大規模哺乳動物細胞培養工程的現狀與展望

朱紫瑜，王冠，莊英萍

（華東理工大學生物工程學院，國家生化工程技術研究中心，生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237）

幾十年來，哺乳動物細胞一直被用作生產治療性蛋白的載體。治療性蛋白廣泛應用于疾病的診斷和治療等方面，形成了巨大的市場［1］。2018年全球生物制藥市場價值2372 億美元，預計到2024 年將達到3890 億美元，在2019—2024 年的預測期內，復合年增長率將達到8.59%［2］。2006—2010 年間，大約55%的生物藥品是哺乳動物細胞表達，2010—2014 年間，60%的重組治療蛋白也是基于哺乳動物細胞表達［2］。其中，單抗類藥物數量最多，2019 年全球單克隆抗體市場規模達到1640 億美元左右，在全球生物制品中份額占比達到50%以上，是全球生物制品行業中最大的子行業［3］。因此，通過哺乳動物細胞生產蛋白質產品的需求量日益提高，使得動物細胞大規模培養技術的研究與開發成為生物制藥領域的重要任務。

自1907 年Harrison 等以淋巴液作為培養基在體外培養蛙胚神經組織建立體外培養技術以來，細胞培養技術已經經歷了近一個世紀的發展，并逐步走向規模化、自動化和多樣化［4］。體外培養過程中營養物質是一個關鍵因素，1951 年Eagle 等開發了促進細胞體外培養的合成培養基（MEM），成為培養基配方開發劃時代的里程碑事件，為之后無血清培養基的開發奠定了基礎［5］。血清中含有上千種不同成分，為細胞體外培養提供廣泛而豐富的營養和各種細胞因子，但動物血清的使用存在引入外源病毒的風險，不同批次差異很大，并且成本昂貴。因此減少血清濃度或完全去除血清對細胞培養有著重大意義。到了20 世紀80 年代，Sato 等［6］在替代血清方面取得了突破性進展，通過在基礎培養基中添加蛋白（如胰島素、轉鐵蛋白和白蛋白）可以很大程度上替代血清。在培養基的發展進程中，細胞培養技術也逐步走向規模化。1957 年Graff 用灌注培養法培養懸浮細胞，細胞密度達到1×1010～2×1010cells/L，標志著灌注培養法的誕生［7］；1962年Capstick成功大規模培養小鼠腎細胞（BHK），標志著動物大規模培養技術的起步［8］。隨后1967 年，Van Wezel 等［9］用DEAE-Sephadex A50為載體培養細胞，建立了微載體培養技術，這一技術的應用為貼壁依賴性哺乳動物細胞的大規模培養開辟了新的途徑。70—80 年代，利用動物細胞培養獲得治療性蛋白等生物制品發展迅速，在醫學領域發揮了巨大作用。1975 年Kohler 和Milstein［10］將產生抗體的淋巴細胞與腫瘤細胞融合，獲得了既能在體外無限繁殖，又能產生特異性抗體的雜交瘤細胞，成功建立了單克隆抗體技術，并因此獲得了1984 年諾貝爾醫學和生理學獎。1986 年Demo Biotech 公司首次利用微囊化技術培養雜交瘤細胞生產單克隆抗體，從此單抗的生產實現工業化，開始廣泛應用于生物醫學研究和臨床治療等多個領域［11］。在大規模培養過程中，保證產品的產量和質量至關重要，1989 年，Konstantinov 首次提出了大規模培養過程中的生理狀態控制，為細胞培養工藝中優化控制理論奠定了基礎［12］；隨后張嗣良［13］提出基于生物過程多尺度參數相關分析理論，并結合PAT 技術，實現生物過程的優化與放大。2004 年美國食品和藥物管理局（FDA）正式發布了過程分析技術（PAT）工業指南，通過在線過程監測從嚴格的質量測試轉向了靈活的質量設計方法。如今正處于大數據時代，基于大數據的智能生物制造順應時代發展。2019 年美國工程生物學會聯盟提出“基于多組學數據的機器學習的DBTL 循環支持系統”理論，從多尺度逐步發展為數據科學及智能化，將成為我國生物工程領域進步的一項重要內容［14］。在基因治療方面，Yang 等［15］利用合成生物學方法開發出一種簡單、穩定的光調控基因表達系統（light on），可以精確定位、定量、定時控制功能基因的表達，在生物治療領域具有非常廣闊的前景；2014 年Karl和Outi 等［16］開發一種方法使來自八細胞胚胎的單細胞培育成為可能，意味著可以用一個細胞大規模地生成干細胞，為干細胞治療帶來了希望。隨后，廣州生物醫藥與健康研究院開發了“全自動干細胞誘導培養設備”，首次實現了以機器學習以及人工智能算法為判定的細胞自動化誘導［17］，為我國智能生物制造提供了上游細胞來源的培養設備（圖1）。

圖1 動物細胞大規模培養技術發展史以及細胞培養技術發展的里程碑事件（從1907年體外組織培養法的建立，發展至今基于多組學數據和機器學習的智能生物制造，列出了動物大規模培養技術的發展過程以及細胞培養技術發展的突破性事件；EBRC—美國工程生物學會聯盟）Fig.1 History of large-scale animal cell culture technology and milestone events in the development of biotechnology(From the establishment of in vitro tissue culture in 1907 to the development of intelligent biomanufacturing based on multi-omics data and machine learning,the chronological development of large-scale animal culture technology and the breakthrough events in the process are highlighted;EBRC—The Engineering Biology Research Consortium)

動物細胞大規模培養體系建立過程涉及的主要技術包括優良細胞系的構建、培養基的優化與開發、培養過程工藝優化與放大策略制定、目的產物的分離純化等。目前，大規模細胞培養的技術已經非常成熟，在生物醫藥的生產中已經得到了廣泛的應用。在生物制藥中，細胞是病毒、蛋白的表達載體，細胞質量直接影響蛋白的表達量或者病毒的滴度，因此構建與篩選優質細胞是關鍵。采用高產細胞株（高抗體蛋白表達、高病毒產率）可以提高目的產品的產量并且降低成本，是產業化的首要選擇。同時，安全性也是生產中需要考慮的一個重要因素。中國倉鼠卵巢（CHO）細胞一直是生產重組蛋白的首選［18］，主要是由于：①CHO 細胞具有準確的轉錄后修飾功能，表達的糖基化治療蛋白在分子結構、理化特性和生物學功能方面最接近天然蛋白分子；②它的產物分泌在細胞外，而且很少分泌自身的內源蛋白，便于下游產物分離純化；③具有重組基因的高效擴增和表達能力；④CHO 細胞通常貼壁生長，也可懸浮生長，具有較高的耐受剪切力和滲透壓能力，并且貼壁生長的CHO 細胞可以在微載體上進行懸浮培養［19］。因此，以CHO 細胞為基礎的單克隆抗體生產工藝已經非常成熟，通常可達到很高的抗體效價，傳統的分批培養7～14 天通常效價為1 g/L，補料分批培養約為10 g/L［20］。如今采用一種灌流培養的方式，隨著培養基的連續供給而不間斷地生產單克隆抗體，這種方式為細胞提供了更合適的生長環境，因此在細胞培養過程中可以獲得更高的細胞密度和活力［21］。

在動物細胞培養過程中，培養基為細胞生長、維持提供營養，滿足其物質與能量需求。含血清培養基是目前最常用的培養基之一，血清提供很多的生物活性成分，包括蛋白質、維生素、生長因子和激素，為細胞提供所有必要的營養，促進細胞增殖和改善特定細胞功能［22］。但是由于血清成分復雜，不僅會增加產品分離純化的成本，還容易引起病原體污染［23］。血清替代品種類多樣，包括激素、生長因子、貼壁因子和結合蛋白等物質，不同類型的細胞對于這些因子的種類和濃度需求不同，因此需要對這些成分進行篩選和優化，以滿足細胞生長需求［24］。此外，一些新的方法也進入了培養基優化領域，包括多種“組學技術”，如蛋白質組、代謝組、轉錄組，這些技術能夠更好地幫助理解細胞生理特性，有助于改進細胞生產過程［25］。Chong 等［26］使用高效液相色譜（HPLC）和質譜（MS）相結合的方法表征培養基成分、胞內和胞外的氨基酸濃度以及影響細胞增殖和生長的相關代謝途徑。

