3種防治草莓灰霉病化學(xué)殺菌劑的篩選及復(fù)配效果研究

劉華琪 文夢(mèng)夢(mèng) 吳小新 薛滿(mǎn)滿(mǎn) 張晉睿 許潔 鄭志天

摘要 [目的]明確不同殺菌劑復(fù)配對(duì)草莓灰霉病的防治效果。[方法]采用菌絲生長(zhǎng)速率抑制法測(cè)定咯菌腈、氟硅唑、啶酰菌胺3種化學(xué)殺菌劑對(duì)淮安地區(qū)草莓灰霉病菌的室內(nèi)毒力。[結(jié)果]3種藥劑均對(duì)草莓灰霉病菌有抑制活性，其中咯菌腈和氟硅唑的抑菌效果最為明顯，所測(cè)菌株EC 50的平均值分別為0.018 4和0.264 5 μg/mL。將咯菌腈和氟硅唑按照不同比例進(jìn)行復(fù)配，復(fù)配劑對(duì)草莓灰霉病菌的抑菌活性均表現(xiàn)出相加作用，配比為2∶1和1∶3時(shí)相加作用最明顯。[結(jié)論]咯菌腈和氟硅唑按2∶1或1∶3的比例復(fù)配能夠延緩抗藥性，同時(shí)降低農(nóng)藥用量，該復(fù)配劑有待進(jìn)一步研究。

關(guān)鍵詞 草莓灰霉病菌;咯菌腈;氟硅唑;化學(xué)復(fù)配

中圖分類(lèi)號(hào) S 482.2 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2021）18-0140-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.18.034

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Screening of Three Chemical Fungicides against Strawberry Botrytis cinerea and Study on Synergistic Effect

LIU Hua-qi，WEN Meng-meng，WU Xiao-xin et al （Huaiyin Institute of Technology，Huaian，Jiangsu 223003）

Abstract [Objective]To determine the control effect of three fungicides against strawberry Botrytis cinerea. [Method] The indoor virulence of three chemical fungicides，namely，fludioxonil，fluosilazole and boscalid，to Botrytis cinerea in Huaian Area was determined by mycelium growth rate inhibition method.[Result]All the three agents had inhibitory activity against Botrytis cinerea，among which fludioxonil and fluosilazole had the most obvious inhibitory effect.The average value of EC 50 of the tested strains was 0.018 4 and 0.264 5 μg/mL，respectively.Compounded fludioxonil and fluosilazole in different proportions，and both compounds showed additive effect on bacteriostatic activity of Botrytis cinerea.The additive effect was most obvious when the ratio was 2∶1 and 1∶3.[Conclusion]The combination of fludioxonil and fluosilazole at a ratio of 2∶1 or 1∶3 can delay drug resistance and reduce pesticide dosage.So this compound needs further research and development.

Key words Botrytis cinerea;Fludioxonil;Fluosilazole;Combination of chemical agents

由灰葡萄孢（Botrytis cinerea Pers）引起草莓灰霉病害是草莓生產(chǎn)上的主要病害。近年來(lái)，由于淮安地區(qū)草莓的廣泛種植，草莓灰霉病的問(wèn)題日益突出[1-2]。灰霉病主要危害草莓果實(shí)，嚴(yán)重時(shí)危害果柄、花梗等，每年造成10%～30%的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重時(shí)甚至高達(dá)89% [3-4]。生產(chǎn)上對(duì)草莓灰霉病的防控方法主要包括農(nóng)業(yè)防治（清除病殘?bào)w、調(diào)控濕溫度、通風(fēng)透光）、生物防治（枯草芽孢桿菌防治）、化學(xué)防治（利用化學(xué)農(nóng)藥）等，其中化學(xué)防治具有見(jiàn)效快、節(jié)約成本等優(yōu)勢(shì)，一直是防治草莓灰霉病的主要方法[5-9]。

