敲減神經肽F基因(npf)對亞洲玉米螟取食、生長發育和繁殖的影響

石 堅, 王 原, 梁 佳, 杜 娟, 趙章武

(中國農業大學植物保護學院昆蟲系, 農業農村部作物有害生物監測與綠色防控重點實驗室, 北京 100193)

神經肽F(neuropeptide F, NPF)屬于高等動物神經肽Y(neuropeptide Y, NPY)家族，是無脊椎動物特有的神經肽，因其序列C末端的一個酪氨酸(Y)被苯丙氨酸(F)取代，故命名為NPF (Mauleetal., 1991; Rajparaetal., 1992; de Jong-Brinketal., 2001)。NPF最初在莫尼茲絳蟲Moniezaexpansa上發現(Mauleetal., 1991)，此后通過特異性血清，在馬鈴薯甲蟲Leplinotarsadecemlineata(Spittaelsetal., 1996)與沙漠蝗Schistoceracagregaria(Veenstra and Lambrou, 1995)等無脊椎動物中發現由8～10個氨基酸組成的NPF短肽(short neuropeptide F, sNPF)。1999年在黑腹果蠅Drosophilamelanogaster中鑒定到了NPF長肽(Brownetal., 1999)。

昆蟲NPF主要在腦與腸道中表達(Brownetal., 1999; Wuetal., 2003, 2005a, 2005b; Krashesetal., 2009; Yueetal., 2016, 2017)，因此也稱之為腦-腸肽(brain-gut peptide)。通過原位雜交與免疫熒光技術，NPF首先定位在黑腹果蠅的腦和中腸中(Brownetal., 1999; Marianes and Spradling, 2013; Veenstraetal., 2014)。隨著NPF-Gal4果蠅轉基因系統的構建，腦中NPF的定位更加精確。在黑腹果蠅3齡幼蟲腦中發現有6個表達NPF的神經元，其中兩對在前腦背部與中部，另一對在食道下神經節(Wuetal., 2003, 2005a, 2005b)。羽化后的果蠅成蟲其NPF在腦中的表達表現出雌雄的性二型性特征，其中雄成蟲腦中含有26個表達NPF的神經元，而雌成蟲中在背側神經元(lateral dorsal neurons, LNds)多出3對生物鐘相關的神經元，參與果蠅睡眠和節律的調節 (Leeetal., 2006)。此后在其他昆蟲腦中陸續發現NPF的表達，如吸血蝽Rhodniusprolixus(Gonzalez and Orchard, 2008)、棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(Huangetal., 2011)和東亞飛蝗Locustamigratoriamanilensis(Houetal., 2017)等。

在昆蟲中，NPF對幼蟲的取食具有重要的調控作用。在黑腹果蠅中，幼蟲隨著NPF及其受體NPFR1的升高而增加其取食量，當幼蟲進入徘徊期之前會停止取食而化蛹，此時幼蟲體內的NPF表達量顯著下降(Wuetal., 2003)。此外，過表達NPF或其受體NPFR1，黑腹果蠅幼蟲取食更多的有害食物 (Wuetal., 2005b)，說明NPF不僅調控幼蟲的取食量，而且還調控著幼蟲對食物選擇的敏感性。Van Wielendaele等(2013)研究了NPF對沙漠蝗的取食調控作用，發現NPF表達量的增加伴隨著沙漠蝗體重和取食量的增加，而降低NPF后出現相反的情況。鱗翅目的棉鈴蟲、煙青蟲Helicoverpaassulta以及亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis在NPF取食研究中也得到了相似的結論(Liuetal., 2013; Yueetal., 2016; Yueetal., 2017; Yue and Zhao, 2017; Cuietal., 2020)。

近年來，由NPF的取食調控延伸出的發育和壽命調控得到廣泛的關注。在發育調控方面，Kannangara等(2020)報道了黑腹果蠅中攝食和發育協調的機制。NPF受體通過反向調控胰島素信號通路和正向調控前胸腺中蛻皮激素的分泌來影響發育過程，包括發育時間、生長速率和體型大小。由于NPF并不在幼蟲的前胸腺中表達，表明NPF釋放可能激活前胸腺細胞中的NPFR (Kannangaraetal., 2020)。因此，在營養應激下產生的NPF既可以通過腦內的NPFR神經元調節攝食行為，也可以通過前胸腺中的NPFR調節發育，從而協調攝食行為和發育。

