生存提供了必需的營養物質，又增加了上下游途徑的聯系。氨基酸營養缺陷型的種類也與細胞間相互作用緊密相關。研究表明，與合成成本較低的氨基酸相比，蛋氨酸、精氨酸、異亮氨酸和芳香族氨基酸等合成成本較高的氨基酸往往會促進菌間形成更強的協同作用［63］。此外，在環境保護方面，該方法還可以有效防止生物污染。一旦環境中缺少改造菌必需的物質，該菌將無法生存。

圖3 人工多菌體系設計原則Fig.3 Design principle of synthetic consortia

菌種間最佳關系（如共生和合作）的確立也有利于菌間的互利共生［64-65］。這種最佳關系體現在物質交換和營造菌株最佳合成條件中，在自然菌群中普遍存在，并已成功應用在人工多菌體系［66］。Harcombe 等［67］設計了E.coli-Salmonella enterica多菌系統。研究人員首先在乳糖培養基上馴化了蛋氨酸營養缺陷的E.coli，使其可以將乳糖分解為葡萄糖和半乳糖。同時，S.enterica分泌出合成成本較高的蛋氨酸，以換取E.coli產生的半乳糖。這種關系的轉變替換了乙酸與蛋氨酸的不平等交換關系，從而使得兩個菌種獲得同等價值的收益。而營造菌株最佳合成條件常常與物質交換密不可分，讓體系中某一菌株消耗掉不利于關鍵菌株生長和合成的物質，為其營造出最佳的環境，并且這種“解毒”效應也不會影響解毒菌株本身的生長。本實驗室Wang等［40］利用Bacillus cereusA1和Brevundimonas naejangsanensisB1 構建出以淀粉為底物的產氫雙菌系統后，該體系的產氫量明顯高于其各自菌株的純培養。通過對兩株菌進行深入研究后發現，菌株A1 產生的乳酸鹽作為電子供體，促進了菌株B1的產氫，而菌株B1通過一碳代謝產生甲酸鹽，并作為電子穿梭載體運輸到菌株A1 以增強氫氣產生。通過這種協同作用，使得最終A1 菌和B1 菌產氫相關基因分別上調表達了1.7倍和11.9倍［圖3（c）］。

2.2.4 體系適配魯棒

與單菌體系不同，人工多菌體系中的不同菌種執行不同的功能，其生長速率也各不相同。如果一個菌株生長失控，該菌株數量將在菌群中占上風，導致菌群結構失衡，這不僅會導致底物競爭，還會導致關鍵中間產物的積累和轉化受阻，目標產品的產量將下降。因此，在構建人工多菌體系時，采用種群控制策略，應用細胞篩選機制，可以穩定菌株數量，從根本上保持體系結構的穩定性，提高目標產物的產量。

根據介導物質的不同，可以把種群控制策略分為產物介導型和信號分子介導型。產物響應型生物元件可以根據環境中產物的濃度，對包含該產物的合成途徑的菌株進行數量上的控制。生物傳感器在環境監測、醫學診斷、藥物發現、過程控制和食品安全中起著至關重要的作用［68-70］。將生物傳感器與產物響應型生物元件相結合，應用到人工多菌體系中，可以對相應菌株起到控制作用。Guo 等［71］建立了兩個不同的E.coli-E.coli人工多菌體系，分別通過兩種不同的前體（4-羥基苯甲酸酯和酪氨酸）合成苯酚。上游菌株分別使用4-羥基苯甲酸酯和酪氨酸介導的生物傳感器來篩選高效細胞，保證4-羥基苯甲酸酯和酪氨酸的供應充足。在這兩種細胞選擇機制的作用下，與單菌體系相比，人工多菌體系中苯酚產量分別提高了2.3倍和3.9倍。而且，該機制還消除了低效菌株和高效菌株之間的底物競爭［圖4（a）］。

圖4 菌群控制策略在人工多菌體系中的應用Fig.4 Applications of population control strategy in synthetic consortia