細胞大規模培養過程中，監測和控制策略的進步提高了細胞生產性能和穩健性。通常對生物過程涉及的物理、化學和生物學參數進行監測，以過程產生的數據為基礎結合細胞特性，并運用生物反應動力學將一些變量控制在合適的范圍內，以滿足細胞生長需求。這些變量，如溫度、溶氧、pH 值等環境因素以及營養物質濃度和代謝副產物濃度，決定了細胞生長和代謝特征。同時還包括一些反映細胞生長和代謝特征的軟測量指標，如細胞比生長速率、營養物質的比消耗速率、代謝副產物的比生成速率、攝氧率以及二氧化碳釋放速率等。隨著在線生物傳感器的不斷發展，生物反應器參數的在線監測和控制技術也得到飛速發展。例如，活細胞傳感儀依靠介電常數和介電譜可更加準確地確定活細胞濃度［27］，由于正常活細胞具有完整的細胞膜，胞內的帶電荷離子在特定頻率下的交變電場可以產生極化現象，使得活細胞可以被看作是極小的電容器。通過檢測電容信號，再經過一定的信號處理，可以得到相應的電容值，其大小與環境中的活細胞量成正相關，因此電容值就可以用于測量活細胞濃度［28］。利用基于近紅外和中紅外的光譜探針，可以對復雜的細胞培養液成分進行評估，如營養物質、副產品、活力以及細胞和重組產物的濃度［29］。

生物反應器是動物細胞培養的核心設備，其結構的優化與設計一直是生物過程優化中非常關鍵的環節。攪拌式生物反應器由于其機械結構簡單、易于操作，是目前應用最廣泛的一種生物反應器。一般攪拌式生物反應器體積在1.5～25 L 不等。雖然反應器的結構簡單，但反應器內部形成的流場環境卻非常復雜，如反應器內部流體的混合、剪切環境等，這些因素使得對生物反應器操作條件進行優化和放大非常困難［30］。因此，研究人員通過研究生物反應器流場特性，包括混合、相間傳質、剪切等，將其與細胞生理代謝特性相結合進行生物過程的優化和放大。Liu 等［31］通過對紅花細胞進行放大培養，發現隨著反應器規模的增加，攪拌器內的剪切力也隨之增加，會導致培養過程放大失敗。為了深入研究反應器內細胞生長與剪切力的關系，利用定向剪切試驗擬合了細胞在剪切作用下的死亡動力學，并將死亡動力學整合到流場模型中，根據細胞在流場中的運動軌跡和細胞所經歷的剪切力的大小，成功模擬了細胞在15 L 反應器內剪切對細胞生長的影響，為生物反應器的設計提供了很好的依據。

1965 年因全球糧食和飼料資源分布不佳，Daniel I.C.Wang 建立食品生產生化基礎平臺，解決了糧食和飼料短缺的問題。同一時期能源危機出現，為了大規模生產各種液體燃料以及生物制品，Daniel I.C.Wang 等引入計算機技術促進和理解大規模生產過程以提高產量。到1980 年，重組脫氧核糖核酸技術被視為一個變革性事件，許多新的人類治療產品的生產潛力正在成為現實，Daniel I.C.Wang 對動物細胞培養的興趣持續發展，并建立生物技術過程工程中心（BPEC）開始著手研究動物細胞培養技術［32］。從20 世紀80 年代開始，Daniel I.C.Wang 通過微載體技術、生長培養基設計、過程監測和控制以及新穎的生物反應器設計來改進細胞培養，大大改善了操作條件。到90 年代中期，Daniel I.C.Wang 課題組的研究轉向由分子尺度理解生物過程，從反應器到細胞，再到代謝途徑，最后到蛋白質本身，致力于闡明過程操作是如何影響蛋白質的翻譯后修飾以及細胞行為，并于1995 年建立治療性藥物的多尺度方法。Daniel I.C.Wang 課題組通過這些研究改善了治療性蛋白的生產過程，推動了生物制藥行業的進步［33］。

本文作者將結合實際案例對動物細胞大規模培養在細胞株的構建、培養基的開發以及培養過程的優化與放大等方面取得的突破與進展進行系統的總結。在此基礎上，對細胞大規模培養過程實現智能生物制造進行展望。

1 優良細胞株的構建

合成生物學作為一種新興的、匯聚性的學科，隨著基因工程技術的進步和合成生物學理念的深入，已經成為生物學最有發展潛力的領域之一［34］。基因工程技術使人們不再受自然變異和選擇的限制，通過對目的基因的改造可以大幅度提高細胞株的性能。將其結合代謝工程，在代謝網絡中對酶基因引入、敲除或調控可以創造新的細胞類型。細胞代謝網絡非常復雜，從細胞到產品往往包括幾十步反應，因此，目前一些比較常用的代謝工程改造策略就是過表達產物合成途徑中的關鍵酶，解除產物合成抑制或敲除副產物生成途徑［35］。通過這種代謝工程與合成生物學相結合的方法，人們可以獲得大量的工程細胞株來生產生物制品（如單克隆抗體）［36］。

1.1 單克隆抗體生產過程中的“產品質量”

單克隆抗體制造的目的是產生具有與體內情況盡可能接近微觀異質性的蛋白質。單克隆抗體的主要序列由基因決定，但決定重組蛋白微觀異質性的是翻譯后修飾［37］。糖基化是細胞進行的翻譯后修飾過程，它是通過某些氨基酸共有序列將各種糖基添加到蛋白質骨架上，含有這些糖基的蛋白質被稱為糖蛋白。蛋白質糖基化修飾可以增加重組蛋白的溶解性、穩定性以及生物活性［38］。

糖蛋白中眾多糖（如半乳糖、巖藻糖、N-乙酰氨基葡萄糖）的末端唾液酸化尤為重要。唾液酸是一種酸性九碳單糖，以糖苷形式與其他糖的不同位置相連，最常與半乳糖或N-乙酰半乳糖胺相連［39］。末端糖唾液酸的存在會增加體內糖蛋白的循環半衰期，即延長糖蛋白的存在時間，使重組蛋白在人體內發揮更大的效力［40］。核苷酸糖底物的使用和糖蛋白通過內質網和高爾基體的運輸也是決定蛋白質糖基化的重要因素，其中大多數核苷酸糖都是在胞漿中合成的，通過核苷酸轉運蛋白將胞漿中的核苷酸糖轉移到高爾基體腔內。CMP-唾液酸的激活發生在細胞核中，因此限制CMP-唾液酸向高爾基體的運輸可能是重組糖蛋白唾液酸化不能進一步增加的原因［38］。Daniel I.C.Wang 課題組［41］構建了CMP-唾液酸轉運蛋白（CMP-SAT）表達載體，將其導入CHO 細胞中過表達并觀察干擾素-γ（IFN-γ）的唾液酸化水平，發現與未經過表達的CHO 細胞相比，在轉錄水平和蛋白水平上的CMP-SAT 總表達水平分別提高了2～20 倍和1.8～2.8 倍，并且IFN-γ 的唾液酸化水平提高了4%～16%，這種策略可使我們最大限度地提高糖蛋白唾液酸化水平。

糖蛋白中唾液酸含量同樣受到酶的影響，唾液酸轉移酶在細胞內的表達可以增加唾液酸，或者唾液酸裂解酶的表達可以去除唾液酸。因此需要找到一種方法在整個細胞培養過程中抑制唾液酸酶的活性，目前比較通用的技術是在胞漿內唾液酸酶被釋放到培養基前對其進行基因滅活，如RNA 干擾技術。RNA 干擾技術是將與mRNA 對應的正義RNA 和反義RNA 組成的雙鏈RNA 導入細胞中，可使mRNA 發生特異性的降解，導致相應的基因沉默。Daniel I.C.Wang課題組［42］利用RNA干擾技術沉默唾液酸酶的活性，首先確定了一個降低唾液酸酶mRNA 和蛋白水平的21nt 雙鏈siRNA，并通過實時RT-PCR 和唾液酸酶活性測定比較每個siRNA 序列的效果，接下來將選定的siRNA 序列整合到CHO 細胞中進行生產，篩選出穩定的細胞系。理論上IFN-γ 的最大唾液酸含量為4 mol唾液酸/mol IFN-γ，他們的結果表明利用該種方法可以使唾液酸酶活性顯著降低，并將唾液酸酶含量維持在3.1 mol唾液酸/mol IFN-γ，進一步提高了糖蛋白的性能。Zhang 等［43］同樣利用RNA 干擾技術使用短干擾RNA（siRNA）和短發夾RNA（shRNA）處理CHO 細胞，以減少兩個唾液酸酶Neu1 和Neu3 的基因表達。通過敲低Neu3 的表達，發現CHO 細胞中唾液酸酶功能降低了98%，分泌的IFN-γ含量增加了33%。

1.2 單克隆抗體生產過程中“產品產量”

在滿足產品質量要求的條件下，獲得高產量的單克隆抗體同樣重要。目前，細胞系構建中常用的篩選體系為二氫葉酸還原酶（DHFR）和谷氨酰胺合成酶（GS）系統，基于此將帶有目的基因和篩選標記（DHFR、GS 基因等）的質粒轉染至宿主細胞后，使用相應的條件培養基篩選出重組細胞。為提高重組蛋白的表達水平，可以采用加壓甲氨蝶呤（MTX）、蛋氨酸亞氨基代砜（MSX）等多輪篩選的策略，通過增加目的基因的拷貝數，從而增加重組蛋白的產量［36］。