亞洲玉米螟是一種鱗翅目螟蛾科的害蟲，主要分布在包括中國在內的東亞及東南亞等地區。作為一種發生面積廣、危害嚴重的害蟲，亞洲玉米螟在我國每年會造成春玉米減產10%，夏玉米減產20%～30%左右，嚴重的年份甚至可造成30%以上的損失。在熱帶農業國家，如菲律賓，亞洲玉米螟已經成為最具破壞性的玉米害蟲。此外，玉米螟寄主植物廣泛，除為害玉米外，田間寄主植物有8科20種，包括酸模葉蓼Polygonumlapathifolium、谷子和薏苡Setariaitalica等(袁志華等, 2015)。

RNA干擾(RNA interference, RNAi)是一種通過同源雙鏈RNA(dsRNA)特異性敲低目的基因表達量的技術，在基因功能領域它是一種有效的研究手段(Hannon, 2002; Geley and Müller, 2004)。這種基因沉默的方式是一種內源轉錄后的基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)機制, dsRNA轉化為小干擾RNA(siRNA)，最終使得mRNA快速降解，這種降解發生在細胞質中，可導致正常基因功能的沉默(Hammond, 2005)。在過去的幾十年間，已經有許多文章報道了該技術在害蟲防治領域的有效應用，包括噴灑、飼喂和注射(Baumetal., 2007; Wangetal., 2011; Zhangetal., 2013)。昆蟲dsRNA的飼喂方法首次在秀麗隱桿線蟲Caenorhabditiselegans中使用以來 (Fireetal., 1998)，已成功地應用于昆蟲發育、繁殖、行為和免疫等多種生理過程的基因功能鑒定。例如，通過飼喂雙鏈RNA，可以引起蘋果淺褐卷葉蛾觸角中某些基因的表達量降低 (Turneretal., 2010)。在本研究中，為了增加其有效和實用性，我們利用了一種RNaseⅢ缺陷型的大腸桿菌EscherichiacoliBL21(DE3)菌株，其內部由于插入了Tn10轉座子，導致rnc基因無法表達RNase Ⅲ，從而使得dsRNA可以大量表達(Maetal., 2020)。

我們在亞洲玉米螟中發現，NPF調控幼蟲取食行為(Yueetal., 2017)。然而，下調NPF的幼蟲是否能正常生長發育、正常化蛹以及正常交配和生殖？為了進一步闡明這些問題，本研究通過連續飼喂dsNPF和dsGFP，探究了NPF對亞洲玉米螟生長發育和繁殖的影響和調控作用，為NPF在田間害蟲的防治應用提供了重要依據。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

實驗所用亞洲玉米螟采自中國農業大學上莊實驗站，由中國農業大學昆蟲生理生化與分子生物學實驗室飼養。幼蟲以人工飼料飼喂于塑料養蟲盒(20 cm×14 cm×8 cm)中，亞洲玉米螟化蛹后從飼料中揀出，轉入養蟲籠中以5%蜂蜜水喂養，養蟲籠頂部罩一層蠟紙供成蟲產卵，每天將有卵的蠟紙替換下來放到養蟲盒中待其孵化。飼養條件為：溫度28℃，相對濕度60%左右，光周期16L∶8D。

亞洲玉米螟人工飼料配方如下：玉米粉150.0 g，大豆粉150.0 g，葡萄糖75.0 g，抗壞血酸4.0 g，瓊脂22.0 g，酵母粉90.0 g，山梨酸5.0 g，水1 400 mL。具體配制方法如下：玉米粉150 g，大豆粉150 g，酵母粉90 g， 充分混勻后在烘箱中120℃烘烤1 h； 食用葡萄糖75 g，抗壞血酸4 g，加1 000 mL水溶解后倒入烘烤好的混合物中，充分攪拌，靜止發酵1 h；稱取40 g玉米粉加適量水煮沸，稱取22 g瓊脂加適量水(共700 mL)攪拌均勻，倒入沸騰的水中繼續小火煮沸，煮沸后5 min停火晾涼至60℃左右；稱取山梨酸5.0 g加入混合物中并充分攪拌，快速倒入滅菌的醫用白瓷盤中，冷卻后置于4℃冷藏備用。

