金釵石斛復方對小鼠免疫功能的影響

張煥新 蘭海崇 張冰潔

摘要 為了研究金釵石斛復方對小鼠免疫功能的影響，將實驗小鼠隨機分為對照組、高劑量組、中劑量組、低劑量組;采用Con A誘導小鼠淋巴細胞轉化試驗及遲發性變態反應試驗測試試驗組小鼠的細胞免疫功能;采用抗體生成細胞檢測及溶血試驗測試其體液免疫功能;采用小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗測試其特異性免疫功能。結果表明，與對照組比較，金釵石斛復方能夠明顯提高脾淋巴細胞增殖能力、溶血空斑數、小鼠抗體積數、巨噬細胞吞噬雞紅細胞的能力;金釵石斛復方對提高小鼠NK細胞活性能力無顯著影響。金釵石斛復方對正常小鼠的細胞免疫、體液免疫及巨噬細胞功能均有明顯的增強作用。

關鍵詞 金釵石斛;復方;免疫功能;小鼠;影響

中圖分類號 R 285.5? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2021）18-0177-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.18.043

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Effect of Dendrobium nobile Lindl. Complex Prescription on Immune Function of Mice

ZHANG Huan-xin1， LAN Hai-chong2， ZHANG Bing-jie1

（1.College of Food Science and Technology，Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College，Taizhou，Jiangsu 225300;2.Zunyi Lusheng Kangyuan Technology Development Co.， Ltd.， Zunyi， Guizhou 564100）

Abstract In order to study the effect of Dendrobium nobile compound prescription on immune function of mice， the mice were randomly divided into control group， high dose group， middle dose group and low dose group. The tardive allergy test was used to test the cellular immune function of mice in different experimental groups. The humoral immune function of mice in different experimental groups was tested by antibody-producing cell detection and hemolysis test. The peritoneal macrophage phagocytosis chicken red blood cell test was used to test specific immunity function. The results showed that compared with the control group， the Dendrobium nobile compound prescription could significantly increase the proliferation ability of spleen lymphocytes， the number of hemolytic plaques， the antibody of mice， and the ability of macrophages to phagocytose chicken red blood cells.The Dendrobium nobile compound prescription had no significant effect on the ability to improve the activity of NK cells in mice. Dendrobium nobile complex prescription had obvious enhancement effects on cellular immunity， humoral immunity and macrophage function in normal mice.

Key words Dendrobium nobile Lindl.;Complex prescription;Immunity function;Mice;Effect

作者簡介 張煥新（1972—），男，河南葉縣人，教授，博士，從事食品加工技術研究。*通信作者，工程師，碩士，從事天然植物成分研究。

收稿日期 2020-09-25;修回日期 2021-04-25

金釵石斛（Dendrobium nobile Lindl.）為多年生草本，形如古代頭上的發釵而得名，大部分分布于西南、華南、臺灣等地。金釵石斛是我國傳統的名貴中藥，在《神農本草經》中列為上品。現代醫學研究表明，金釵石斛的主要化學成分是多糖、苷類、生物堿、菲類、酚類等[1]。現代醫學和中醫藥理研究表明，石斛在提高人體免疫能力、抗衰老、抑制腫瘤、補五臟虛勞、降血脂、降血壓等方面有明顯的效果[2-4]。民間有“救命仙草”之稱，俗稱藥黃金。茶葉味苦、甘、性涼，歸心、肺、胃、腎經。茶葉中含有大量茶多酚及兒茶素等類黃酮化合物，還含有大量茶多糖;大量體外及動物試驗研究表明茶葉具有顯著的免疫增強作用[5-7]。

上述天然原料均為食藥兩用資源或可用于保健食品的資源，無毒無害。石斛多糖、茶多酚、茶籽油等功能性成分具有增強免疫的功效，配合使用會大大增強其預防或治療效果。該研究探討了金釵石斛復方對小鼠免疫功能的影響。

當今社會，隨著生活節奏的加快和社會競爭加劇，種種行為都會威脅到人體的免疫力，而免疫力低下人群逐漸增多。由于缺乏針對性的免疫低下治療措施，加之相關治療藥物對人體有毒副作用，服用保健食品進行干預成為一種理想選擇。因此，研究一種具有免疫調節功效的復方具有較高的現實意義和推廣價值[8]。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

