華北大黑鰓金龜對桃樹揮發物的電生理反應

張 諾, 陳 立, 謝廣林

(1. 長江大學農學院, 湖北荊州 434025; 2. 河北大學生命科學學院, 生命科學與綠色發展研究院, 河北保定 071002)

在植物與植食性昆蟲長期進化過程中，植食性昆蟲逐漸對寄主植物產生的某些特殊化學物質或多種化學物質的特殊比例產生較強的嗅覺反應和趨向性(Sunetal., 2014)。這些植物揮發物是植食性昆蟲定位寄主的重要信號物質(姜斯琪, 2019)，在昆蟲取食、交配、產卵過程中具有非常重要的作用。除視覺信息外，植食性金龜子主要利用植物揮發物進行寄主定位。例如，扁綠異麗金龜Anomalaoctiescostata對蒲公英花揮發物中的順-3-己烯醇乙酸酯[(Z)-3-hexenyl phenylacetate]、苯甲醛(benzaldehyde)、苯乙醛(phenylacetaldehyde)、苯乙醇(phenethyl alcohol)、苯甲酸苯酯(phenyl benzoate)有強烈的趨向行為(Lealetal., 1994)。東北大黑鰓金龜Holotrichiadiomphalia對植物綠葉揮發物反-2-己烯醛[(E)-2-hexenal)]有顯著的趨向行為反應(孫凡等, 2006)。(鄰)氨基苯甲酸甲酯(methyl anthranilate)能夠引誘紅銅麗金龜Anomalarufocuprea(Maekawaetal., 1999)。丙酸苯乙酯(phenethyl propionate)、丁子香酚(eugenol)和香葉醇(geraniol)按照3∶7∶3比例混配的混合物對日本麗金龜具顯著的引誘作用(Leal, 1998)。

華北大黑鰓金龜Holotrichiaoblita，屬鰓金龜科(Melolonthidae)鰓金龜亞科(Melolonthinae)，在我國北方和沿海各省危害嚴重，是威脅農林業生產的重要地下害蟲。幼蟲(蠐螬)、成蟲均能為害，幼蟲棲息在土壤中，取食萌發的種子、根、莖，成蟲取食植物葉片(Lietal., 2009)。據統計，2003和2004年河南新鄉駐馬店地區花生田受蠐螬危害分別占播種面積的66.7%和89.2%(羅宗秀等, 2009)。華北大黑鰓金龜成蟲是一種夜行性昆蟲，視覺刺激因素對其行為影響有限，寄主植物揮發物在其寄主定位的過程中起著主要的導向作用(Balkeniusetal., 2006)，因此，可利用這些揮發性化學物質開發引誘劑，達到防治目的。

桃樹Prunuspersica屬薔薇目(Rosales)薔薇科(Rosaceae)李亞科(Prunoideae)，是多種金龜如華北大黑鰓金龜、銅綠麗金龜Anomalacorpulenta、蘋毛麗金龜Proagoperthalucidula、東方絹金龜Maladeraorientalis、小黃鰓金龜Metabolusflavescens等的寄主植物，這些金龜在桃樹上集中取食，輕者吃成花葉，危害嚴重時，會導致桃樹減產、掛果推遲，甚至整株枯死(渾志英和張之新, 1992; 孫瑞紅等, 2010; 劉先福, 2015; 李婭婭等, 2018; 劉雨林, 2020)。

前人的研究大多是對植物粗提物的化學分析，從中選取個別化合物的標準品進行電生理實驗和行為選擇試驗(馬艷華等, 2018; 李曉峰等, 2020)，還沒有利用氣相色譜-觸角電位聯用技術(gas chromatography-electroantennographic detection, GC-EAD)鑒定華北大黑鰓金龜寄主植物活性成分的研究報道。本研究根據金龜子成蟲利用植物揮發物進行寄主定位的行為特點，通過動態頂空吸附法收集桃樹枝葉揮發物，采用GC-EAD測試了華北大黑鰓金龜雌蟲對桃樹枝葉揮發物的反應，接著采用氣相色譜-質譜聯用儀(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)鑒定出揮發物中對華北大黑鰓金龜雌蟲具有觸角電生理活性的化學物質。然后將這些物質的標準品分別配制成0.001, 0.01, 0.1, 1.0和10.0 μg/μL溶液進行觸角電位測定，探索不同劑量的桃樹揮發性化學物質對雌、雄蟲電生理反應的影響。