1.2 dsRNA表達載體的構建與dsRNA的合成

本實驗參考Ma等(2020)基于工程菌高效合成dsRNA的方法，分別構建dsNPF和dsGFP表達載體。其中，dsNPF表達載體的構建是通過設計的dsNPF雙鏈序列擴增出393 bp和349 bp兩個片段，然后分別用XbaⅠ-HindⅢ(TaKaRa)和XhoⅠ-HindⅢ酶切消化，形成頸環結構。而dsGFP表達載體的構建是通過設計的dsGFP雙鏈序列擴增出447 bp和403 bp兩個片段，然后分別用XbaⅠ-HindⅢ(TaKaRa)和XhoⅠ-HindⅢ酶切消化，形成頸環結構。將形成的頸環結構片段克隆到pET-28a的XbaⅠ-XhoⅠ位點，生成pET28-NPF和pET28-GFP。以上載體構建引物由生工生物股份有限公司合成，序列詳見表1。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

將pET28-NPF和pET28-GFP分別轉化至BL21(DE3) RNaseⅢ菌株(Maetal., 2020)，細胞于37℃孵育過夜。挑取單個克隆，在Kan抗性培養基中37℃培養過夜。將100 μL培養液稀釋至15 mL含有Kan的LB培養基中，37℃震蕩。當OD值到達0.4時，加入終濃度為1 mmol/L IPTG, 29℃在搖床中220 r/min誘導過夜。用乙醇固定法提取含有大量雙鏈目的基因的總RNA。

1.3 飼喂dsGFP和dsNPF進行RNAi

待人工飼料冷卻至少10 min后，分別將dsGFP和dsNPF與人工飼料混合，使其終濃度分別為0.01%(10 mg dsRNA混合100 g飼料)和0.02%(20 mg dsRNA混合100 g飼料)，分別飼喂剛孵化的亞洲玉米螟1齡(低齡)及剛蛻皮的3齡(中齡)和5齡(高齡)幼蟲，其中1齡開始處理的蟲數為150頭，3齡和5齡開始處理的蟲數為80頭；每處理包含3個生物學重復。每天更換含有dsGFP和dsNPF的人工飼料，以確保雙鏈的有效干擾。

1.4 RNAi后亞洲玉米螟幼蟲npf基因表達量的檢測

以含dsGFP和dsNPF的人工飼料飼喂10頭5齡初幼蟲24 h后,利用Trizol法(寶生物工程, 大連)提取亞洲玉米螟幼蟲中腸總RNA，并用超微量紫外分光光度計NanoDrop8000(Thermo, 美國)檢測RNA濃度和純度。以提取的總RNA為模板，按照PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)反轉錄試劑盒說明書(TaKaRa, 大連)合成單鏈cDNA。

利用Primer Premier 5設計npf基因的熒光定量引物(表1)。引物的合成由生工生物股份有限公司合成。根據SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) 試劑盒(天根生化，北京)進行qPCR檢測。每處理含3個生物學重復，每生物學重復含有3次技術重復。反應體系(20 μL): 2×Taq MasterMix 10 μL, 50×ROX 2 μL, RNase-Free dH2O 5.8 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.6 μL, cDNA 1 μL。反應條件: 95℃ 15 min; 95℃ 10 s, 60℃ 30 s, 40個循環。

1.5 RNAi后亞洲玉米螟生長發育和繁殖指標觀測

從飼喂dsGFP和dsNPF的人工飼料后持續觀察直至蟲體死亡，每日測量并記錄幼蟲體長、體重、原始人工飼料重、剩余飼料重、無幼蟲飼料重(對照，排除水分蒸發對結果的影響)、糞便重、存活數、死亡數和幼蟲齡期。取食量的計算方法為：稱量新鮮的含dsRNA飼料的重量(mL)及表面積一致的不含dsRNA飼料的重量(n1，空白對照，用于檢測水分蒸發量)，飼喂24 h后，將蟲子和糞便挑出，再次稱量取食后的含dsRNA重量(m2)及空白對照飼料重量(n2)，此24 h的取食量=m1-m2-(n1-n2)。化蛹率計算方法為：蛹數/5齡幼蟲數×100%；羽化率計算方法為：成蟲數/蛹數×100%。幼蟲各齡期和蛹發育歷期統計和計算方法為：50%個體進入到下一齡期或下一蟲態所需天數；成蟲壽命是指羽化進成蟲至死亡的時間；單雌產卵量是指單頭雌蟲產卵的總量。