哺乳動物表達系統一般是使用MTX 擴增缺乏DHFR 的CHO 細胞，由于無法自身合成四氫葉酸，這種DHFR缺陷細胞需要甘氨酸、次黃嘌呤等的存在才能存活。因此可以將DHFR和目的基因同時轉染DHFR缺陷型細胞后，通過能夠從上清液中提取次黃嘌呤等物質篩選出成功轉染的細胞。MTX 是DHFR 的競爭性抑制劑，在MTX 濃度選擇壓力下DHFR 必須擴增出很多的拷貝數才能存活，從而得到抗MTX 的細胞系。這樣與DHFR 基因共同轉染的目的基因隨著DHFR的擴增而擴增，從而重組蛋白的產量逐漸增加。為了進一步提高重組蛋白的產量，還可以弱化選擇標記，在重組蛋白基因后添加弱化的選擇標記基因，這樣轉基因細胞需要更強的轉錄位點或轉錄和翻譯機制才能生存下來，從而大量生產重組蛋白。ARE 是一段可以破壞mRNA穩定的序列，而MODC PEST是在蛋白質上發現的提供不穩定性的降解信號的一個區域，二者協同作用可以降低細胞中目的基因的表達［44］。Daniel I.C.Wang 課題組將富含AU 的元件（ARE）和小鼠鳥氨酸脫羧酶（MODC PEST）區域應用于表達載體中的選擇標記，他們驗證了ARE、MODC PEST、ARE 與MODC PEST 兩個區域相結合，分別使IFN-γ 的產量提高到4.0 pg/（103cell·d）、15.8 pg/（103cell·d）和31.9 pg/（103cell·d），提高了1.7 倍、6.6 倍和13.3 倍。這些結果證實了將不穩定序列用于選擇標記可以提高重組蛋白的產量［45］。隨后，他們又將MTX 提高到50 nmol/L，與擴增前相比，轉染含有不穩定選擇標記載體的細胞中IFN-γ 的產量提高到了104.3 pg/（103cell·d）、167.2 pg/（103cell·d）和1051.7 pg/（103cell·d），證明了MTX 與不穩定序列結合使用以提高重組蛋白產量的可行性［45］。細胞培養過程中乳酸和氨的積累可能會抑制細胞生長，同時抑制特定產物的合成速率導致抗體產量降低。Chen等［46］通過基因操作（同源重組技術）將雜交瘤細胞中的乳酸脫氫酶基因（LDH-A）阻斷，之后篩選出LDH 缺陷型細胞（LDH-NE21），這種細胞的乳酸比合成速率比正常的細胞低50%。在細胞密度和細胞活力方面，改造后的雜交瘤細胞總密度可達5×106cells/mL，比親本細胞提高了30%。

研究人員發現哺乳動物細胞的分泌能力不足限制了重組蛋白產量的提高［47］，因此趙建兵等［48］試圖將與蛋白分泌相關的基因XBP1 過量表達來提高重組CHO 細胞中乙肝表面抗原（HBsAg）的分泌。首先他們添加了DMSO（促進二硫鍵的形成）使HBsAg 總量提高了9 倍，但大多數HBsAg 積累在胞內，胞外的分泌量僅提高了80%，說明這條分泌途徑已經處于飽和，胞內的HBsAg 不能分泌到胞外。在此基礎上他們過表達XBP1 基因，并不能促進HBsAg 的分泌。隨后他們添加了二硫蘇糖醇（DTT，形成內質網壓力）。在DTT 誘導下蛋白無法運輸出內質網，這時過表達XBP1 基因使HBsAg 的分泌能力增強，說明在選擇過表達蛋白分泌相關基因時需要了解到其相對應的分泌限制部位。

2 培養環境

2.1 生長培養基

在動物細胞培養中，最重要的因素之一是培養基的組分。動物細胞對其培養環境非常敏感，培養基中包含許多必需的營養物質，如葡萄糖、氨基酸、維生素、無機鹽和血清成分，才能維持生存和生長。細胞培養過程中培養環境會發生變化，因此設計一個最優的培養環境，并將其控制在一個最佳區域內，以最大限度地提高生產效率是至關重要的。這就要求將影響培養環境（營養物質濃度、副產物積累）和細胞生長的因素綜合到動物細胞培養基的設計中。

常規培養基的設計主要包含以下幾個因素：第一，通過在培養基中添加各種營養物質滿足細胞的生長需求；第二，動物細胞培養除了產生重組蛋白以外，還會產生氨和乳酸等有毒副產品，因此，在培養基設計中需要考慮影響氨和乳酸形成的因素，以減少這些有毒副產物的形成；第三，為了避免血清的不同批次以及不明組分對細胞培養的影響，最大限度地提高工藝的穩定性，需要開發一種完全化學合成培養基。

2.1.1 基于化學計量模型約束的培養基設計

營養物質不僅影響細胞的生長速度，而且營養物質水平降低到一定濃度可能會從化學計量上限制培養過程中所能獲得的最大細胞密度。因此，了解細胞對營養的需求可以對培養基進行定量設計，避免或減少營養的消耗和積累。基于此，Daniel I.C.Wang課題組［49］按照動物細胞生長的化學計量營養需求來制定培養基設計策略，將復雜的細胞新陳代謝歸為“黑匣子”，細胞生長被表述為單個參數，得到了一個簡化的化學計量模型。細胞生長需要葡萄糖、氨基酸、維生素、無機鹽和血清等成分，但由于細胞中無機鹽很少，達到化學計量比限制的可能性很小；而血清則是細胞生長所必需的，因此忽略這兩種成分。以葡萄糖、20 種氨基酸和10 種維生素作為反應物，細胞量（包括蛋白質、脂質、DNA、RNA等混合物）、產物和消耗的ATP作為反應的產物列出化學計量方程，其中葡萄糖作為唯一的能量來源，并且簡化谷氨酰胺的代謝，其他營養元素的化學計量系數根據細胞組成確定［50］（圖2）。這個模型可以用來設計補充培養基，傳統補料分批方式是將葡萄糖和谷氨酰胺等關鍵的營養元素維持在一定水平上，可能會消除這兩種營養元素的化學計量限制，但細胞的生長也會受到其他營養元素的化學計量限制。這個模型通過化學計量分析，根據細胞的生長需要確定補充培養基的組成，可以確保細胞最佳和穩定地生長。然而，氨和乳酸等有毒副產物的積累，使得細胞密度和產物濃度往往較低。乳酸的積累是由于大量葡萄糖的轉化，氨的積累則是谷氨酰胺大量消耗合成非必需氨基酸造成的，因此需要進一步探究合適的葡萄糖、谷氨酰胺和非必需氨基酸的濃度。隨后，他們在補料培養基的設計中采用了該模型，并考慮了葡萄糖、谷氨酰胺以及非必需氨基酸代謝的主要途徑對模型進行修正。在2 L 的生物反應器中使用優化的補充培養基自動補料，使得乳酸生成量（4.2 mmol/L）比生物反應器分批培養（34.5 mmol/L）降低7.2 倍，比T 瓶補料分批培養（30.9 mmol/L）降低6.3 倍，同時氨的生成也減少了。最重要的是，其產物的抗體濃度達到900 mg/L，分別比分批（52 mg/L）和補料分批（551 mg/L）培養提高了16倍和63%［51］。但是，他們得到的最大活細胞密度僅為7.5×106cells/mL，比總細胞密度（14.5×106cells/mL）低得多。為了探究限制最大活細胞密度的因素，他們對補充培養基的化學計量模型做了進一步優化。在之前的補料培養基的基礎上將胎牛血清、無機鹽和微量金屬（Fe2+，SeO32-，Li+，Zn2+，Cu2+，PO43-）周期性地加入到生物反應器中，不僅使得最大活細胞密度為1.7×107cells/mL，比以前的補料分批培養（6.3×106cells/mL）提高了1.7 倍，而且證實了最大活細胞密度的顯著提高是由于添加了血清和微量鹽來設計新的補料策略。乳酸比合成速率降至0.36 mmol/（107cell·h），比以前的補料分批培養低30%；氨比合成速率降至0.28 mmol/（107cell·h），比以前的補料分批培養低60%，最終的抗體效價也有所提高［52］。這個化學計量模型同樣可以用于CHO 細胞補料分批培養，添加化學計量平衡的補充培養基顯著增加了活細胞密度，并減少了有毒副產物的形成，如乳酸比合成速率從分批培養的0.15 mmol/（109cell·h）降低到補料分批培養的0.024 mmol/（109cell·h）。與分批培養相比，分批補料培養的IFN-γ產量提高從7.6 mg/L升高到30 mg/L，提高了3 倍，并且IFN-γ 糖基化水平也略有提高。蛋白質的糖基化受到葡萄糖濃度的影響，由于在補料分批培養過程中營養物質的濃度保持恒定，因此IFN-γ的糖基化在整個補料分批培養過程中保持穩定［53］。

