響應面法優化酸模根多糖的提取方式研究

信陽農林學院 劉俊

酸模（Rumex acetosa L.）別名葉子羊蹄、活血蓮、田雞腳、酸不溜等[1]，是可供藥食兩用的蓼科酸模，屬多年生草本植物[2]，主要產于我國西南部、甘肅南部、青海西南部等地區。酸模根、葉可入藥[3]，具有抗炎、抗氧化、抗癌等功效[4-7]。有研究發現，其含有白藜蘆醇、白藜蘆醇苷、酸模素、大黃酚、大黃素等多種活性成分[8-9]。植物多糖是普遍存在于植物細胞壁及細胞內的一種成分[10]。有研究報道，截至2013年就已有超過三百種多糖類化合物從天然產物中分離出來，人們逐漸發現不同來源的多糖具有廣泛而又復雜的生物學活性，已引起了醫藥界的高度重視，并成為當今生命科學研究的重點[9]。本試驗采用水浸提法提取酸模根中的多糖，考察微波時間、液料比、提取溫度三個因素對酸模根中粗多糖提取率的影響。在單因素試驗的基礎上進行響應面法優化試驗，以提取率為指標研究酸模根多糖的最佳提取工藝，為開發利用酸模資源提供理論參考。

一、材料與方法

（一）試驗材料

酸模根，自行采摘，產地為河南信陽，苯酚（分析純,天津市大茂化學試劑廠），硫酸（分析純,洛陽昊華化學試劑有限公司），葡萄糖標準品（110833-201707,中國食品藥品檢定研究院）

（二）儀器與設備

SF-170型高速粉碎機（上海中藥機械廠），電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司），電熱恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司），80-2型電動離心機（江蘇恒豐儀器廠），UV-1600型紫外可見光分光光度計（北京瑞利分析儀器公司），微波萃取設備（廣州萬程微波設備有限公司）。

（三）試驗方法

（1）多糖提取工藝流程酸模干燥根→粉碎，過篩→石油醚浸泡，去除色素→過濾，干燥→按一定料液比加蒸餾水→微波提取→抽濾(布氏漏斗)→定容→多糖提取量的測定。（2）主要工藝操作：①原料處理。將預先清理、切段處理的酸模根放入70℃鼓風干燥箱中烘干，然后使用粉碎機將其粉碎，過60目篩，裝入封口袋中，置于干燥器中保存備用。②葡萄糖標準曲線的制作。采用苯酚——硫酸法測定多糖含量。分別準確移取葡萄糖標準溶液0、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL于6支干凈的10mL容量瓶中，各加入蒸餾水補足至2mL，再向試管中分別加入1mL的6%苯酚溶液，搖勻后，快速加入5mL濃硫酸至6支試管中，震蕩充分，待溶液冷卻后迅速在490nm處測定吸光度。以吸光度A為縱坐標，以葡萄糖含量（mg/mL）為橫坐標繪制標準曲線，擬合得到A=0.173×C+1.5221，R2=0.9939，線性濃度范圍為0.3～0.7mg/mL。③樣品溶液的制備。在確定料液比下，以蒸餾水作為提取溶劑，在設置好的溫度、微波強度下提取一定時間，趁熱抽濾，再移至100mL容量瓶中用蒸餾水定容，制成樣品溶液。④多糖提取率的測定。移取2mL待測提取液于10mL容量瓶中，再向試管中分別加入1mL6%苯酚溶液，搖勻后，快速加入5mL濃硫酸至6支試管中，震蕩充分，待溶液冷卻后迅速在490nm處測定吸光度。樣品溶液中多糖含量的計算公式為（式中，W為酸模提取物中多糖的含量/%，C0為提取液被稀釋后的濃度/mg/mL，V為提取液稀釋后的體積/mL，m為被提取的酸模的質量/g）。（3）單因素試驗多糖類化合物易溶于溶劑水中，本試驗采用響應面法優化酸模根多糖，分別考察了微波時間、液料比、提取溫度三個因素對多糖提取率的影響。

（四）試驗設計方案

（1）單因素試驗結果與試驗水平的確定。本試驗固定微波強度，以蒸餾水為溶劑，分別考察了微波時間（10、20、30、40、50min）、提取溫度（50、60、70、80、90℃）、液料比（15:1、20:1、25:1、30:1、35:1mL/g）三個因素對酸模黃酮提取率的影響。最終確定三因素三水平為提取時間（20、30、40min）、提取溫度（60、70、80℃）、液料比（20:1、25:1、30:1mL/g）。（2）酸模根多糖提取的響應面試驗在“1.4.1單因素試驗結果與試驗水平的確定”的基礎上，以多糖提取率為響應值，運用Design-Expert10.0軟件進行Box-Behnken中心組合試驗設計，采用三因素三水平優化酸模根中多糖的提取工藝。

二、試驗結果與數據分析

（1）試驗結果與回歸方程。利用Design-Expert10.0軟件設計試驗優化酸模多糖的提取條件，由數據分析得到多糖提取率自變量與相關變量之間關系的擬合方程為：提取率(%)=36.79+0.17A-0.1B-0.41C-1.1AB-0.23AC-0.92A2-3B2-2.71C2。如表1所示。（2）回歸模型的建立與分析。從表2中擬合優度與方差的分析結果可知，該模型p值小于0.0001，表明具有極顯著性，失擬項p值大于0.05，表明該方程對試驗擬合度高、誤差小。相關系數R2為0.9795，表明酸模多糖提取率的實測值與預測值之間非常接近，模型預測性好。此外，系數變異值CV(1.58%)較低，表明實驗的精確度較高、重復性好。對酸模多糖提取的影響極顯著的因素有一次項B和二次項A2、B2、C2及交互項AB。比較F值的大小，可得出影響酸模多糖提取效果的因素順序為：提取溫度(B)＞液料比(C)＞微波時間(A)。（3）工藝條件的優化及驗證試驗。通過Design-Expert10.0軟件進行優化，最終得到的優化方案為：提取時間為36.88min，提取溫度為65.40℃，液料比為29.12:1mL/g。在此條件下，模型預測多糖提取率為34.37%，為了便于實際操作，將酸模根多糖的最佳提取工藝參數修正為：時間為37min，溫度為65℃，液料比為29:1mL/g。采取此方案進行驗證，三組平行試驗的提取率依次為34.48%、33.66%、32.87%，平均值為33.67%，與預測值僅相差0.69%。由此可見，采用DesignExpert10.0軟件優化微波輔助提取酸模根中多糖的工藝參數準確可靠，具有一定實用價值。

表1 響應面試驗方案及結果

表2 響應面ANOVA分析結果

三、結論

本研究首先考察了三個因素分別對酸模根中多糖提取率的影響，然后在單因素試驗的基礎上，再采用響應面法優選酸模根多糖提取工藝，運用Box-Behnken中心組合試驗設計優化方案，并充分考慮實際操作的可行性，最終確定提取酸模根多糖的最佳工藝為：時間為37min，溫度為65℃，液料比為29:1mL/g。在此基礎上進行驗證試驗，獲得的酸模根中粗多糖實測提取率為5.09%，與預測值5.12%高度吻合，說明該模型能較好地預測各因素與酸模根中粗多糖提取率之間的關系。