體重、體長和取食量的檢測為5齡檢測指標的平均值；除存活率、化蛹率和羽化率外，其余指標均為個體數據。以上實驗均含3個生物學重復。

1.6 數據分析

利用GraphPad Prism, version 5.01(GraphPad Software, San Diego, CA)軟件進行數據分析，所有結果均以平均值±標準誤來表示，采用獨立樣本t檢驗進行差異顯著性分析。

2 結果

2.1 dsGFP和dsNPF的鑒定及干擾效率驗證

將850 bp的GFP基因片段和742 bp的npf基因片段分別以正義和反義方向克隆到pET28a載體上，其中分別含有一個86 bp和一個79 bp的環狀結構。將構建的重組質粒轉化到BL21(DE3) RNaseⅢ中生成目標dsRNA，利用1%的瓊脂糖凝膠進行大小鑒定，其中dsNPF為322 bp，dsGFP為412 bp (圖1: A)。

將獲得的dsRNA與玉米螟人工飼料混合，飼喂5齡初幼蟲24 h后，解剖亞洲玉米螟幼蟲中腸，檢測npf的表達量。結果顯示，dsNPF干擾后，npf在亞洲玉米螟幼蟲中腸中的表達量顯著下降了40.9%(P<0.001)(圖1: B)，證明dsRNA是有效的。

2.2 NPF對亞洲玉米螟幼蟲的影響

2.2.1對幼蟲取食量的影響：我們用0.01%和0.02%的dsNPF和dsGFP(對照)分別飼喂剛孵化的1齡幼蟲、剛蛻皮的3齡幼蟲和剛蛻皮的5齡幼蟲，然后測定5齡幼蟲的平均取食量。從1, 3和5齡幼蟲開始飼喂0.01% dsNPF時，與飼喂0.01% dsGFP的對照相比，處理組5齡幼蟲取食量分別顯著下降了13.84%(P<0.05), 33.33%(P<0.001)和36.40%(P<0.01) (圖2: A)；同樣情況下從1, 3和5齡幼蟲開始飼喂0.02% dsNPF時，與飼喂0.02% dsGFP的對照相比，5齡幼蟲取食量分別顯著下降了34.33%(P<0.01), 38.20%(P<0.01)和42.52%(P<0.01)(圖2: B)。這些結果說明，0.01% dsNPF對亞洲玉米螟幼蟲取食的影響是非常有效的；dsNPF處理不同幼蟲期對其取食量的影響是相似的。

圖2 0.01%(A)和0.02%(B) dsNPF處理對亞洲玉米螟5齡幼蟲取食量的影響Fig. 2 Impacts of 0.01% (A) and 0.02% (B) dsNPF on the food consumption of the 5th instar larvae of Ostrinia frunacalis圖中數據為平均值±標準誤。Data in the figure are mean±SE. nsP>0.05; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001(獨立樣本t檢驗Independent samples t-test). 下圖同The same for the following figures.

2.2.2對幼蟲體重的影響：用0.01% dsNPF飼喂亞洲玉米螟1齡直至5齡幼蟲時，與飼喂0.01% dsGFP的對照相比，處理幼蟲的體重顯著下降了25.84%(45.95±2.88 mgvs61.96±1.82 mg,P<0.01)；從3齡開始飼喂到達5齡時，0.01% dsNPF處理組幼蟲體重顯著下降了23.16%(44.20±2.10 mgvs57.52±1.76 mg,P<0.01)；從5齡初開始飼喂到達5齡末時，0.01% dsNPF處理組幼蟲體重顯著下降36.85%(40.82±0.84 mgvs64.64±1.31 mg,P<0.001) (圖3: A)。

圖3 0.01% (A)和0.02%(B) dsNPF處理對亞洲玉米螟5齡幼蟲體重的影響Fig. 3 Impacts of 0.01% (A) and 0.02% (B) dsNPF on the body weight of the 5th instar larvae of Ostrinia frunacalis