圖2 基于化學計量模型約束的培養基設計［以葡萄糖、20種氨基酸和10種維生素作為反應物，細胞量（包括蛋白質、脂質、DNA、RNA等混合物）、產物和ATP作為反應的產物列出化學計量方程］Fig.2 Media design guided by stoichiometric and the constraint-based model(Taking glucose,20 amino acids and 10 vitamins as reactants,cell mass including the mixtures of protein,lipid,DNA,RNA,etc.,products and ATP as reaction products to develop stoichiometric equations)

2.1.2 代謝廢物的脫除

營養限制和細胞廢物積累是限制哺乳動物細胞培養中細胞生長和蛋白質生產的兩個主要因素，因此細胞廢物去除也是必不可少的一個步驟。

氨和乳酸是哺乳動物細胞培養中的主要抑制廢物。上述2.1.1 中已經描述過，在細胞株的構建方面，通過基因工程手段敲除或敲低乳酸和氨合成途徑中關鍵酶的基因，以降低兩種代謝廢物的產生；而在細胞培養過程中代謝廢物的積累不僅會影響細胞的生長，而且還會影響重組蛋白的性質，因此過程中代謝廢物的去除尤為重要。氨由谷氨酰胺分解和谷氨酰胺的非酶降解產生，在2～10 mmol/L 的氨濃度范圍內細胞生長受到50%的限制。乳酸主要由糖酵解產生，但也可由谷氨酰胺代謝產生，20～40 mmol/L 的乳酸會使細胞的生長減少50%［54］。動物細胞培養中代謝廢物的濃度取決于營養物質濃度、細胞類型和生物反應器的操作方式。為了減少細胞培養中的代謝廢物積累，Daniel I.C.Wang 課題組率先采用電滲析法，通過施加直流電場使乳酸根離子和銨根離子定向遷移進而去除培養基中的乳酸根和銨根離子。他們在一個帶有兩端隔室的矩形培養室中培養懸浮細胞，并使用磁性攪拌棒使細胞保持懸浮狀態，培養室兩端連接一個內鹽橋（保持培養基恒定狀態），內鹽橋的另一端插入培養基中，同時兩端培養基各連接一個外鹽橋（隔離有毒的產物，防止其進入培養室內），外鹽橋的另一端插入到含有0.5 mol/L NaCl/20 mmol/L NaHCO3的溶液中，將鉑片浸泡在外電極槽中以傳遞直流電場。連續增加直流電場使培養基中帶電荷的乳酸根離子和銨根離子通過鹽橋遷移至負極培養基中，同時從正極培養基遷移相同電荷的離子以維持培養室內電荷量的恒定，通過這種方法可以有效去除培養室內的乳酸根離子和銨根離子。在電流密度為50 A/m2的無細胞條件下，成功去除了10 mmol/L 氨和45 mmol/L 乳酸；在雜交瘤培養開始時，加入7.5～12.5 mmol/L的外源氨，外加直流電場能夠完全去除這些添加的物質。最后，將該電動技術應用于雜交瘤細胞的分批和谷氨酰胺補料分批培養中乳酸和氨的去除。在外加電流密度為50 A/m2時，去除細胞產生的氨，使細胞生長和抗體效價提高了約50%，分別達到3.9×106cells/mL 和204 mg/L，并且他們驗證了這種動電學技術對細胞功能、葡萄糖和谷氨酰胺的消耗沒有影響［55］。之后，他們又將培養基中所有的營養物質，包括氨基酸和維生素提高到正常濃度的4倍，同時應用直流電場去除細胞培養基中的氨和乳酸，進一步使得雜交瘤細胞的生長從3.7×106cells/mL 增加到9.1×106cells/mL，抗體產量從170 mg/L 增加到550 mg/L。直流電場配合高濃度營養物質顯著提高了細胞的增長和抗體的產生［56］。然而，由于細胞株的特異性以及培養環境的限制，這種動電學技術并沒有被廣泛使用。隨著灌流培養技術的進步與發展，可以通過不斷流入新鮮培養液并流出部分舊培養液減少代謝廢物的積累，成功地提高了細胞總體生長率和抗體效價［57］。Hiller 等［58］開發了一種由pH 控制葡萄糖輸送的泵，細胞對乳酸的消耗增加以及隨后培養基pH 的升高激活了泵，將更多葡萄糖輸送到培養基被細胞消耗產生乳酸，從而平衡pH 值，這種方法顯著提高了細胞增殖以及抗體產量。Lu等［59］基于在線活細胞傳感器以及葡萄糖在線監測計算出特定的比消耗速率，采用灌注的方式流入培養基使細胞的效價提高了6～9 g/L。

2.1.3 無血清培養基的開發

血清在動物細胞培養中可以提供多種營養成分，如激素和各種生長因子，促進細胞增殖。此外，它還含有幾種載體介質，如白蛋白和轉鐵蛋白，它們能將各種維生素、激素和親脂分子輸送到細胞內［60］。然而，血清的主要缺點是由于批次之間的差異而缺乏重復性，其非標準化和復雜的成分是培養基可變性的一個重要原因，這降低了生物過程的結果和穩定性，因此人們致力于開發一種血清替代品，可以添加從大豆、小麥和酵母中提取的不含動物成分的蛋白水解物來支持細胞生長和生產力［61］。

Gu 等［62］探究了動物組織水解物Primatone RL作為血清替代品在500 mL 轉瓶中分批培養對CHO細胞的影響，隨著Primatone RL濃度的升高，與不添加相比，活細胞密度從2×106cells/mL 升高到4×106cells/mL，但其濃度達到20 g/L 時可能會抑制細胞的生長。IFN-γ 的產量沒有顯著變化，然而唾液酸化程度與正常培養相比非常低，因此，在尋找血清替代物時，不僅要提高治療蛋白的產量，也要考慮到產品質量。Chen等［63］對奇努克鮭魚胚胎細胞（CHSE）進行低血清培養，使用新生牛血清（NCS，10%）代替5%的胎牛血清（FBS），發現細胞在兩種培養基血清中的生長速度相同但在NCS 中培養的細胞存在顆粒和氣泡，因此為了改善細胞狀況，逐步降低NCS 的濃度到2%，同時補充Primatone RL，得到的細胞密度達到1.4×106cells/mL，與添加5%FBS 的情況相同。之后將CHSE細胞以6.5×105cells/mL接種到5 L生物反應器中，22 d后最大活細胞密度達到5.9×106cells/mL。為了進一步去除培養基中的血清，張芳等［64］建立了一個適用于重組CHO-GS 細胞生長和外源蛋白表達的無谷氨酰胺無血清培養基（SFMB）。谷氨酰胺代謝會產生大量的氨進而抑制細胞生長，通過在CHO 細胞中引入谷氨酰胺合成酶基因（GS），可以不用額外添加谷氨酰胺，而是以谷氨酸和氨為底物合成谷氨酰胺來減少氨的生成。他們又采用DoE 統計方法優化了胰島素和轉鐵蛋白這兩種無血清培養基添加蛋白的最佳濃度，分別在5～6 mg/L 和5～10 mg/L，以及Hadamard 統計方法對乙醇胺和肌醇等6種變量進行優化分析，其中乙醇胺和肌醇對細胞生長有很好的促進作用，濃度分別為1.25 mg/L 和10 mg/L，但其余因素作用不明顯。該培養基用于在100 mL 轉瓶中培養CHO-GS細胞，最大活細胞密度達到1.5×106cells/mL、蛋白表達達到0.48 mg/L。同樣用谷氨酸代替谷氨酰胺的方法卻不適用于Vero細胞，可能是由于缺少氨基氮導致細胞產量下降。Huang等［65］在含有谷氨酸的培養基中額外添加NH4Cl提供氮源，使細胞生長顯著增加，其最大細胞密度僅次于添加谷氨酰胺的培養基。但NH4Cl本身有毒性，因此選用富含氨基氮的天冬酰胺作為替代，與谷氨酰胺相比，添加4 mmol/L的天冬酰胺使細胞密度達到2.1×106cells/mL。易小萍等［66］在之前優化的SFMB 的基礎上，通過反相高效液相色譜檢測CHO-GS 細胞培養96 h 前后氨基酸的濃度，優化了氨基酸添加量，補充了纈氨酸、蛋氨酸和蘇氨酸3種氨基酸；又分別篩選了不同濃度的胰島素、轉鐵蛋白等蛋白類激素，3 種激素其最佳濃度均為5 mg/L；并加入了0.15% 的Primatone RL 的蛋白水解物作為血清替代物，通過上述優化的無血清低蛋白培養基（SFMC）與之前的SFMB相比，在1.5 L生物反應器中的活細胞密度從2.9×106cells/mL提高到3.5×106cells/mL，并且重組CHO 細胞分泌的HBsAg 的表達量也從1.2 mg/L提高到1.5 mg/L［66］。