1 材料與方法

1.1 供試材料及器具

1.1.1供試昆蟲：華北大黑鰓金龜成蟲采集于北京市朝陽區中國科學院園區內草坪。帶回實驗室后，將采集的金龜放置于實驗室塑料盆(20 cm×30 cm×30 cm)中，盆中裝有1∶1(m/m)的沙土，塑料盆頂蓋上開一些小孔，保持透氣性，加適量的水于土中保持濕度。飼養12 h后用于觸角電位實驗。

1.1.2供試藥劑：導電液配方：750 mg/mL NaCl, 35 mg/mL KCl, 29 mg/mL CaCl2·2H2O的水溶液，0.05%吐溫80(Chenetal., 2019)。色譜純正己烷、二氯甲烷購自上海安譜科學儀器有限公司；Porapak-Q(80/100目)吸附劑、內標苯甲酸甲酯(methyl benzoate)、標準化合物(羅勒烯、順-3-己烯乙酸酯、順-3-己烯醇、壬醛、水楊酸甲酯，純度均大于96%)均購自于西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司。

1.1.3主要材料及器具：觸角電位儀(Syntech, Kirchzarten，德國)；氣相色譜-質譜聯用儀(7890A-5975C, Agilent Technology, 美國)；氣相色譜儀(GC-2010plus, Shimaduz, 日本)；刺激氣流控制器(CS-55, 內置空氣泵)；顯微操作臺MP-15；EAG數據記錄及分析軟件；采樣袋(60 cm×80 cm, Reynolds Oven Bag，美國)；吸附劑Porapak Q(80～100目，Supelco，美國)；吸附管(內徑5 mm)；大氣采樣儀QC-1S型(北京市勞動保護科學研究所，北京)。

1.2 桃樹揮發物的收集

在中國科學院奧運村園區內，選取5棵桃樹P.persica，每棵樹重復2次，在華北大黑鰓金龜出土高峰段(19∶00-21∶00)采用動態頂空吸附法收集桃樹揮發物。動態頂空吸附法參考李婭婭等(2018)，選取健康無病蟲害的桃樹，用采樣袋套住枝條，在枝條基部放入裝有活性炭的玻璃管(長20 cm，內徑5 cm)，采樣袋用線繩連同枝條和玻璃管綁緊，袋子頂端剪一小口插入吸附管，用線繩綁緊。用Teflon管依次連接吸附管的一端、氣體流量計和大氣采樣儀進氣口。吸附管裝有經過活化的200 mg的吸附劑。大氣采樣儀流速為500 mL/min，采集時間為2 h。采集完成后立即用1 mL的HPLC級二氯甲烷洗脫吸附管，得0.5 mL洗脫液置于-20℃冰箱內備用。

1.3 華北大黑鰓金龜對桃樹揮發物的GC-EAD反應

GC-EAD測定所用的設備和技術參考Chen等(2019)和張萌萌等(2020)。氣相色譜柱為DB-WAX毛細管柱(30 m×250 μm×0.25 μm)。升溫程序為起始溫度40℃，保持2 min，以5℃/min升至120℃，再以15℃/min升至240℃，保持4 min。進樣口溫度為230℃，檢測器溫度為240℃。載氣為氮氣，流速為2 mL/min。

挑選兩根端口整齊且大小比華北大黑鰓金龜雌蟲觸角基部和頂端稍大的玻璃毛細管；將導電液充滿毛細管，作為電極。挑選兩根長度為5 cm的鉑金絲插入兩個電極中，一個為參比電極，另一個為記錄電極。挑選活躍的金龜，放置在便簽紙上，在解剖鏡下，用手術刀由基部快速切下觸角，將觸角基部與充滿導電液的參比電極相連，觸角中間鰓瓣頂端接觸記錄電極。 記錄電極內用鉑金絲連接信號探針(EAG Combi, Syntech, Kirchzarten, 德國)，使用GC-EAD軟件(GC/EAD32, version 4.4, Syntech)記錄和分析數據(Chenetal., 2019)。

每次取3 μL樣品進行無分流進樣分析，至少得到5個成功的GC-EAD結果。若一個物質能引起雌蟲觸角強烈反應且能重復3次以上，則視為該物質具有電生理活性。結合GC-MS結果，鑒定出對華北大黑鰓金龜雌蟲觸角產生電生理反應的物質。