用0.02% dsNPF飼喂1齡幼蟲直至5齡時，與飼喂0.02% dsGFP的對照相比，處理幼蟲的體重顯著下降了30.88%(46.98±2.24 mgvs67.97±1.76 mg,P<0.01)；從3齡開始飼喂到達5齡時，0.02% dsNPF處理組幼蟲體重顯著下降了32.61%(45.97±1.87 mgvs68.21±1.02 mg,P<0.001)；0.02% dsNPF從5齡初開始處理到5齡末，處理組幼蟲體重顯著下降了45.04%(34.82±1.86 mgvs63.35±0.91 mg,P<0.001)(圖3: B)。

上述結果說明，兩種濃度dsNPF處理的不同幼蟲期均引起體重的顯著下降。此外，因為5齡幼蟲是暴食期，在暴食期下調NPF嚴重干擾或影響了幼蟲的生長發育。

2.2.3對幼蟲體長的影響：用0.01% dsNPF飼喂亞洲玉米螟1齡直至5齡幼蟲時，與飼喂0.01% dsGFP的對照相比，處理幼蟲的體長顯著下降了26.26%(16.54±0.43 mmvs22.43±0.30 mm,P<0.001)；從3齡開始飼喂到達5齡時，0.01% dsNPF處理的幼蟲體長顯著下降了19.12%(17.81±0.40 mmvs22.02±0.28 mm,P<0.001)；從5齡初開始飼喂到達5齡末時，0.01% dsNPF處理的幼蟲體長顯著下降19.70%(17.41±0.38vs21.68±0.33 mm,P<0.01)(圖4: A)。

0.02% dsNPF飼喂1齡幼蟲直至5齡時，與飼喂0.02% dsGFP的對照相比，處理幼蟲的體長顯著下降了30.20%(15.28±0.72 mmvs21.89±0.80 mm,P<0.01)；從3齡開始飼喂到達5齡時，0.02% dsNPF處理的幼蟲體長顯著下降了31.18%(14.81±0.26 mmvs21.52±0.78 mm,P<0.01)；0.02% dsNPF從5齡初開始處理到5齡末，其幼蟲體長顯著下降28.16% (15.59±0.52 mmvs21.70±0.37 mm,P<0.001)(圖4: B)。

圖4 0.01%(A)和0.02%(B) dsNPF處理對亞洲玉米螟5齡幼蟲體長的影響Fig. 4 Impacts of 0.01% (A) and 0.02% (B) dsNPF on the body length of the 5th instar larvae of Ostrinia frunacalis

上述結果說明，無論是從1齡、3齡還是5齡幼蟲開始飼喂，dsNPF處理組5齡幼蟲體長均顯著低于對照個體，而高濃度dsNPF較低濃度有更大的影響。

2.2.4對幼蟲存活率的影響：用0.01% dsNPF分別飼喂亞洲玉米螟1齡和3齡幼蟲直到5齡幼蟲，與飼喂0.01% dsGFP的對照相比，處理幼蟲的存活率分別顯著下降了50.91%(P<0.001)和26.23%(P<0.01) (圖5: A)。同樣情況下飼喂0.02% dsNPF后，與飼喂0.02% dsGFP的對照相比,處理幼蟲的存活率分別顯著下降了88.57%(P<0.001)和27.44%(P<0.05) (圖5: B)。

圖5 0.01% (A)和0.02% (B) dsNPF處理對亞洲玉米螟幼蟲存活率的影響Fig. 5 Impacts of 0.01% (A) and 0.02% (B) dsNPF on the survival rate of Ostrinia frunacalis larvae

上述結果說明：(1)0.01%的低濃度足以對其存活率產生巨大影響; (2)開始飼喂dsNPF的幼蟲期越早，其存活率也越低；(3)從1齡開始飼喂dsNPF的個體，其存活率的大幅下降主要集中在3齡前，且隨著dsNPF濃度的增加急劇下降；(4)從3齡開始飼喂dsNPF的個體，其存活率的下降相對較緩，說明dsNPF對3齡前幼蟲的存活率影響較大。

