魯東南地區317681 例新生兒葡萄糖- 6- 磷酸脫氫酶缺乏癥篩查及基因型調查

尹文東,夏飛燕

臨沂市婦幼保健院新生兒疾病篩查中心,山東臨沂 276000

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PD）缺乏癥是一種X 染色體不完全顯性遺傳性紅細胞缺陷病,與血管內溶血有關[1]。 其發病機制主要是G6PD 基因突變導致谷胱甘肽還原酶的輔酶生成減少,還原型谷胱甘肽生成減少而不能抵抗氧化損傷,引起溶血性貧血[2]。 目前,全球已鑒定出200多種不同的G6PD 基因型分子異常[3]，我國人群突變類型有 35 余種,且多分布在外顯子區[4]。 選取 2016 年5 月—2017 年12 月在魯東南地區出生的新生兒317 681 例,統計G6PD 缺乏癥患病率,檢測基因突變類型,為該地區最佳的G6PD 缺乏癥篩查及確診方案提供依據。 通過查閱相關文獻,山東省內僅有青島地區有相關報道[5]。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取在魯東南地區出生的新生兒共317 681 例,男性171 882 例,女性145 799 例。獲得新生兒監護人同意后,進行足底血濾紙干血片的采集。 采集過程按照《新生兒疾病篩查技術規范（2010 版）》進行,血片自然干燥后,最遲不超過5 d,冷鏈運輸至新生兒篩查中心實驗室,2～8℃冰箱保存。

1.2 G6PD 酶活性檢測

應用Wallac Oy 公司生產的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶測定試劑盒（熒光分析法）及PE 公司生產的全自動免疫熒光分析儀進行G6PD 酶活性篩查。所有操作按照說明書進行。以G6PD 檢測活性＜2.6 U/gHb 判定為陽性標本。

1.3 基因突變檢測

1.3.1 基因組DNA 提取 按照廈門致善生物科技有限公司Lab-aid820 核酸提取儀及配套試劑說明書操作。

1.3.2 基因突變分型 采用廈門致善生物科技股份有限公司生產的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因突變檢測試劑盒（熒光PCR 熔解曲線法）對基因組DNA 進行分型。 該試劑盒用于檢測中國人群常見的 12 種G6PD 基 因 突 變 ：c.95A ＞G、c.383T ＞C、c.392G ＞T、c.487G＞A、c.517T＞C、c.592C＞T、c.871G＞A、c.1004C＞A、c.1024C＞T、c.1360C＞T、c.1376G＞T、c.1388G＞A。

1.4 統計方法

采用SPSS 21.0 統計學軟件進行數據分析，計數資料采用頻數和百分比(%)表示。

2 結果

2.1 患病率及患病新生兒性別比例

經熒光分析法檢測出陽性患兒109 例,患病率為0.343‰,男性患兒 107 例,占 98.2%,患病率為 0.337‰,女性患兒2 例,占1.8%,患病率為0.063‰,男女比例為53.5:1。 男性患病率明顯高于女性。

2.2 陽性患兒母親民族及籍貫分布

調查統計109 例熒光分析法陽性患兒母親民族和籍貫分布人數及百分比,結果顯示：漢族母親97 例,占89.0%；壯族母親4 例,占3.7%；黎族和傣族母親各2 例,均占 1.8%；景頗族母親 1 例,占 0.9%；另有 3 例患兒母親民族不明, 占2.8%。 山東籍母親60 例,占55.5%；廣西籍母親12 例,占11.5%；云南籍母親10例,占9.2%；廣東籍母親6 例,占5.5%；緬甸、貴州和海南籍母親各3 例,均占2.8%；江蘇、河南、越南和四川籍母親各2 例,均占1.8%；柬埔寨、泰國和福建籍母親各 1 例,均占 0.9%。 見表 1。

表1 熒光分析法陽性患兒母親民族及籍貫分布

2.3 熒光PCR 熔解曲線法基因突變檢測結果

將109 例熒光分析法陽性患兒進行基因突變分析，66 例患兒檢測出突變位點,均為單個位點突變,其中男患兒64 例,女患兒2 例。 共檢測出10 種突變類型,分別是 c.1388G＞A 共 17 例,占 25.8%；c.1376G＞T共 14 例, 占 21.2%；c.487G＞A 共 9 例, 占 13.6%；c.1024C＞T 共 7 例,占 10.6%；c.95A＞G 和 c.1360C＞T 各5 例,均占 7.6%；c.871G＞A 共 4 例,占 6.1%；c.592C＞T共 3 例,占 4.5%；c.392G＞T 和 c.1004C＞A 各 1 例,均占1.5%。64 例男患兒均為半合子,2 例女患兒為雜合子，1 例為 c.95A＞G，1 例為 c.1360C＞T，余 43 例患兒未能檢測出突變位點。 見表2。