1.4 桃樹揮發物中EAD活性成分的鑒定

EAD活性成分的鑒定參考張萌萌等(2020)。采用Agilent 7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用儀對桃樹揮發物洗脫液進行組分分析。色譜柱為DB-WAX毛細管柱(參數同上)，進樣量2 μL，不分流進樣。柱溫升溫程序：起始溫度40℃，保持1 min，以5℃/min升至180℃，再以10℃/min升至240℃，保持4 min。進樣口溫度230℃，離子源溫度250℃，質譜電離方式為EI，電離能量為70 eV，掃描質量范圍40～500 amu。

根據質譜數據檢索NIST08質譜庫鑒定EAD活性成分的結構，并用標準品配制濃度為0.1 μg/mL的正己烷溶液，采用上述升溫程序進行保留時間和質譜驗證。

1.5 華北大黑鰓金龜對EAD活性揮發物標準品的EAG反應

華北大黑鰓金龜觸角電生理反應所用儀器及方法參照李婭婭等(2018)。觸角準備方法參照1.3節，快速切下金龜觸角，與參比電極和記錄電極相連，用移液槍取10 μL樣品加到濾紙條(5 mm×40 mm)上，待溶劑完全揮發后(20 s)，將濾紙條放入滴管中，用大拇指堵住粗口端，30 s后將滴管中氣味物質吹向鰓瓣，刺激時間為0.2 s，兩次刺激之間間隔2 min，便于觸角在刺激后恢復活性，空氣流速為800 mL/min。使用EAG 2000軟件記錄。

EAD活性揮發物標準品用HPLC級正己烷稀釋成0.001, 0.01, 0.1, 1.0和10 μg/μL進行EAG測試。5種EAD活性揮發物標準品的測試順序隨機，測試前后，均需使用HPLC級正己烷(對照)進行一次測試。一個觸角只用于測試一個濃度下的5種化合物和溶劑對照，為一個重復，雌、雄成蟲各8個重復。

1.6 數據分析

對EAG反應數據進行校正，即將同一觸角對揮發物標準品的EAG反應值減去其對正己烷的EAG反應值的平均值。 采用Excel 11.0軟件和SPSS 22.0統計軟件進行數據分析。采用Tukey-HSD多重比較檢測華北大黑鰓金龜觸角在同一濃度下對不同化合物的活性(平均值±標準誤， n=8)差異顯著性(P<0.05)；采用t檢驗檢測雌、雄成蟲對同種測試氣味物質的EAG反應差異顯著性(P<0.05)；采用線性回歸分析雌、雄蟲對同種物質不同劑量刺激下的EAG反應差異顯著性(P<0.05)。

2 結果

2.1 華北大黑鰓金龜雌成蟲對桃樹揮發物的GC-EAD反應

GC-EAD結果表明，有7種桃樹揮發物組分可重復地引起華北大黑鰓金龜雌成蟲的EAD反應(圖1)，經GC-MS鑒定分別為Z-β-羅勒烯、順-3-己烯乙酸酯、順-3-己烯醇、壬醛、水楊酸甲酯以及2種未知化合物(表1)。苯甲酸甲酯(內標)也有EAD活性(張萌萌等, 2020)。

圖1 華北大黑鰓金龜雌成蟲對桃樹揮發物的GC-EAD反應Fig. 1 GC-EAD responses of female adults of Holotrichia oblita to volatile compounds from peach tree1: 未知Unknown; 2: Z-β-羅勒烯Z-β-Ocimene; 3: 順-3-己烯乙酸酯Z-3-Hexenyl acetate; 4: 順-3-己烯醇Z-3-Hexenol; 5: 壬醛Nonanal; 6: 未知Unknown; 7: 水楊酸甲酯Methyl salicylate; 8: 內標Internal control.