2.2.5對幼蟲發育歷期的影響: 用0.01% dsNPF從1齡初開始處理，1-5齡的發育歷期與飼喂0.01% dsGFP的對照相比平均延遲了7.00 d(22.00±0.00 dvs15.00±0.58 d,P<0.001)，發育延緩的時期主要發生在3齡到5齡幼蟲階段；0.01% dsNPF從3齡初開始處理，3-5齡的發育歷期與對照相比平均延遲了5.00 d(14.00±0.58 dvs9.33±0.33 d,P<0.01)，而發育延緩的時期主要發生在4-5齡階段；0.01% dsNPF從5齡初開始處理，5齡的發育歷期與對照相比平均延遲了2.00 d(5.67±0.33 dvs3.33±0.33 d,P<0.01)(表2)。

表2 0.01% dsNPF和dsGFP分別處理亞洲玉米螟1, 3和5齡初幼蟲后不同幼蟲齡期、蛹發育歷期和成蟲壽命Table 2 Developmental duration of different larval instars and pupae and adult life span after the early 1st, 3rd and5th instar larvae of Ostrinia furnacalis were fed with 0.01% dsNPF and dsGFP, respectively

0.02% dsNPF從1齡初開始處理，1-3齡的發育歷期與飼喂0.02% dsGFP的對照相比平均延遲了6.00 d (13.00±0.58 dvs7.33±0.33 d,P<0.01)，到4齡時已經有90%以上的個體死亡，不再具有可比性；0.02% dsNPF從3齡初開始處理，3-5齡的發育歷期與飼喂0.02% dsGFP的對照相比平均延遲了8.00 d(17.67±0.67 dvs9.00±0.00 d,P<0.001)，發育延緩的時期主要發生在4-5齡階段；0.02% dsNPF從5齡初開始處理，其5齡的發育歷期與對照相比平均延遲了4.00 d (7.33±0.33 dvs3.67±0.33 d,P<0.01) (表3)。

表3 0.02% dsNPF和dsGFP分別處理亞洲玉米螟1, 3和5齡初幼蟲后不同幼蟲齡期、蛹發育歷期和成蟲壽命Table 3 Developmental duration of different larval instars and pupae and adult life span after the early 1st, 3rd and5th instar larvae of Ostrinia furnacalis were fed with 0.02% dsNPF and dsGFP, respectively

綜合上述結果，NPF對幼蟲的發育具有重要的調節作用，npf的RNAi干擾嚴重影響了幼蟲發育的時間，主要表現在：1)相同RNAi濃度下，處理的幼蟲齡期越早，幼蟲死亡率越高，發育歷期越長；2)不同RNAi濃度下，處理濃度越高對發育歷期的影響越大，死亡率也越高。

2.2.6對幼蟲化蛹率的影響：用0.01% dsNPF分別飼喂亞洲玉米螟1, 3和5齡幼蟲，與飼喂0.01% dsGFP的對照組相比，處理組幼蟲化蛹率分別下降了27.03%, 18.92%和14.59%(圖6: A)。相同條件下用0.02%dsNPF分別飼喂1, 3和5齡幼蟲，其中飼喂1齡的幼蟲到5齡時死亡率已>90%，從3和5齡開始飼喂的幼蟲，與飼喂0.02% dsGFP的對照組相比，處理組幼蟲的化蛹率分別下降了39.20%和25.55%(圖6: B)。這些結果說明NPF對亞洲玉米螟幼蟲的化蛹有顯著影響，濃度越高影響越大。

圖6 0.01% (A)和0.02%(B) dsNPF處理對亞洲玉米螟化蛹率的影響Fig. 6 Impacts of 0.01% (A) and 0.02% (B) dsNPF on the pupation rate of Ostrinia frunacalis

2.3 NPF對亞洲玉米螟蛹的影響

2.3.1對蛹發育歷期的影響：dsRNA從亞洲玉米螟1齡幼蟲開始處理時，50%以上個體從蛹到成蟲所需時間，飼喂0.01% dsGFP的對照組為3.33±0.33 d，而飼喂0.01% dsNPF的處理組超過90%的個體死亡，不再具有可比性；從3齡幼蟲開始飼喂dsRNA時，50%以上個體從蛹期發育到成蟲所需時間，對照組為3.00 d，而dsNPF處理組為7.33±0.33 d，延遲了4.33 d(P<0.001)；從5齡幼蟲開始飼喂dsRNA時，50%的個體從蛹期發育到成蟲所需時間，處理組與對照組相比延遲了2.33 d(5.33±0.33 dvs3.00 d,P<0.01)(表2)。