信號分子介導型生物元件往往與群體感應（QS）關系緊密［72］。群體感應提供了一種在細胞通信中協調群體水平和行為的方式，尤其是基于小分子AHL 的群體感應系統，因其簡單的遺傳結構已成為細胞通信的首選技術，特別是在人工多菌體系中［73-76］。Stephens 等［77］設計了基于細胞信號分子的生長控制機制，以正交自誘導物AI-1 和AI-2為信號分子，對E.coli-E.coli人工多菌體系進行菌株的代謝調控。此外，Dinh 等［78］設計了一種包含群體感應生長調節電路的E.coli-E.coli人工多菌體系，用于柚皮素的生物合成。體系中僅上游菌株包含生長調節回路，下游菌株沒有。當兩個菌種細胞密度低時，兩種菌株均以其基線速度生長。一旦AHL 在環境中積累到一定濃度，上游菌株的生長就會受到抑制，而下游菌株繼續生長。該機制可以防止由于上游菌株生長失控而引起的中間產物積累和底物競爭，且在僅改變接種比例后即可使該菌群的柚皮苷產量增加60%［圖4（b）］。

2.3 功能菌群時空有序分布

在確保物質交換的前提下，構建結構與功能相適應的限域空間，促進菌株的時空有序分布，有利于菌株之間進行更好的協同互作以及對體系的控制［79］。菌種固定化便是比較常用的一種時空分布應用，并在生物合成中有很好的促進作用［80］。Johnston 等［81］研發出一種特制的水凝膠作為一種新型載體應用在人工多菌體系的菌種固定中。該種水凝膠既不會影響菌種的物質交換，又對菌種有很好的保藏作用，有利于菌種功能的穩定。通過組合含有不同功能菌株的水凝膠即可完成目標產物的生物合成。這不僅避免了菌種接觸培養的局限性，又有利于對菌群進行控制。為了構建性能優異、魯棒性強的混菌體系，本實驗室Su 等［82］提出基于氧驅動下時空有序分布的多殼層混菌體系快速構建策略。好氧顆粒污泥內部菌群的分布會在營養物質的供給、內部優勢菌群的變化以及代謝物質改變等因素的影響下進行變化，以功能菌（如塔賓曲霉）介入構建限域空間，可促進細胞間分工協作，提高好氧顆粒污泥對環境脅迫的適應性和穩定性。根據顆粒內部氧濃度的不同，菌株在顆粒內由內而外的分布分別為厭氧的產甲烷菌、兼性厭氧的產氫產乙酸菌和好氧的產酸菌。這種基于多殼層結構的混菌體系，環境適應性和穩定性增強，而且在高鹽、高有機負荷下，有機質的利用率提高，甲烷產率提高近1 倍［83］［圖5（a）］。培養裝置的設計對人工多菌體系中菌種的時空分布和控制也有很大的幫助。基于氧氣在空間上的梯度分布，Shahab 等［84］設計了一個通氣生物膜反應器，實現了里氏木霉、兼性厭氧乳酸菌與專性厭氧乳酸菌的合理共存和功能互補，在確保人工多菌體系中不同氧需求的菌種共存的同時，使得該多菌系統可以利用復雜底物生產多種化學品［圖5（b）］。此外，Moutinho 等［85］設計了一個垂直膜共培養板，通過實時測量OD600來量化非接觸菌種之間的相互作用。

圖5 時空分布在人工多菌體系中的應用Fig.5 Application of spatiotemporal distribution in synthetic consortia

2.4 基于模型算法指導下的多菌體系的理性構建

作為一種新興的方法，基于各種優化數據對人工多菌體系進行計算和模擬有望準確地構建人工多菌體系［86］。計算的輔助可以進一步提高人工多菌體系構建的準確性和針對性，從而大大提高目標產品的產量。目前已經發展的人工多菌體系構建的計算輔助方法已經涵蓋了代謝網絡的構建方法（如PROM和GEMINI算法［87］等）、多菌體系代謝相互作用的模擬算法（如Joint-FBA［88］和NECom［89］算法等）、代謝調控算法（如蛋白質相互作用網絡分析法［90］等）等各個方面。Jones 等［91］在E.coli-E.coli多菌體系中成功生產了黃烷-3-醇后，建立了一個規模化的高斯模型，根據一系列優化數據來預測最優體系。最后，黃烷-3-醇的產量提高到（40.7±0.1）mg/L，相當于先前報道的970 倍提高。同樣，Harcombe 等［92］設計了一個多尺度建模框架，該框架基于詳細的細胞-細胞代謝計算多菌體系的時空動態，而無需預先假設不同物種是否以及如何相互作用。計算數據與轉錄組、蛋白質組和其他組學數據相結合，可以全面地對人工多菌體系進行評估。但目前可以全面評估、預測和計算人工多菌體系的程序和方法相對較少，需要投入更多的時間和精力進行開發。