由于上述的培養基仍含有動物源成分，其成分尚不清楚，可能會造成潛在的污染。張大鵬等［67］在1.4 L 生物反應器中以16 mmol/L 的檸檬酸鐵、1 mg/L 的硫辛酸和0.5 g/L 的酵母水解物替代SFMC 中的轉鐵蛋白、胰島素和動物組織水解物，用經過優化后的培養基培養的活細胞密度可以達到9.3×106cells/mL，證實SFMC中的動物源、蛋白成分可以被一些微量金屬元素替代，其對細胞生長的作用可能高于蛋白質。

2.2 以過程分析技術（PAT）為核心的大規模細胞培養過程工藝優化與放大

為了滿足質量需求的同時獲得高產量的抗體，優化培養操作參數是至關重要的。物理參數（例如溫度、轉速）、化學參數（例如pH、滲透壓、溶氧和二氧化碳以及代謝物水平）和生物參數（例如細胞濃度、活力、細胞周期、線粒體活性以及NADH 和LDH 水平）都能顯著影響抗體的質量。2004 年，美國食品和藥物管理局（FDA）提出了過程分析技術（PAT），旨在進行先進的工藝監控以及更好地理解關鍵工藝參數對關鍵質量屬性的影響［68］。PAT 是一個通過實時測量原材料和過程本身的關鍵技術指標來實現過程設計、分析和控制制造的技術集成系統，目的是確保最終產品質量［69］。它控制的不僅僅是幾個化學和物理參數，而是通過細胞生理代謝與最終產品的相關性來判斷細胞的生理狀態，以便在需要時進行控制［70］。PAT技術引導制藥行業從嚴格的測試質量轉向靈活的設計質量方法（QbD）［71］，通過考慮生物、物理、化學等各種工藝參數對培養過程產生的影響，然后應用統計實驗設計（DoE）、多元數據分析等技術尋找關鍵工藝參數與產品質量屬性之間的關系，并應用傳感器對關鍵過程變量進行實時監控，從而保證產品質量的一致性［72］。Daniel I.C.Wang為引導PAT走向現實和可持續的工業應用做出了重大貢獻［73］。在20 世紀70 年代中期，Daniel I.C.Wang 等發起了一個關于計算機監測和控制的研究項目，在此之前人們認為除了對環境條件的簡單反饋控制外，計算機對生物過程的控制并沒有很大的作用。然而Daniel I.C.Wang 等［74］通過設定控制器在線控制單個反應器的變量（如酵母生物量或控制補料培養基添加），允許研究人員通過計算出的變量進行過程控制和優化。隨后他的注意力從酵母生物量生產轉移到生產單細胞蛋白（SCP），初次使用在線吸光度測量開發了用于從亞硫酸鹽廢液中連續生產SCP 的循環和進料速率的計算機控制。Daniel I.C.Wang在生物加工領域的巨大貢獻為現在和未來進行的PAT奠定了堅實的基礎。

如今用于監測生物過程的方法基本可分為兩大類：在線檢測（on-line）或近線檢測（at-line）。on-line 測量技術通常基于在線生物傳感器設備，例如直接放置在生物傳感器內的侵入式探頭（溫度、溶氧、壓力等）以及在生物過程附近使用的在線設備（尾氣分析儀、光譜儀等），其中信號能夠實時監控。而at-line在檢測之前需要進行人工取樣或是自動取樣，再到附近的化學儀器上進行檢驗，如高效液相色譜對目標分子、副產物或培養基成分的分析（圖3）。

圖3 動物細胞培養過程檢測技術［69］（通過在線檢測和離線檢測動物細胞培養過程中的變量，并根據數據對系統進行反饋控制；DO—溶解氧）Fig.3 Detection technology for animal cell culture processes[69](Through online and offline detection of variables in the process of animal cell culture,and feedback control of the system based on the data;DO—dissolved oxygen)

2.2.1 在線檢測（on-line）

（1）活細胞傳感儀

細胞濃度是哺乳動物細胞培養過程中最重要的過程變量。目前細胞濃度的測量可以分為在線和離線兩大類。在離線測量中，研究人員通常在給定體積中進行細胞計數來計算細胞密度，但這種方法費時費力，容易受到外界因素的影響，不能反映培養過程中活細胞密度的變化［75］。作為在線測量，目前主要有近紅外光譜法、熒光分析法、電容法等。其中電容法在測量時受細胞組成形式、氣泡、顆粒等因素的影響較小，已經成功應用于細胞培養過程中［70］。活細胞傳感儀通過在樣品上施加周期性交變電場來測量細胞懸液的電容，根據電容值估算細胞存活的濃度。基于PAT的優化工藝相比于傳統的方法更高效，Li 等［76］在植物細胞低溫保藏中采用活細胞傳感器快速定量凍存后細胞的活性與密度，其細胞活性與采用活細胞傳感儀測定的電容值具有很好的一致性，證實了活細胞傳感儀的可靠性。在疫苗生產方面，化磊召等［77］在昆蟲細胞-桿狀病毒載體表達系統（BEVS）上生產病毒樣顆粒亞單位疫苗（VLPs），結合PAT技術利用活細胞傳感器表征培養過程中的活細胞密度。由于細胞的代謝是細胞培養過程中重要的變量，而細胞線粒體的功能活性，細胞的葡萄糖比消耗速率和比氧消耗速率在測量時存在一定的滯后性，因此他們引入了活細胞電極的在線特征頻率f值進行分析，該值與比氧消耗速率成正相關，實現了細胞代謝活性狀態的在線監測。以f值的變化為依據確定最佳補料操作時間，可以使最高活細胞密度達到2.1×107cells/mL，相比于分批培養的最高活細胞密度1.2×107cells/mL提高了75%。

（2）光譜傳感器

光譜學和傳感器與適當的分析工具相結合，對于生物過程的監控尤為重要，目前使用的光譜方法主要有紫外-可見光、熒光光譜、紅外光譜（近紅外和中紅外）以及拉曼光譜。

長期以來，紅外光譜一直被用于固體、液體或氣體樣品中化合物的表征。對于細胞培養液，通常采用透射式測量。基于紅外的測量是無損的，可用于實時監控培養過程中的培養基成分的改變［78］。大多數基于紅外光譜的傳感器可以制作成原位探頭，如蒸汽滅菌的pH 或DO 探頭，并直接插入到生物反應器中，實時監控生物過程［38］。一些人已經報道了在CHO-K1培養過程中使用大量的數據對紅外光譜校準，可以很好地估計葡萄糖和乳酸濃度［79］。另外為了改進校準方法，并將校準模型擴展到更廣泛的工藝中去，M.Milligan 等使用不同的細胞系對不同的細胞代謝參數（細胞濃度、葡萄糖和乳酸濃度）進行修正［80］。

雖然近紅外（NIR）和中紅外（MIR）光譜采樣簡單快捷，但近紅外光譜產生的峰寬且重疊，使光譜的解釋變得困難。中紅外光譜的吸收較強，產生的光譜特征明顯，然而水的干擾會使液相系統中樣品的制備變得困難［81］。拉曼光譜是通過分子振動測量在不同頻率上非彈性散射的光量，具有很高的化學特異性，可以檢測出低于近紅外光譜所能檢測到的化學物質，而且拉曼光譜不需要樣品制備就可以很容易地應用于各種水體系，因此，拉曼光譜被認為是最有前途的復雜細胞培養系統在線分析的光譜方法［82］。拉曼數據與化學計量模型相結合，來解釋與測量的過程（Y變量）相關的光譜峰值（X變量），偏最小二乘法（PLS）建模經常被用作化學計量模型的選擇，因為它通常在與拉曼光譜集成的化學計量學軟件包中使用［83］。目前已經成功地使用原位拉曼探針測量葡萄糖、谷氨酰胺、谷氨酸、乳酸、氨以及細胞密度［81］，并在小規模生物反應器中使用拉曼光譜為細胞代謝的參數（如葡萄糖濃度）建立偏最小二乘校準模型，將其應用于CHO 細胞大規模補料培養［84］。Eyster 等［85］基于拉曼光譜的營養控制策略，為了在生產單克隆抗體（mAb）的補料分批培養CHO 細胞過程中實現乳酸和葡萄糖的控制，建立拉曼光譜PLS 模型。通過實時預測葡萄糖和乳酸濃度，將葡萄糖濃度控制在4 g/L，乳酸濃度在2 g/L 時顯著降低CHO 培養過程中的氨積累（68%），同時提高了mAb半乳糖化水平（50%）。