RPMI1640培養液，HyClone;小牛血清，Gibco;刀豆蛋白（ConA），aladdin。綿羊紅細胞（SRBC），南京茂捷微生物科技有限公司;瓊脂糖，GENE COMPANY LTD。2%綿羊紅細胞（SRBC），平睿生物科技（北京）有限公司。

1.2 主要儀器

LD5-2A離心機，北京醫用離心機廠;XDS-1B顯微鏡，重慶光電儀器有限公司;UV1750分光光度計，日本島津;HERA cell 150i CO 2培養箱，美國Thermo Electron公司; NU-430-400E超凈工作臺，美國NUAIRE。

1.3 實驗動物

BALB/c小鼠，SPF級，初始體重18～20 g，雌性，均由南京市江寧區青龍山動物繁殖場提供。

1.4 動物分組與給藥方法

40只小鼠隨機分為4組，即陰性對照組、高劑量組、中劑量組、低劑量組，每組10只[9]。在前期研究基礎上，確定了金釵石斛復方為金釵石斛提取物∶速溶茶粉∶茶籽油=6∶2∶11。其中金釵石斛提取物的多糖含量≥10%，速溶茶粉購于貴州陸圣康源公司，茶多酚含量≥20%。參考成人每日推薦攝入量確定小鼠給藥劑量：石斛復方高劑量組（1.2 g/kg）、中劑量組（0.4 g/kg）、低劑量組（0.2 g/kg），給藥體積均為0.01 mL/g，給予等體積的蒸餾水作為陰性對照組，灌胃給藥，每組10只。各組給相應的藥物，每天1次，連續30 d。

1.5 試驗方法

1.5.1 臟器/體重比值。

各組灌胃給予受試物，每天1次。連續灌胃30 d后，頸脫臼法處死動物，取其胸腺及脾臟，稱重，計算胸腺/體重和脾臟/體重比值[10]。

1.5.2 ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化試驗——MTT法。

根據中國衛生部《保健食品檢驗與評價技術規范（2003年版）》（下簡稱《規范》）中脾細胞懸液項目和淋巴細胞增殖反應項目方法進行試驗，最后使用紫外分光光度計570 nm測定光密度值（OD）。

1.5.3 抗體生成細胞檢測試驗——Jerne改良玻片法。

根據《規范》，在清潔玻片上刷上一薄層瓊脂糖，干后可長期保存備用。制備脾細胞懸濁液后，計數溶血空斑數[11]。

1.5.4 血清溶血素的測定試驗——血凝法。

根據《規范》，兩步操作分別是血清分離與凝集反應。每只小鼠腹腔注射0.2 mL 的2%（V/V）壓積SRBC的細胞懸液進行免疫。4 d后，摘除眼球取血于離心管內[12]，使血清充分析出，并收集血清，觀察不同稀釋度的血清血球凝集程度。

1.5.5 小鼠碳廓清試驗。

根據《規范》，按體重從小鼠尾靜脈注入稀釋的印度墨水（0.01 mL/g），待墨汁注入，立即計時。注入墨水后2、10 min，分別從內眥靜脈叢取血20 μL，并立即將其加到2 mL 0.1% Na 2CO 3溶液中。用紫外分光光度計在600 nm波長處測OD值，以Na 2CO 3溶液作對照。將小鼠處死，取肝臟和脾臟，分別去污稱重[13]。以吞噬指數表示小鼠碳廓清的能力，按下式計算：

K=lgOD 1-lgOD 2t 2-t 1（1）

吞噬指數=體重肝重+脾重×3K（2）

式中，t 1、t 2分別為第1次、第2次采血時間;OD 1、OD 2分別為t 1、t 2對應的吸光度。

1.5.6 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗——滴片法。

根據《規范》，試驗前4 d給每只小鼠腹腔注射2%壓積綿羊血紅細胞0.2 mL。準備潔凈的載玻片，分別標號，一系列操作后，于40×顯微鏡下計數吞噬率和吞噬指數。每張片計數100個巨噬細胞，吞噬率的意義是每100個巨噬細胞中吞噬雞紅細胞的巨噬細胞所占的百分率;吞噬指數為平均每個巨噬細胞吞噬雞紅細胞的個數[14]。計算公式如下：