0.02% dsNPF從3齡開始飼喂幼蟲，50%以上個體從蛹期發育到成蟲所需時間，飼喂0.02% dsGFP的對照組為3.67±0.33 d，0.02% dsNPF處理組超過90%的個體死亡，不再具有可比性。從5齡幼蟲開始飼喂dsRNA時，50%以上個體從蛹期發育到成蟲所需時間，飼喂0.02% dsNPF的處理組與飼喂0.02% dsGFP的對照組相比延遲了2 d(5.67±0.33 dvs3.67±0.33 d,P<0.05)(表3)。這些結果說明，NPF對蛹的發育有極其顯著的影響。

2.3.2對蛹羽化率的影響: 用0.01% dsNPF分別飼喂亞洲玉米螟1, 3和5齡幼蟲，其中飼喂的1齡幼蟲至5齡死亡率已>90%。與飼喂0.01% dsGFP的對照組相比，從3齡和5齡幼蟲開始飼喂0.01% dsNPF的處理組成蟲個體的羽化率分別下降了46.61%和15.95%(P<0.01)(圖7: A)。相同條件下0.02% dsNPF分別飼喂1, 3和5齡幼蟲，其中飼喂的1齡和3齡幼蟲至4齡和蛹期死亡率已>90%，不具有可比性。從5齡幼蟲開始飼喂0.01% dsNPF的處理組與飼喂0.01% dsGFP的對照組相比，羽化率下降了2.62%(圖7: B)。這些結果說明NPF對亞洲玉米螟羽化率有極其顯著的影響，處理幼蟲期的時間越早影響越大。

圖7 0.01% (A)和0.02%(B) dsNPF處理對亞洲玉米螟蛹羽化率的影響Fig. 7 Impacts of 0.01% (A) and 0.02% (B) dsNPF on the eclosion rate of Ostrinia frunacalis pupae

2.4 NPF對亞洲玉米螟成蟲的影響

2.4.1對成蟲壽命的影響：用0.01% dsNPF飼喂亞洲玉米螟1齡幼蟲，在蛹期死亡率超過了90%，不再具有可比性；用0.01% dsNPF飼喂3齡幼蟲，與飼喂0.01% dsGFP的對照相比成蟲約提前3 d死亡(8.00±0.58 dvs5.33±0.67 d,P<0.05)；用0.01%dsNPF飼喂5齡幼蟲，與0.01% dsGFP的對照相比成蟲提前3 d死亡(6.67±0.33 dvs3.33±0.33 d,P<0.01)(表2)。用0.02% dsNPF飼喂1齡和3齡幼蟲，它們分別在4齡幼蟲和蛹期個體死亡率高于90%，不再具有可比性；從5齡幼蟲開始飼喂0.02% dsNPF，與飼喂0.02%的對照相比成蟲提前4 d死亡(6.33±0.33 dvs2.33±0.67 d,P<0.01)(表3)。綜上所述，下調NPF對成蟲的壽命有顯著影響。

2.4.2對成蟲產卵的影響：用0.01% dsNPF飼喂1齡初幼蟲，羽化到到成蟲時雌蟲平均個體數僅有6頭，與飼喂0.01% dsGFP的對照相比, 成蟲單雌產卵量下降了92.70%(50.68±12.13vs3.70±2.42,P<0.05)；用0.01% dsNPF飼喂3齡初幼蟲，與飼喂0.01% dsGFP的對照相比，成蟲單雌產卵量下降了90.15%(44.69±7.37vs4.40±0.65,P<0.01)，而用0.01% dsNPF飼喂5齡初幼蟲，與飼喂0.01% dsGFP的對照相比，成蟲單雌產卵量下降了44.12%(41.48±9.33vs23.18±5.91,P>0.05)(圖8: A)。

用0.02% dsNPF飼喂1齡初幼蟲，羽化到成蟲時雌蟲平均個體數僅有1頭，不再具有可比性； 用0.02% dsNPF飼喂3齡初幼蟲，雌蟲平均個體數僅有8頭，與飼喂0.01% dsGFP的對照相比, 成蟲單雌產卵量下降了23.55%(36.60±6.10vs27.98±7.80，P>0.05)；用0.02%dsNPF飼喂5齡幼蟲，與飼喂0.02% dsGFP的對照相比，成蟲單雌產卵量下降了2.31%(63.11±4.56vs61.65±8.85,P>0.05)(圖8: B)。這些結果表明，dsNPF干擾對1齡和3齡開始處理的幼蟲其單雌產卵量有顯著的抑制作用。