目前防治草莓灰霉病的化學(xué)藥劑主要有腐霉利、異菌脲、嘧霉胺、咯菌腈、啶酰菌胺等，但長(zhǎng)期大量使用化學(xué)藥劑不僅污染土壤，破壞生態(tài)結(jié)構(gòu)，還造成農(nóng)藥殘留，而且容易使病原菌產(chǎn)生抗藥性[10-11]。研究表明，草莓灰霉病菌對(duì)腐霉利、異菌脲、嘧霉胺、咯菌腈等藥劑已經(jīng)產(chǎn)生抗藥性，因此選擇抑菌效果好，能夠延緩藥劑使用壽命的復(fù)配技術(shù)對(duì)防治草莓灰霉病顯得至關(guān)重要[12-15]。該研究選用咯菌腈、氟硅唑、啶酰菌胺3種殺菌劑，進(jìn)行了室內(nèi)試驗(yàn)以及復(fù)配作用研究，啶酰菌胺是德國(guó)巴斯夫公司開(kāi)發(fā)的琥珀酸脫氫酶抑制劑，其作用機(jī)制是與病原菌線(xiàn)粒體呼吸鏈電子傳遞體系中復(fù)合體Ⅱ結(jié)合，進(jìn)而阻礙呼吸能量代謝，抑制 ATP 的合成，使菌體死亡。且對(duì)主要經(jīng)濟(jì)作物的多種灰霉病、菌核病、白粉病具有良好的保護(hù)和治療作用[16-17]。咯菌腈（fludioxonil）是一種新型的非內(nèi)吸性苯基吡咯類(lèi)殺菌劑，咯菌腈的抑菌機(jī)制是通過(guò)抑制與葡萄糖磷酰化有關(guān)的轉(zhuǎn)移酶，使灰霉病菌孢子萌芽、芽管伸長(zhǎng)及菌絲體生長(zhǎng)受到抑制[18-19]。氟硅唑是三唑類(lèi)殺菌劑，主要對(duì)子囊菌綱、擔(dān)子菌綱和半知菌類(lèi)真菌有效，目前廣泛用于果樹(shù)、蔬菜的黑星病、白粉病、黑斑病、炭疽病、根腐病等[20]，作用原理是破壞和阻止麥角甾醇的生物合成，導(dǎo)致細(xì)胞膜不能形成，從而使病菌死亡。目前發(fā)現(xiàn)氟硅唑?qū)Σ葺颐共∫簿哂休^好的防治效果[21]。

研究表明，啶酰菌胺與腐霉利、咯菌腈、唑胺菌酯以及嘧霉胺與咯菌腈的復(fù)配劑對(duì)草莓灰霉病的防治均有增效作用[22-25]。筆者將咯菌腈和氟硅唑進(jìn)行不同比例復(fù)配，測(cè)定其聯(lián)合毒力，為草莓灰霉病防治減藥增效，延緩抗藥性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株。

草莓灰霉病野生菌株（Botrytis cinerea）Bc1和Bc9，由筆者所在課題組從淮安地區(qū)各大草莓園發(fā)病的草莓病果上分離、純化和培養(yǎng)獲得。

1.1.2 試驗(yàn)藥劑。

98.51%啶酰菌胺原藥（上海秦巴化工股份有限責(zé)任公司）;97.9%咯菌腈原藥（江蘇楊農(nóng)化工集團(tuán)有限公司）;97%的氟硅唑（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)殺菌劑實(shí)驗(yàn)室）。

甲醇，分析純，分別溶解咯菌腈、氟硅唑和啶酰菌胺原藥，均配成濃度為1×104 μg/mL的母液，再用甲醇稀釋成系列質(zhì)量濃度的藥液供試 （表 1）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 室內(nèi)毒力測(cè)定。采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定藥劑對(duì)草莓灰霉病菌的抑制作用。首先按照表1制作不同藥劑濃度的PDA平板，同時(shí)設(shè)無(wú)藥平板為對(duì)照。用打孔器在預(yù)培養(yǎng)4 d的草莓菌Bc1、Bc9菌落邊緣打取菌碟，正面朝下接種到含藥平板上，每個(gè)處理重復(fù)3次，置于27 ℃培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)。5 d后，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算菌絲抑制率，并采用浙大DPS V9.01數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行生物測(cè)定分析，求出單劑的毒力回歸方程、抑制中濃度EC 50及相關(guān)系數(shù)r。試驗(yàn)進(jìn)行2次。

抑制率=（對(duì)照組菌落直徑-含藥組菌落直徑）/對(duì)照組菌落直徑×100%

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果選出毒力較高的咯菌腈和氟硅唑，按照比例混合法進(jìn)行復(fù)配，然后采用菌絲生長(zhǎng)速率法對(duì)草莓灰霉病菌繼續(xù)進(jìn)行生物測(cè)定。先將咯菌腈和氟硅唑母液按照體積比1∶1、2∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12進(jìn)行復(fù)配，再按照表1制備成含藥平板，以無(wú)藥平板為對(duì)照，用菌絲生長(zhǎng)速率法進(jìn)行測(cè)定。得出各復(fù)配組合的EC 50值，并采用Wadley法進(jìn)行復(fù)配增效作用評(píng)價(jià)[26]。