（3）尾氣質譜儀

細胞培養過程中，細胞代謝狀態可以通過檢測培養過程中尾氣中氧和二氧化碳濃度的變化進行表征；并且通過進一步的計算可以獲得細胞代謝的關鍵參數，如氧氣消耗速率（OUR）、二氧化碳生成速率（CER）和呼吸商（RQ）。為了監測尾氣的成分，一般使用磁質譜儀來測量氧氣，紅外傳感器來測量二氧化碳［86］。通過入口氣體和出口氣體之間含氧量的濃度差以及進出口氣體的流量可以準確地估計氧氣攝取率（OUR）。同樣，通過測量二氧化碳濃度的差異來估計二氧化碳釋放速率（CER）。耗氧量就是細胞代謝活動的一個關鍵指標，當細胞處于指數生長期，大部分的葡萄糖轉化為乳酸時，耗氧速率（OUR）隨著細胞濃度的增加而增加，由于大多數細胞培養過程都是以分批補料的培養方式進行的，補料的時間通常由細胞濃度決定，因此監測耗氧速率對控制補料時間非常有用［87］。

2.2.2 近線檢測（at-line）

at-line 測量的樣本需要從生物反應器中分離出去，并在接近反應器的地方進行分析，其中高效液相色譜對重組蛋白（如調節蛋白、疫苗、酶）的提純或分析等方面已經取得了很大的成功。

治療蛋白的生產過程較為復雜，主要是治療蛋白需要復雜的翻譯后修飾，如糖基化、磷酸化和二硫鍵的形成，而這些屬性往往會受到細胞培養過程的影響，比如培養基中營養水平的不穩定可能會導致產品質量不均一，因此治療性蛋白質的生產和提純需要得到監控。Daniel I.C.Wang 課題組［88］考慮了無菌采樣、分析中細胞處理、檢測范圍濃度、免疫球蛋白（IgG）的區分、時間等方面開發了一個自動監測雜交瘤細胞中IgG產生的系統。IgG 從雜交瘤細胞中分泌出來，在生長培養基中積累，因此取樣時不需要破壞細胞。將樣品從生物反應器中自動抽取到HPLC 系統的進樣閥中，直接進入蛋白親和柱上，立即對樣品進行分析。該檢測方法采用了蛋白親和色譜法，具有很高的選擇性，而且檢測只需要3 min，實現了快速檢測的目標。糖基化通常是治療蛋白性質的關鍵決定因素，單一糖蛋白的不同糖型可以表現出不同的生物學特性，而且糖型異質性對培養環境敏感，因此糖基化模式的表征和檢測至關重要。將重組免疫球蛋白經過提純和純化后，用LC/MS 進行分析，在線還原二硫鍵，可以快速確定糖型［89］。Daniel I.C.Wang 課題組建立了一種快速評價CHO來源的重組人IFN-γ兩個潛在N-連接糖基化位點特異性的分析系統，用免疫親和色譜從培養上清液中純化目的蛋白，通過固定化胰蛋白酶柱快速進行在線蛋白水解，反相色譜分離代表潛在糖基化位點的兩個糖肽。通過基質輔助激光解吸電離/時間離散質譜（MALDI/TOF）離線分析，以確定它們的寡糖結構。這種方法允許在2 h 內，僅使用0.5 μg（25 pmol）的產品來評估糖蛋白的微異質性［90］。糖蛋白的生物學功能同樣高度依賴唾液酸含量，雖然之前的方法在MALDI 樣品板上用唾液酸酶處理糖肽并用MALDI/TOF 定量估計去唾液酸聚糖的結構，但是由于唾液酸的糖苷鍵不穩定，可能破裂，這樣就會對分析產生誤差。Daniel I.C.Wang課題組［91］在此基礎上進一步的優化，基于唾液酸分離特定位點的糖肽庫，獲得CHO 來源的IFN-γ 的位點和支鏈特異性唾液酸化的定量，通過這個系統對唾液酸含量的定量分析，發現細胞內唾液酸化不完全和細胞裂解過程決定了最終產品的唾液酸含量。

2.2.3 過程數據統計與分析

細胞培養過程是重組蛋白生產的關鍵環節之一［92］，因此，在細胞培養過程中實時監測產品屬性尤為重要。在線監測技術會產生大量的過程數據，一個大數據分析系統對于PAT的建立是非常重要的。因此，通過建立數學模型并使用模型進行數據分析后再對過程加以改進，可以進一步揭示細胞培養過程的規律，預測生物過程的發展并進行相應的調控，從而保證產品的質量和一致性。

（1）實驗設計（design of experiments，DoE）

DoE 描述的是一種用于系統地篩選和評估關鍵工藝參數對過程響應影響的統計方法，當處理大量具有非線性的因素時，DoE 是一個非常實用的工具［72］。在雞胚胎成纖維細胞（DF-1）生產禽流感疫苗過程中，Lin 等［93］為了提高感染傳染性法氏囊病病毒（IBDV）的DF-1 細胞的增殖能力，通過代謝組學方法在GC/MS 和LC/MS 平臺上分析DF-1 細胞在DMEM/F12（1∶1）和DMEM 兩種培養基中細胞內代謝產物，得到的數據可以反映細胞培養過程中代謝途徑的變化。他們使用這種方法鑒定出20 多種代謝物，推測氨基酸代謝和脂質代謝是影響細胞生長的主要因素，并通過DoE 方法優化了培養基的設計，最終促進了DF-1 細胞的增殖。之后，他們又采用同樣的方法探究了感染IBDV 的DF-1 細胞與未感染對照組的差異以及對DF-1 細胞進行時序性分析，IBDV 通過中樞碳代謝、核苷代謝、脂質代謝等多種代謝途徑影響DF-1 細胞的代謝。而通過時序性分析發現在長期培養過程中細胞生長的代謝物差異，確定是氨基酸、核苷和脂質相關代謝途徑的改變。通過DoE 優化氨基酸和核苷的相關成分并給予補充，使得IBDV繁殖力大大增強，其滴度提高了20.7倍［94］。

（2）代謝通量與途徑分析

代謝通量分析是一種良好的工具，分析中心碳代謝的碳通量來確定關鍵營養需求和控制生化反應的速率。代謝物質平衡模型已經可以快速有效確定代謝流和代謝流分布模式，可以進一步在連續培養系統這種更可控的環境下對其進行通量分析。

代謝通量分析模型可以用于分析細胞培養過程中，細胞營養需求和細胞生長、產物、能量之間的化學計量關系。Daniel I.C.Wang 課題組建立了一個動物細胞培養中營養平衡的化學計量模型，包含了葡萄糖和氨基酸在內的營養需求，并利用該模型設計了一種補料培養基，可以很好地預測細胞生長對營養物質的化學計量需要。但這個模型忽略了細胞生長的復雜的代謝網絡，因此在這個基礎上，他們利用之前所做的分批培養和補料分批培養的數據建立了化學計量平衡模型，計算ATP的總產量進行能量代謝相關的研究。大多數細胞代謝途徑涉及ATP 和與ATP 相關的輔助因子，如NADH、FADH 和GTP。NADH 和FADH 的氧化磷酸化產生了細胞生長所需的大量ATP，NADH產生的ATP 由NADH 乘以其P/O 計算，FADH 同樣由FADH 乘以其P/O 計算。通過計算不同營養物質對ATP 產量的貢獻，發現大部分ATP（60%～76%）是由葡萄糖代謝產生的。約30%的ATP 來自谷氨酰胺，11%來自其他必需氨基酸；糖酵解途徑在分批培養中（41%）比在補料分批培養中（27%）產生更多的ATP。TCA 循環提供了ATP 總產量的51%～68%，表明與生長無關的ATP 需求可能包含生物合成以外的需要，同時證明了能量代謝分析對細胞生長的重要性［95］。

能量代謝分析模型通過分析細胞能量與細胞生長之間的關系，鑒定出優良的細胞群體。Daniel I.C.Wang課題組［96］在對雜交瘤細胞培養過程中代謝通量進行分析發現，細胞凋亡的開始與細胞的能量之間有很強的相關性，其中線粒體對培養環境中細胞凋亡的啟動起著重要作用。同時，他們發現一個細胞群體可以包含不同的亞群，通過羅丹明123（Rh123）染色和熒光激活細胞分選將雜交瘤細胞分離成不同線粒體膜電位（MMP）的亞群，線粒體膜電位的高低通過Rh123染色后的熒光值來衡量，低亞群的熒光值與染色的野生型未分選細胞相似，而高亞群的熒光值則都高于未分選的野生型。將它們置于兩種凋亡誘導劑魚藤酮和星形孢菌素作用下，發現了不同亞群對凋亡的抵抗力各不相同，高線粒體膜電位的細胞對凋亡有更強的抵抗力，即動物細胞群體在線粒體生理學方面存在異質性。后續可以利用這一特點將線粒體膜電位的高低作為分選標準，鑒定出性能更好的細胞。因此，他們又進行進一步的驗證，利用線粒體膜電位將雜交瘤細胞分成不同的亞群后，對這些細胞進行補料分批培養，發現與接種低MMP 亞群的補料批次相比，接種高MMP 亞群的補料批次獲得了更高的活細胞濃度和存活率，并能維持較長時間［97］。這些結果強調了雜交瘤細胞培養的異質性，并表明線粒體生理學是決定培養性能的關鍵參數。