3 結論與展望

與具有很多限制的單菌體系相比，人工多菌體系因其強大的魯棒性、靈活性和高產量而成為新型且有效的生物合成系統，特別是對于具有復雜結構和冗長合成途徑的天然產物。人工多菌體系可以為生物合成途徑提供更好的細胞環境，通過優化途徑所在菌種便可實現相關中間產物的合成與轉化，進而提升目標產物產量。此外，人工多菌體系支持即插即用的生物合成，方便生物合成途徑的重建，簡單、快速地獲得多種生物產品。人工多菌體系為解決各種蛋白質的功能表達、復雜底物的有效利用、生物合成途徑的快速重組等問題提供了新的視角。因此，人工多菌體系在異源生物合成中具有廣闊的研究和應用前景。盡管人工多菌體系的合成能力非常出色，但其在廣泛應用和工業化中仍存在問題，例如傳質受阻，體系的維穩與菌株適配等。因此研究人員需要尋找和設計人工多菌體系的優化手段，以達到維持菌群的穩定性以及菌群代謝的控制和分析的目的。

對人工多菌體系進行全局調控是人工多菌體系優化中的重要組成部分。全局調控可分為內部優化和外部強化。內部優化是指通過一系列分子生物學方法改變菌種攜帶的遺傳物質，改變其功能性狀以提高目標產物產量。常見的單菌體系代謝工程改造方法也可用于人工多菌體系的優化，例如：敲除競爭途徑使更多的物質和能量流向產物合成途徑［93］和使用順式作用元件和反式作用因子（例如強啟動子和轉錄調節因子）來調節關鍵基因的表達等［94-95］。此外，還有一些針對人工多菌體系內部優化的新方法：①在人工多菌體系中改造菌種使其具有不同的底物偏好，以消除碳分解代謝阻遏效應和底物競爭，有利于維持人工多菌體系的穩定性［96］；②將具有不同功能的質粒分布到不同的細胞中，合理地對功能和途徑進行劃分，盡可能減少物理隔離對傳質的影響。因為質粒的復制和保存會給宿主帶來額外的新陳代謝的負擔，占用宿主的細胞資源［97］。此外，開發有效的合成生物學工具和設備，以監測、控制和調節菌群內細胞間通信［98-99］。例如，基于RNA 核糖開關的生物傳感器模塊的開發也可有效地實時篩選和控制系統中過量生產的細胞，防止中間產物積累［100］。與內部優化相反，外部優化是在沒有任何基因工程操作的情況下通過改變發酵條件等外部條件提升目標產物產量的優化方式。常見的外部優化包括調整接種比例、底物濃度、溫度、pH 和需氧-厭氧轉換等［101-103］。將內部優化和外部優化共同作用在人工多菌體系中，有望大幅提升目標產物合成效率。在E.coli-E.coli己二酸合成的人工多菌體系中，關鍵酶CaER 的使用使得關鍵中間產物順，順-黏康酸的生物合成與降解的需氧量不同，所以在上游細胞中表達玻璃藻血紅蛋白（VHb），促進上游細胞攝取氧氣，增加了順，順-黏康酸的合成的同時，為下游細胞中CaER 酶的工作營造出微需氧的最佳工作環境。在經過更換強啟動子和接種比例的優化后，己二酸的產量達到了（27.6 ±1.3）mg/L，明顯高于E.coli純培養的產量［（5.8 ±0.9）mg/L］［104］。除了全局調控之外，選取在工業化生產中表現優秀的菌株或者構建出可以投入工業化生產的菌株作為人工多菌體系的成員菌株，有利于縮短從實驗室發酵到工業化的距離。

目前發表的人工多菌體系多為雙菌體系，即包含兩種執行不同功能的菌株，而且包含同種屬菌株的人工多菌體系較多，因為相比之下包含不同種屬菌株的人工多菌體系在培養條件和菌間調控的要求較高，增加了操作成本。另外，包含3種及以上成員菌的人工多菌體系報道極少，除了培養條件優化的難度與雙菌體系相比更高，體系內菌間互作機制變得更加復雜，不利于后期的探究與體系改造。然而，包含多種成員菌的人工多菌體擁有容納和執行更加復雜的生物學功能的潛力，因此，研究人員需要將更多的注意力放在人工多菌體系研究方法的開發上。例如，隨著生物信息學與多組學技術的快速發展，開發新的數學算法，建立高精度全基因組代謝網絡模型，理性指導多菌體系的構建有望成為研究新趨勢。相信在未來幾年中，更高效、更具成本效益的人工多菌體系的開發將成為現實，生產出更多的高價值生物產品，推動綠色生物制造的發展。