表1 桃樹揮發物中對華北大黑鰓金龜雌成蟲的GC-EAD活性物質Table 1 GC-EAD active compounds to female adults of Holotrichia oblita in peach tree volatiles

2.2 華北大黑鰓金龜成蟲對5種桃樹揮發物成分的EAG反應

華北大黑鰓金龜雌、雄成蟲觸角對供試的5種桃樹揮發物成分均有明顯的EAG反應(圖2)。當劑量為0.01 μg時，水楊酸甲酯引起華北大黑鰓金龜雄成蟲的EAG反應顯著大于Z-β-羅勒烯(P<0.05)，但與其他化合物間沒有顯著差異(P>0.05)；雌成蟲對5種化合物的EAG反應也沒有顯著差異(P>0.05)。當劑量為0.1 μg時，雄成蟲對水楊酸甲酯的EAG反應顯著大于對Z-β-羅勒烯和壬醛，雌成蟲對水楊酸甲酯的EAG反應僅顯著大于對Z-β-羅勒烯(P<0.05)。當劑量為1 μg和10 μg時，雌、雄成蟲對5種化合物的EAG反應都沒有顯著差異(P>0.05)。但是當劑量達100 μg時，雌、雄成蟲對壬醛和Z-β-羅勒烯的EAG反應均顯著大于對順-3-己烯乙酸酯和水楊酸甲酯(P<0.05)。

華北大黑鰓金龜雌成蟲對供試的5種桃樹揮發物成分在5種不同劑量刺激下的EAG反應均顯著高于雄成蟲(P<0.05)(圖2)。隨著化合物的劑量增加，EAG的反應強度呈現明顯增大的趨勢(表2)。當劑量達100 μg時，除水楊酸甲酯外，雌成蟲觸角對Z-β-羅勒烯、順-3-己烯乙酸酯、順-3-己烯醇、壬醛的電生理反應顯著大于對其余4種劑量的反應(P<0.05)；當劑量為100 μg時，雄成蟲觸角對Z-β-羅勒烯、順-3-己烯醇、壬醛的電生理反應顯著大于對其余4種劑量的反應(P<0.05)。

3 討論

利用GC-EAD技術可以鑒定出桃樹揮發物中能引進昆蟲電生理和行為反應的化合物。本研究發現寄主植物桃樹揮發物中對華北大黑鰓金龜雌成蟲有EAD活性的物質共7種，已鑒定的化合物分別為Z-β-羅勒烯、順-3-己烯乙酸酯、順-3-己烯醇、壬醛、水楊酸甲酯，這些化合物均能引起華北大黑鰓金龜雌、雄成蟲較強的觸角電位反應(圖1)。桃樹揮發物中能引起東方絹金龜觸角電位反應的物質為反-2-己烯醛、順-3-乙烯己烯酯、反-3-己烯醇(E-3-hexanol)、順-3-己烯醇和水楊酸甲酯(張萌萌等, 2020)。由此可見，同時能引起華北大黑鰓金龜和東方絹金龜的觸角電位反應的化合物為順-3-己烯乙酸酯、順-3-己烯醇和水楊酸甲酯。雖然桃樹釋放的植物揮發物種類很多(Najar-Rodriguezetal., 2013)，但能引起昆蟲電生理反應的化合物卻很少。例如桃樹枝葉揮發物中引起梨小食心蟲Cydiamolesta雌成蟲觸角電位反應的化合物為(E)-β-羅勒烯、順-3-己烯乙酸酯、6-甲基-庚烯-2-酮和壬醛(Lu and Qiao, 2020)，而剪切下來的桃樹枝葉釋放的揮發物中的電生理活性物質為(E)-β-羅勒烯、順-3-己烯乙酸酯、順-3-己烯醇、苯甲醛和里那醇(Luetal., 2015; Lu and Qiao, 2020)。

本研究鑒定的化合物對昆蟲EAG和行為的活性已有很多報道。順-3-己烯乙酸酯、水楊酸甲酯對華北大黑鰓金龜具較強的吸引作用(鄧思思等, 2011; 熱孜宛古麗·阿卜杜克熱木等, 2018; 劉雨林, 2020)，也能引起銅綠麗金龜較強的趨性行為反應(鞠倩等, 2016)。在10 μg劑量刺激下，順-3-己烯醇能引起蘋毛麗金龜EAG反應(路常寬等, 2009)；大栗鰓金龜Melolonthahippocastani、五月鰓金龜Melolonthamelolontha、庭園發麗金龜Phylloperthahorticola雄蟲能夠利用寄主植物釋放的順-3-己烯醇尋找配偶(Rutheretal., 2002; Ruther, 2004)；寄主黑豆、蓖麻、花生、赤豆、蘋果釋放的順-3-己烯乙酸酯和順-3-己烯醇對黑絨鰓金龜Sericaorientalis有較強的吸引作用(周鑫, 2014)。華北大黑鰓金龜成蟲對其他植物揮發物也表現出良好的選擇趨性，如雌、雄成蟲對鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate)、順-3-己烯異丁酸酯[(Z)-3-hexene isobutyrate)]、苯酚(phenol)(10 μg/μL)有極顯著的趨向性(P<0.01)，但對α-水芹烯(α-phellandrene)、3-蒈烯(3-carene)、反-2-壬烯醛[(E)-2-nonenal)]有明顯的負趨性(熱孜宛古麗·阿卜杜克熱木等, 2018)。