代謝途徑分析可以用于優化培養基的設計。前文中Zhang等優化了重組CHO-GS細胞的無血清培養基，由于添加了GS基因，使谷氨酸和NH4+合成谷氨酰胺從而減少了氨的生成，他們又從胞內水平考察了CHO-GS細胞在無血清培養基中代謝途徑的變化。在無血清無谷氨酰胺的培養基中氨濃度為1.42 mmol/L時，細胞最高密度達到1.5×106cells/mL，氨濃度增加到12.65 mmol/L 時，細胞密度仍可以達到8.9×105cells/mL；但在含有谷氨酰胺培養基中，高濃度的氨濃度就會抑制細胞生長。隨著氨濃度的增加，糖代謝途徑中的己糖激酶、丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶酶活增加，表明氨可以促進細胞的糖酵解過程。而在谷氨酰胺代謝途徑中，高濃度的氨激活了谷丙轉氨酶的活性，促進了α-酮戊二酸生成谷氨酸；另一方面，細胞內的異檸檬酸脫氫酶活性也有所增加［98］，促進了α-酮戊二酸的生成。谷氨酸與氨反應生成谷氨酰胺，從而滿足了細胞的生長需求［99］。

2.3 生物反應器中的流場環境

2.3.1 微載體技術的應用

微載體培養技術是一種動物細胞大規模培養技術。利用固體小顆粒為載體，貼壁細胞在載體表面附著，通過連續攪拌懸浮于培養液中進行生長繁殖［100］。與懸浮細胞相比，貼壁細胞對附著在固體基質上的要求大大增加了培養這些細胞類型的成本和難度。一些市售的固體基質比如DEAESephadex A-50有明顯的毒性，細胞接種量損失大，以及懸浮培養時的攪拌導致培養細胞生長不良。因此，Daniel I.C.Wang課題組［101］開發了一種帶正電荷的葡聚糖微球作為替代微載體，它不需要培養添加劑，用標準細胞培養液培養雞胚成纖維細胞或正常二倍體人成纖維細胞，其飽和細胞濃度可達4×106cells/mL 以上，使用這種微載體可以顯著提高生長效率。Smiley 等［102］在微載體上培養重組中國倉鼠卵巢（rCHO）細胞以生產IFN-γ，同時考察了血清濃度、基礎培養基和pH 等環境參數對IFN-γ產量的影響，IFN-γ的生產在整個1個月期間保持不變，證實了使用微載體培養物通過哺乳動物細胞長期生產重組產物是技術上可實現的。

2.3.2 微載體濃度對細胞生長的影響

哺乳動物細胞在微載體上的培養受到微載體上細胞分布的影響。對于在微載體上培養哺乳動物細胞，啟動培養時需要滿足一定的接種量。隨著接種量的降低，生長速率也會降低［103］。Daniel I.C.Wang課題組［104］提出了一個臨界細胞數模型來解釋接種量需求的機理。在該模型中，在給定的細胞濃度下，細胞的平均數目和單位體積的微載體數成反比，提供相同生長表面積所需要的微載體的數量取決于微載體的直徑，因此可以通過選擇不同的微載體直徑來改善細胞在微載體上的分布。接種在微載體上的細胞需要達到臨界的細胞數量才能正常生長，如果不能獲得足夠的細胞，將阻礙細胞生長。他們假設每一個微載體需要一個臨界細胞數才能生長，如果接種后微載體上的初始細胞數大于臨界細胞數，細胞就會生長，直到融合；另一方面，如果初始細胞數不大于臨界細胞數，細胞將無法繁殖。通過這個模型確定每個微載體的臨界細胞數，如FS-4 細胞的臨界細胞數為每微載體6個細胞。之后他們采用一種更好的培養基支持細胞的低密度生長以減少臨界數量。采用改進的培養基以及使用選定直徑的微載體，FS-4 細胞的增殖提高了15～16 倍［104］。譚文松等［105］在低血清貼壁培養基和DMEM+10%FBS 兩種培養基條件下，考察細胞接種密度對細胞生長的影響。在1～7 g/L微載體用量范圍內接種相同密度的ST 細胞，發現隨著微載體濃度的上升，最大細胞密度不升反降。主要是由于每個微載體接種細胞數目過少，培養基不能很好地支持ST 細胞在微載體表面良好的增殖和延伸。

2.3.3 流體剪切對細胞生長的影響

微載體上的動物細胞特別容易受到過度攪拌的損傷，雖然流體剪切力可能是有害的，但適度的流體剪切是可取的，因為它可以使細胞通透性增加和細胞胞外蛋白分泌增加。為了最大限度地促進細胞生長，實現充分的傳質，同時減少或消除流體剪切的有害影響，第一個目標是識別和模擬一些微載體培養中的動力學效應，第二個目標是將這些效應與流體動力學進行定量關聯。

一般來說，如果細胞的生長受到任何類型的流體動力學機制的影響，那么影響它生長的原因可能是一個基本流體動力學變量（如攪拌功率、流體黏度或微載體濃度）的改變。微載體濃度影響生物反應器的流體環境，在溫和攪拌的情況下，細胞的生長不受微載體濃度或液體黏度的增加的影響，但在較高的攪拌水平下，微載體濃度對于細胞生長的影響很大。比如FS-4 細胞，在較低的接種濃度下生長速度最大，而接種濃度過高可能會導致細胞生長速率降低［106］。這種生長的減少主要是由兩個原因導致：①流體剪切力過高導致的細胞死亡；②被流體剪切力殺死的細胞從微載體上被移除，這種移除是不可逆的，因為貼壁細胞懸浮培養不能存活，不能附著生長［107］。因此，過度攪拌主要導致了細胞死亡和細胞從微載體表面不可逆的移除。Daniel I.C.Wang 課題組認為較高的攪拌水平下，流體動力損傷既發生在涉及微載體-微載體相互作用中，它們彼此間的碰撞可能會發生細胞損傷，也發生在微載體-液體相互作用中，微載體上的細胞容易受到小而強烈的渦流的損傷，當湍流產生的渦流小于90～130 μm，會對細胞產生明顯的損傷［108］。因此，他們進行了黏度影響的實驗，通過在不同攪拌速度下添加右旋糖酐作為增稠劑，發現在大多數高攪拌條件下的微載體生物反應器中，黏度的增加會減少湍流引起的細胞死亡。黏度增加3倍通常會導致流體動力細胞死亡率降低10 倍以上，黏度的適度增加使得湍流中細胞死亡的顯著減少［109］。譚文松等通過調整轉瓶中轉速改變渦流尺度的大小，發現當生物反應器中湍流產生的渦流尺度與細胞大小相當時，加入Pluronic F68 和血清不能對細胞起到保護作用，考慮到是攪拌產生的大量氣泡造成了細胞損傷，他們采用鼓泡柱消除攪拌剪切的影響，并加入血清以及1 g/L 的Pluronic F68。通過這種方法改變了細胞在氣泡表面的吸附特性，降低了細胞損傷［110］。

在動物細胞大規模培養中，生物反應器的操作參數改變會影響細胞的代謝過程。攪拌不僅可以使反應器內部流體充分混合，增加反應器內物質與能量交換，攪拌轉速的改變也會導致剪切力的改變，從而影響細胞的生長與代謝。因此，通過對哺乳動物細胞大規模培養的流體動力學的了解，可以實現動物細胞培養放大工藝的開發以及生物反應器的設計和優化。

3 未來大規模細胞培養平臺：從“多尺度”到“智能化”

細胞大規模生物反應過程中，細胞生命代謝過程是一個復雜的系統過程，盡管保持完全一致的操作條件，但最后的結果差異較大。其原因就是由于細胞代謝特性沒有完全掌控，因此在工業生物制造過程中，需要對細胞生理代謝過程進行在線監測。生物制造過程中形成了大量的數據，包括在線過程數據、代謝組學數據、轉錄組學數據和蛋白質組學數據等。這些數據的大量積累為探究細胞的生理調控規律、實現生物過程的智能化提供了大數據的基礎［111］。