EC 50（th）=（a+b）/[a/EC （A）50+b/EC （B）50]

SR= EC 50（th）/EC 50（ob）

式中，A、B分別代表2種藥劑，a、b分別代表2種藥劑在混劑中所占比例，ob為實(shí)際觀察值，th為理論值。當(dāng)增效系數(shù)SR>1.5時(shí)為增效作用，0.5≤SR≤1.5為相加作用，SR<0.5為拮抗作用。

1.2.2 離體草莓葉片試驗(yàn)。首先在溫室中培養(yǎng)健康的易感灰霉病的“紅顏”草莓，選取健康的大葉片用清水洗凈，分別浸泡在濃度為0.26 μg/mL的不同殺菌劑培養(yǎng)皿中10 min，4組殺菌劑分別為咯菌腈、氟硅唑單劑、2∶1和1∶3的咯菌腈與氟硅唑的復(fù)配劑，對(duì)照組浸泡在無(wú)菌清水中。然后將葉片正面向上置于直徑9 cm鋪有潤(rùn)濕濾紙的培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿中放一片葉片。然后將預(yù)培養(yǎng)4 d的草莓菌Bc1、Bc9菌落邊緣打取菌碟，正面朝下接種到葉片正中央并在葉片中央做傷口處理。每個(gè)處理重復(fù)5個(gè)葉片，用封口膜封培養(yǎng)皿于培養(yǎng)箱中 27 ℃光暗交替（光∶暗=12 h∶12 h）培養(yǎng)。每隔2 d用移液槍加0.26 μg/mL濃度的藥液于濾紙片上保持濾紙濕潤(rùn)，對(duì)照組加無(wú)菌水濕潤(rùn)。7 d后，待清水對(duì)照充分發(fā)病后調(diào)查各處理發(fā)病情況。

1.3 數(shù)據(jù)分析 原始數(shù)據(jù)經(jīng) Excel 軟件進(jìn)行初步處理，采用DPS V 9.01 軟件的專(zhuān)業(yè)統(tǒng)計(jì)方法對(duì)室內(nèi)毒力數(shù)據(jù)進(jìn)行生物測(cè)定分析，獲得藥劑的 EC 50、回歸方程以及相關(guān)系數(shù);用Photoshop軟件對(duì)發(fā)病葉片進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種殺菌劑對(duì)草莓灰霉病的毒力測(cè)定

由表2可知，咯菌腈對(duì)草莓灰霉菌菌絲生長(zhǎng)抑制最強(qiáng)，其EC 50的平均值為0.018 4 μg/mL;其次為氟硅唑，其EC 50的平均值為0.264 5 μg/mL;啶酰菌胺略低于氟硅唑，其EC 50的平均值為0.514 7 μg/mL。因此，選用咯菌腈和氟硅唑進(jìn)行下一步復(fù)配研究。

2.2 咯菌腈、氟硅唑?qū)Σ葺颐共【膹?fù)配比例篩選

咯菌腈是防治草莓灰霉病的特效藥劑，近年來(lái)，隨著咯菌腈的大量使用，田間已經(jīng)出現(xiàn)對(duì)咯菌腈有抗性的草莓灰霉病菌株[27]。而氟硅唑通常認(rèn)為防治子囊菌效果較好，Wang等[21]發(fā)現(xiàn)，氟硅唑?qū)Σ葺颐共∫簿哂辛己玫姆乐涡Ч姨镩g沒(méi)有抗藥性菌株出現(xiàn)。因此，該研究對(duì)咯菌腈和氟硅唑進(jìn)行復(fù)配，以期達(dá)到延緩咯菌腈抗藥性的發(fā)生。由表3可知，不同配比的咯菌腈和氟硅唑復(fù)配劑均對(duì)草莓灰霉菌有抑制效果，EC 50在0.033～0.210。由于咯菌腈的毒力高于氟硅唑，其抑制中濃度遠(yuǎn)低于氟硅唑。為了減少咯菌腈的使用量達(dá)到延緩抗藥性的目的，在復(fù)配物中提高氟硅唑所占的比例，幾乎所用的復(fù)配劑均表現(xiàn)為相加作用。尤其當(dāng)咯菌腈與氟硅唑以2∶1和1∶3復(fù)配時(shí)，增效系數(shù)最高，相加作用最明顯。