揮發物濃度能影響金龜觸角電生理反應。同一種揮發物在濃度變化的情況下，白星花金龜Protaetiabrevitarsis雌成蟲隨著測試濃度的增大其觸角電生理反應相對值升高，但雄成蟲的電生理反應值無明顯變化(王瑞笛, 2019)。東北大黑鰓金龜雌、雄成蟲對反-2-己烯醛和5-甲基-1-己醇(5-methylhexan-1-ol)的EAG反應隨劑量的增加而增強(孫凡等, 2006)。反-2-己烯醛、羅勒烯、順-3-己烯乙酸酯、壬醛、苯甲醛、石竹烯[(-)-E-caryophyllene)]、水楊酸甲酯、α-法尼烯(α-farnesene)的濃度對銅綠麗金龜的電生理反應有一定影響，但沒有明顯的規律(鞠倩等, 2016)。本研究鑒定的5種桃樹揮發物中，同一物質在不同劑量下所引起的華北大黑鰓金龜雌、雄成蟲的EAG反應不同，隨著劑量增加，僅有雌蟲對水楊酸甲酯、雄蟲對順-3-己烯乙酸酯和水楊酸甲酯的電生理反應與劑量不呈正相關(圖2)。

金龜的性別對電生理反應有較大影響。華北大黑鰓金龜雄成蟲對寄主植物(銀杏、玉蘭、柿樹、榆樹)及非寄主植物金銀木揮發物的EAG反應均比雌成蟲的反應小(余玉婷, 2013; 李婭婭等, 2018)。華北大黑鰓金龜雌成蟲對100 μg劑量下的20種植物揮發物的EAG反應大于雄成蟲，其中順-3-己烯乙酸酯、辛醛、檸檬烯引起雌、雄蟲的EAG值達顯著性差異(鄧思思等, 2011)。東北大黑鰓金龜雌成蟲對反-2-己烯醛和5-甲基-1-己醇的EAG反應均高于雄成蟲(孫凡等, 2006)。暗黑鰓金龜雌成蟲觸角對丙酸苯乙酯和香葉醇的EAG反應值顯著大于雄成蟲(衣建坤, 2019)。白星花金龜雌、雄成蟲對寄主植物所產生的33種醇、醛類氣味物質有較強的EAG反應，雌蟲的EAG反應明顯大過雄蟲(龔建等, 2017)。本研究發現華北大黑鰓金龜雌、雄成蟲對同種氣味物質的EAG反應值有顯著性差異(圖2)，而且采用了5個劑量進行測試，探索濃度對雌、雄成蟲的影響，更具說服力。

華北大黑鰓金龜成蟲對5種氣味物質的EAG反應存在性別差異，可能與雌、雄成蟲感器的數量、分布及類別有關。孫凡等(2007)在觀察東北大黑鰓金龜觸角嗅覺感器的超微結構時，推測板形感器可能用于感受植物氣味。華北大黑鰓金龜雌、雄個體間觸角感器種類相同，每種感器的分布無明顯差異，但感器數目相差很大(杜瀟等, 2015)。由此推測華北大黑鰓金龜雌成蟲觸角上板形感器的數目大于雄蟲，可以通過掃描電鏡做進一步的研究。

綜上，所測的5種桃樹揮發物成分均能引起華北大黑鰓金龜成蟲的電生理反應，對研究開發華北大黑鰓金龜引誘劑具有一定的參考價值，但EAG反應值能否代表華北大黑鰓金龜對被測試揮發物具有相應的行為反應，還有待進一步的行為反應和田間誘集試驗進行驗證。本研究發現植物揮發物的劑量對華北大黑鰓金龜雌、雄成蟲電生理反應的影響較大，說明金龜子雌蟲先定位到寄主植物，再釋放性信息素吸引雄蟲完成交配，從而提高繁殖效率；雌蟲快速定位到寄主植物，完成產卵，對該種群的繁衍有益。