圖8 0.01%(A)和0.02%(B) dsNPF對亞洲玉米螟成蟲單雌產卵量的影響Fig. 8 Effect of 0.01% (A) and 0.02% (B) dsNPF on the number of eggs laid per female by Ostrinia frunacalis adults

3 討論

NPF是一種多功能的神經肽，涉及取食、交配與產卵(Wielendaeleetal., 2013)，睡眠與生物鐘節律(Heetal., 2013a, 2013b)，學習行為(Krashesetal., 2009)，酒精敏感度(Wenetal., 2005)，攻擊行為(Dierick and Greenspan, 2007)，保幼激素的合成(Wangetal., 2012)和聚集/分散狀態(Houetal., 2017)等調控。其中重要的功能之一是對幼蟲取食的調控，充分了解NPF對亞洲玉米螟幼蟲取食調控和生長發育的影響，將為玉米螟的新型防治策略提供理論依據。

在本研究中，我們采用了一種新的基于工程菌大量生產dsRNA的方法替代傳統的試劑盒合成dsRNA，可以更經濟地獲得大量的dsRNA(圖1)，同時通過每天更換含有一定濃度dsRNA的飼料，保證個體在幼蟲取食階段均在dsRNA的有效干擾之下，使得研究NPF對亞洲玉米螟整個生活史的影響成為可能。

近年來，在果蠅的研究中發現，NPF協調攝食行為和發育過程，即NPF通過腦內的NPFR神經元調節攝食行為，同時通過前胸腺中的NPFR調節發育，從而協調攝食行為和發育。當敲低前胸腺中的NPFR表達時，僅果蠅幼蟲的個體大小發生差異，并未有取食量的降低(Kannangaraetal., 2020)，說明NPF調控的生長發育和取食行為是相互獨立的。本研究中，我們發現敲減npf基因表達對亞洲玉米螟幼蟲的取食、存活率、體重、體長，以及化蛹率和羽化率均產生很顯著的影響(圖2～8)，其中對取食量的影響(圖2)是十分重要的，取食量的降低直接導致生長發育的延緩(表2～3)，和死亡率的顯著提高(圖5)。

從本研究中可以看出，不同濃度的dsRNA、不同的處理階段均會對RNAi的效率產生影響，且處理的幼蟲期越早其效果越佳(圖2～8)。此外，0.01% dsNPF對亞洲玉米螟的生長發育就具有重要的影響，反映出NPF的重要性。已有文章報道，不同的條件會決定RNAi的效率，例如更高劑量的dsRNA可以通過激活RNAi機器(RNAi machinery)增強RNAi反應(Garbuttetal., 2013)；由于體型較小、發育更不完全，因此低齡幼蟲的RNAi效果會更佳(Araujoetal., 2006)。

CRISPR/Cas9最早于2012年被報道(Jineketal., 2012)。CRISPR表示有規律的成簇間隔短回文重復，Cas表示CRISPR相關核酸酶。該系統是細菌和真菌對病毒和質粒的適應性免疫過程中存在的一種RNA可編程的基因組編輯方法。該系統利用CRISPR RNAs (crRNAs)引導入侵核酸沉默。本研究的結果表明，從1齡開始飼喂dsNFP的幼蟲，其5齡幼蟲的平均死亡率高達92.5%(圖5)。因此，通過傳統方式構建亞洲玉米螟NPF的缺失突變體是不可行的，但是，近年來有文獻陸續報道了條件性CRISPR-Cas9技術，例如通過四環素(tetracycline)或四環素衍生物比如多西環素(doxycycline)調控的Tet-on和Tet-off系統與CRISPR-Cas9系統的結合(Zhangetal., 2019)；在植物中，還有通過熱激(Nandyetal., 2019)和光照(Polstein and Gersbach, 2015)誘導的CRISPR-Cas9技術等。以上技術均為我們后續深入研究NPF的功能及調控機制提供了有效的手段。