表2 基因突變檢測結果

3 討論

G6PD 缺乏癥呈全球分布, 約4 億人患有該病[6]。患者多數無癥狀,新生兒期可發生嚴重黃疸,攝入蠶豆或接觸某些感染或藥物時可發生急性溶血性貧血[7]。

該研究統計得出，魯東南地區G6PD 缺乏癥患病率為 0.343‰,遠低于廣東江門地區（5.07%）[8]、溫州（0.30%）[9]、廣州（4.2%）[10]等地報道的數據,這符合該病在我國“南高北低”的分布趨勢,但比青島市報道的患病率（0.21‰）[5]略高。 考慮到魯東南地區流動人口較多,南北通婚比例增大,多省份、多民族的人群聚集,使得G6PD 缺乏癥的患病率有逐年上升的趨勢。該研究中,男患兒的患病率顯著高于女患兒,分析其原因,男性只有一條X 染色體, 酶活性表現出完全缺乏,而女性有兩條X 染色體,酶活性會表現出正常、輕度缺乏或完全缺乏[11]，該研究結果符合X 染色體不完全顯性遺傳規律。 有學者通過研究論證，傳統的酶學檢測用于男性患兒診斷的靈敏性及特異性均很高,女性新生兒的酶學診斷與基因診斷相比, 陽性預測值僅為50%[12]。 因此，結合基因檢測可降低女性雜合子的漏檢率。

該研究中,通過熒光PCR 熔解曲線法檢出G6PD缺乏癥基因突變類型前兩位的是 c.1388G＞A（17 例）和 c.1376G＞T （14 例）, 占所有突變類型的 50%（33/66）,這可能是魯東南地區較常見的突變類型。 這與文獻報道的c.1388G＞A 和c.1376G＞T 是中國人群中最常見、特有的突變類型[13]結論一致。 中國人群中第3常見的突變類型 c.95A＞G 該研究僅有 5 例（7.6%）,而c.1024C＞T 該次檢出 7 例, 檢出率 （10.6%） 高于 c.95A＞G,這與彭瑛等[13]研究的川、滇、黔三區 G6PD 缺乏癥基因突變分布頻率 （c.1388G＞A 占 29.78%,c.1376G＞T 占 24.65%,c.1024C＞T 占 22.33%,c.95A＞G占12.09%）一致,而青島地區的研究結果為c.95A＞G占 19.44%,未檢出 c.1024C＞T[5]。 文獻報道顯示,c.871G＞A 主要存在于東南亞人群中[14]，該研究顯示，4例c.871G＞A 突變患兒母親僅有1 例為東南亞國家柬埔寨籍,余3 例分別來自山東、河南和江西。 以上數據說明魯東南地區基因突變分布及頻率有其自身特點,地區之間G6PD 缺乏癥基因突變譜存在較大差異,有必要構建魯東南地區G6PD 缺乏癥突變位點數據庫。

c.487G＞A 突變在該研究中發現9 例, 位列第3位。 國外的研究數據表明，c.487G＞A 是大湄公河次區域最常見最普遍的突變類型[14]。 該次發現的9 例患兒母親籍貫分別是云南 5 例（56%）,緬甸 2 例（22%）,山東2 例（22%）,符合該基因的分布規律。 可見疾病高發區人口流動,南北通婚造成的基因融合,會使后代獲得 遺 傳 病 的 概 率 上 升 。 c.592C ＞T、c.392G＞T 和 c.1004C＞A 檢出率較低。

由于該次使用的多色探針熒光PCR 熔解曲線法試劑盒只檢測中國人常見的12 種基因突變類型,該研究有43 例患兒未能檢測出突變位點。 可采用全基因組測序的方法進行更全面的檢測,以期獲得所有患兒的突變位點, 并尋找新發突變, 不斷完善該地區G6PD 缺乏癥基因突變數據庫。