吞噬百分率=吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數計數的巨噬細胞數×100%（3）

吞噬指數=被吞噬的雞紅細胞總數計數的巨噬細胞數（4）

1.5.7 NK細胞活性測定試驗。

根據《規范》，試驗前24 h將靶細胞進行傳代培養。最后將96孔培養板以1 500 r/min離心5 min;每孔吸取上清100 μL置平底96孔培養板中，同時加入LDH基質液100 μL;37 ℃反應3 min，每孔加入1 mol/L HCl 30 μL，在酶標儀490 nm處測定OD值。NK細胞活性計算公式如下：

NK細胞活性=反應孔OD-自然釋放孔OD最大釋放孔OD-自然釋放孔OD×100%（5）

1.6 數據統計

采用SPSS 24.0軟件進行單因素方差分析（ANOVA）和回歸方程分析[15]，結果以平均值±標準偏差表示，顯著水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 金釵石斛復方對小鼠胸腺、脾臟器官的影響

金釵石斛復方高、中、低劑量組對小鼠臟器/體重比值的影響結果見表1。經對高、中、低劑量組及對照組的資料進行單因素方差分析，整體比較均為不顯著（P>0.05）。幾個組相互比較并結合數據來看，給藥組小鼠胸腺系數、脾臟系數較對照組沒有明顯升高，與對照組比較沒有顯著差異（P>0.05）。

2.2 金釵石斛復方對小鼠ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化的影響

從金釵石斛復方對小鼠ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化的影響結果（表2）可以看出，與陰性對照組比較，金釵石斛復方高劑量組可以明顯提高脾淋巴細胞增殖能力（P<0.01），結果可以判定為陽性。

2.3 金釵石斛復方對小鼠抗體生成細胞的影響

溶血空斑是在補體參與下溶解周圍SRBC形成的透明溶血區域，是反映機體體液免疫功能的經典試驗之一。金釵石斛復方溶血空斑試驗結果見表3，分析表明，與陰性對照組比較，金釵石斛復方高、中劑量組均能夠明顯提高小鼠的溶血空斑數（P<0.01），可判定陽性。

2.4 金釵石斛復方對小鼠血清溶血素的影響

從金釵石斛復方小鼠血清溶血素試驗結果（表4）可以看出，與陰性對照組比較，金釵石斛復方高、中、低劑量組均可以提高抗體積數（P<0.01）。由于抗體積數越大說明血清抗體越高，當受試樣品組的抗體水平顯著高于對照組的抗體水平，則可判定結果陽性。

2.5 金釵石斛復方對小鼠碳廓清的影響

小鼠碳廓清反映的是巨噬細胞吞噬功能試驗，結果見表5。數據分析表明，與陰性對照組比較，金釵石斛復方高、中、低劑量組均無明顯提高小鼠的吞噬指數，結果沒有統計學意義（P>0.05）。

2.6 金釵石斛復方對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的影響

巨噬細胞活力與功能是免疫功能的重要體現與指標之一，當巨噬細胞與顆粒物質雞紅細胞混合孵育后，雞紅細胞即被吞噬，鏡檢其結果可以反映免疫功能的強弱。金釵石斛復方小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗結果見表6，經數據分析表明，與陰性對照組比較，金釵石斛復方高劑量組可以明顯提高小鼠巨噬細胞吞噬雞紅細胞的能力（P<0.01）[16]。

2.7 金釵石斛復方對小鼠NK細胞活性的影響

從表7可以看出，與陰性對照組比較，金釵石斛復方高劑量組、中劑量組、低劑量組均沒有明顯提高小鼠NK細胞活性能力（P>0.05）。

3 小結

ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化試驗中，金釵石斛復方高劑量組與陰性對照組比較可以明顯提高脾淋巴細胞增殖能力（P<0.01），可判定細胞免疫功能測定結果陽性。抗體生成細胞檢測（Jerne改良玻片法）試驗中，金釵石斛復方高、中劑量組與陰性對照組比較均可以明顯提高小鼠的溶血空斑數（P<0.01）;金釵石斛復方高、中、低劑量組與陰性對照組比較均可以提高小鼠抗體積數（P<0.01），可判定體液免疫功能測定結果陽性。小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗中，金釵石斛復方高劑量組與陰性對照組比較可以明顯提高小鼠巨噬細胞吞噬雞紅細胞的能力（P<0.01），可判定單核-巨噬細胞功能測定結果陽性。綜上所述，金釵石斛復方能明顯增強機體的細胞免疫、體液免疫功能和巨噬細胞功能，具有明顯的免疫增強作用。

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