3.1 基于多尺度參數相關分析的細胞培養過程優化與放大

在過去的20 年中，生物制造行業在過程控制方面有了很大的提高。主要在攪拌式生物反應器上采用計算機的在線控制，配置了pH 電極、溶氧電極、尾氣質譜儀、活細胞傳感儀等在線傳感器，實現活細胞量、葡萄糖、乳酸、氨和谷氨酰胺等胞外代謝物的濃度等多種參數的采集。隨著PAT 過程控制技術日益成熟，將在線傳感器與細胞生理狀態的系統模型相結合，并引入組學技術，通過建立過程數據處理方法，對數據進行分類和深入分析，可以實現數據驅動下引導過程控制并保證產品質量。張嗣良等［112］經過多年研究，提出了一套基于基因、細胞和反應器多尺度相關參數分析的理論。將生物反應器中復雜的生物過程分為基因尺度、細胞尺度與生物反應器尺度，不同尺度之間存在信息流、物質流和能量流。通過研究它們之間的非線性關系，以及對整個系統的影響，從而找出解決過程優化放大的方法。

參數相關分析是指生物過程中的環境參數和生理參數、狀態參數和過程參數、直接參數和間接參數、在線參數和離線參數之間的耦合相關性［113］。實施多尺度參數相關分析包括幾個重要步驟：

①進行系統簡化，通過數據采集系統采集培養過程中的變量，之后進行數據驅動的研究，分析各個參數之間的關系并跨尺度觀察［114］。這些步驟是實現細胞代謝分析與以控制為核心的多尺度研究方法。由此可見，進行生物過程的在線監測并獲得大量在線參數是實現多尺度相關分析的重要步驟。然而，這些參數表現出離散、復雜、非線性等特征，主要是由于復雜的細胞代謝以及對環境的響應綜合作用的結果。一些細微的差異伴隨著生物過程的進行可能會在結果中產生巨大差異，表現出系統的不穩定性。為此必須將從宏觀生理代謝（不同尺度參數之間的相關性）轉向微觀生理代謝（基因組、轉錄組、蛋白組、代謝組），才能更好地進行生物過程的優化與放大。化磊召等人基于昆蟲細胞-桿狀病毒載體表達系統，通過對昆蟲Sf9 細胞的分批和補料懸浮培養，發現細胞代謝活性和活細胞傳感器的在線特征頻率（fc）之間存在相關性、培養體系S 期細胞比例與比電容增長率（μ）存在相關性，最高疫苗產量與在線檢測參數電容之間存在相關性。相比于批培養，基于PAT 的優化工藝使疫苗單位體積產量提高76%，生產周期縮短了24 h，大大縮短了工藝優化周期，保證了生產工藝的可控性和重復性［77］。

②通過細胞生理代謝特性與生物反應器流場特性相關聯進一步實現生物過程的優化與放大。生物過程的放大在于從實驗室規模的生物反應器過渡到大規模的生物反應器中，并再現細胞最優的生理狀態。因此，取得小規模反應器中關鍵參數的變化可以加強過程放大的成功率。在這個過程中需要對生物反應器的流場特性進行研究。龔迪等［115］首先在5 L 反應器中對犬腎上皮細胞系（MDCK）進行培養，通過計算細胞的比生長速率、葡萄糖比消耗速率、乳酸比合成速率和氨比合成速率確定細胞的生理代謝參數。隨后將其放大至25 L 反應器，使活細胞密度從6×105cells/mL 增長到3.55×106cells/mL，并且保持細胞生理代謝參數一致，成功實現了生物過程的放大。

3.2 大規模細胞培養過程智能制造

我國提出“中國制造2025”計劃，以應對新一輪科技革命和產業變革，圍繞創新驅動、智能轉型、綠色發展等理念，拓展“智能+”的重大戰略任務和重大政策舉措［116］。生物制造也走向自動化、信息化和智能化發展，利用計算機網絡人工智能技術結合智能制造裝備，構建高效節能、質量可靠的智慧工廠，實現智能生產。

在動物細胞大規模培養中，活細胞的生物反應過程具有復雜的生理代謝特性，因此對生物反應器中細胞培養過程實行多尺度相關參數分析至關重要。然而，該理論在大數據時代的應用仍存在一些局限性。在實際生產過程中，對于細胞多尺度參數分析時產生的海量數據以及反應過程中獲得各種傳感器數據處理起來極為困難，在這些數據中尋找出關鍵的因果關系，并提出相應的過程優化策略，對于人工處理來說是一項費時、費力的工作。因此，需要將機器學習應用于生物過程大數據的分析與決策［113］。Li 等通過四元隔膜泵、計算機、可編程邏輯控制器（PLC），耦聯在線傳感器，對疫苗產品純化色譜中pH 值和電導率實現自動化精準控制［117］。Esmonde 等利用拉曼光譜耦聯非線性模型預測控制器（NMPC），對CHO細胞培養過程中葡萄糖濃度等營養物質參數進行實時監控與預測［83］，未來可以從實驗研究向GMP生產應用上發展。

面對動物細胞系的規模化、多樣化培養，可以通過開發各種新型動物細胞反應器，制定個性化、并行化的培養策略，實現培養過程的智能化控制。生物反應器耦聯在線傳感器，尤其是光譜傳感器，如在線拉曼分析儀、在線中紅外分析儀、在線熒光分析儀等正在逐漸被應用于工業過程分析［118］。在實施多尺度生物過程優化中通過在線拉曼光譜、在線熒光光譜以及在線中紅外光譜會產生大量數據，尤其是在線數據中含有大量的過程相關信息，未來可以利用文獻數據、組學數據形成知識圖譜，并通過機器深度學習，指導細胞培養過程（圖4）。2018 年“全自動干細胞誘導培養設備”研制成功，首次實現了以機器學習以及人工智能算法為判定的細胞自動化誘導，建立了從細胞培養、顯微在線觀測、移液換液、算法識別、克隆挑取以及設備控制的裝備技術，實現了誘導多功能干細胞自動化誘導培養、擴增、成像、下游分化等功能，在降低干細胞生產成本的同時提高了細胞制備質量，為大規模生物制品的生產奠定了基礎［17］。

圖4 基于大數據的工業生物過程智能制造系統（通過智能感知系統挖掘大數據，實現對生物培養過程的智能控制，同時利用文獻數據、組學數據形成知識圖譜并通過機器深度學習，進而指導智能感知系統，實現真正的智能生物制造）Fig.4 Intelligent manufacturing systems developed based on big data for industrial processes(Mining big data through the intelligent perception system to realize the intelligent control of the biological training process.On the other hand,using literature and omics data to form a knowledge map for machine deep learning,the intelligent perception system can guide to realize the real intelligent biological manufacturing)

大數據時代已經到來，基于大數據的智能生物制造是順應生物制造行業發展的趨勢所向，隨著生物傳感技術的不斷發展，可以獲得越來越多的生物過程數據。通過人工智能的處理從數據中挖掘出不同尺度信息流之間的關系，從而實現真正的智能生物制造。

4 總結與展望

如今，動物大規模培養技術已經達到相當的規模和技術水平。本文詳細綜述了哺乳動物細胞在細胞株的構建、培養基設計與無血清培養基的開發、基于PAT培養工藝的優化與放大等方面的研究進展。而為了更好地滿足生物制藥產業發展的需求，動物細胞培養需要向大規模、自動化、低成本、高目的產物質量與產量發展。因此，哺乳動物細胞大規模培養仍有許多不足之處需要改進和完善。

隨著基因組學的最新進展和基因編輯工具的發展，可以構建支持高密度生長，分泌大量治療性蛋白的優良細胞系。細胞系含有放大的目的基因或選擇性標記，能夠保持對特定治療性蛋白的表達。其次，動物細胞培養基的設計已經得到了越來越深入的研究，尤其是無血清培養基的開發。通過對細胞生長與代謝等方面機理的深入，以及代謝組學和蛋白質組學技術的成熟，可以為細胞無血清培養基的設計提供便捷的方法，實現低成本和更廣泛的應用。最后，哺乳動物細胞培養過程中最重要的是通過連續的生產以提高產品產量和質量，在這個過程中系統監測生物過程中的實際需求，特別是確定最關鍵的質量參數至關重要。未來開發非侵入性的、實時監測的分析技術以及適用于不同生產系統中標準工藝的在線傳感設備，促進PAT技術與連續制造過程的同步成熟，可以更好地符合生物制藥過程的發展和需求。基于PAT的細胞培養過程中產生海量的在線數據，通過大數據實時計算系統，運用復雜的機器學習、數據挖掘、智能推薦等在計算機和細胞之間實時數據交互，掀起一場“智能生物制造”的生物技術革命。順應大數據時代發展的需求，占領科技競爭高峰，努力提升我國工業生物過程自動化、數字化和智能化水平。