2.3 草莓離體葉片防效

對(duì)篩選出來(lái)的藥劑和復(fù)配比例進(jìn)行了草莓離體葉片試驗(yàn)，用草莓灰霉病菌Bc1和Bc9對(duì)氟硅唑的平均EC 50 值0.26 μg/mL 處理草莓葉片，觀察不同藥劑與不同復(fù)配比例對(duì)草莓灰霉病菌的防治效果。從圖1可以看出，接種草莓葉片7 d后，未用藥劑處理的葉片變黑，表面凹陷腐爛，產(chǎn)生白色菌絲，病斑占整個(gè)葉片3/4以上。而用0.26 μg/mL咯菌腈處理的葉片，僅在接種傷口部位有輕微的褐色病斑，說(shuō)明咯菌腈對(duì)草莓灰霉病的防效最好。用0.26? μg/mL氟硅唑處理的葉片，病斑大小接近葉片的1/2，符合中濃度抑制效果。咯菌腈與氟硅唑按2∶1和1∶3復(fù)配劑處理結(jié)果表明，病斑大小占整個(gè)草莓葉片的1/4～1/3，也具有相當(dāng)好的防治效果，且該復(fù)配劑對(duì)延緩草莓灰霉病對(duì)咯菌腈的抗藥性、減少草莓生產(chǎn)上對(duì)咯菌腈的依賴(lài)具有重要意義。

3 結(jié)論與討論

草莓灰霉病菌繁殖速度快，寄主范圍廣，對(duì)環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，是高抗風(fēng)險(xiǎn)的病原物，已對(duì)多種農(nóng)藥產(chǎn)生抗藥性[28]。而將殺菌劑進(jìn)行混配可明顯降低草莓灰霉病抗藥性群體的形成，同時(shí)還具有擴(kuò)大殺菌譜、增強(qiáng)藥效、減少農(nóng)藥用量、降低成本等優(yōu)點(diǎn)。單一使用咯菌腈對(duì)草莓灰霉病具有極好的防治效果，其EC 50為0.018 4 μg/mL左右，但田間已經(jīng)出現(xiàn)抗藥性菌株，使得該藥劑的持續(xù)施用具有較大風(fēng)險(xiǎn)。而氟硅唑是三唑類(lèi)殺菌劑，主要對(duì)子囊菌綱、擔(dān)子菌綱和半知菌類(lèi)真菌有效，目前廣泛用于果樹(shù)、蔬菜的黑星病、白粉病、黑斑病、炭疽病、根腐病等方面。該研究表明，氟硅唑?qū)Σ葺颐共∫簿哂辛己玫姆乐涡Ч銭C 50在0.264 5 μg/mL左右。

該試驗(yàn)首次將作用機(jī)理不同的咯菌腈和氟硅唑藥劑進(jìn)行復(fù)配，結(jié)果表明不同復(fù)配比例的咯菌腈和氟硅唑?qū)Σ葺颐共【哂辛己玫囊种菩Ч鲂ё饔镁鶠橄嗉幼饔茫绕湟再|(zhì)量比2∶1和1∶3的復(fù)配對(duì)草莓灰霉病的相加作用最明顯，離體草莓葉片試驗(yàn)也證明該復(fù)配比例的有效性。該結(jié)果不僅有助于延長(zhǎng)2種藥劑的使用壽命，而且增加了防治草莓灰霉病的新藥劑，建議生產(chǎn)上推廣應(yīng)用。

該試驗(yàn)僅研究了咯菌腈和氟硅唑復(fù)配物對(duì)草莓灰霉病的防治效果，而這2種藥劑對(duì)其他病原菌，如油菜菌核病菌、草莓白粉病、草莓炭疽病是否也具有良好的防治作用，值得進(jìn)一步研究。因?yàn)榉柽虺煞謱?duì)子囊菌綱具有抑制作用，推測(cè)其對(duì)草莓白粉病及草莓炭疽病也具有防治效果。則該復(fù)配劑將一次性解決草莓生產(chǎn)上的三大病害，即草莓灰霉病、草莓白粉病及草莓炭疽病，使得該混劑既解決草莓生產(chǎn)上抗藥性難題，也解決了草莓病害難以防治、草莓生產(chǎn)用藥量大等問(wèn)題，對(duì)草莓生產(chǎn)減藥增效、保護(hù)環(huán)境具有重大意義。

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