荻草谷網(wǎng)蚜唾液蛋白基因Sm13498的克隆及功能分析

付 裕, 王 倩, 張 勇, 陳巨蓮

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室, 北京 100193)

荻草谷網(wǎng)蚜Sitobionmiscanthi為我國小麥Triticumaestivum主產(chǎn)區(qū)麥蚜優(yōu)勢種(陳其湖和俞水炎, 1988)，一直被誤定為麥長管蚜Sitobionavenae(張廣學(xué), 1999)。在形態(tài)特征上，荻草谷網(wǎng)蚜與麥長管蚜的主要區(qū)別為：荻草谷網(wǎng)蚜的腹管長為尾片的1.40倍以上，后跗節(jié)Ⅱ短于喙節(jié)Ⅳ+Ⅴ的1.30倍，觸角節(jié)Ⅲ圓形次生感覺圈分布于近基部2/3(張廣學(xué), 1999)。同時，Jiang等(2019)首次報道了荻草谷網(wǎng)蚜的基因組組裝和解析工作，從分子水平上證明我國北方麥區(qū)的優(yōu)勢種蚜蟲為荻草谷網(wǎng)蚜。

培育和利用抗蟲品種是害蟲綠色防控的重要措施，但由于蚜蟲對小麥適應(yīng)性強，導(dǎo)致目前生產(chǎn)上缺少優(yōu)良抗蚜小麥品種資源。蚜蟲唾液蛋白在蚜蟲-植物互作中起著重要作用(Willetal., 2007)。Jones和Dangl(2006)曾提出了一個病原菌與植物競爭此消彼長的“Z字模型”(Zig-Zag Model)來解釋病原菌與寄主植物復(fù)雜的動態(tài)互作關(guān)系。在此理論模型中，植物可通過細(xì)胞表面的模式識別受體(pattern recognition receptors, PRRs)感知病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern, PAMPs)，從而引發(fā)植物免疫反應(yīng)(PAMP-triggered immunity, PTI)。為了成功定殖，病原菌可分泌效應(yīng)蛋白到寄主植物內(nèi)干擾PTI，導(dǎo)致效應(yīng)子引發(fā)的敏感(effector-triggered susceptibility, ETS)發(fā)生，但在長期進(jìn)化中一些植物可產(chǎn)生抗性基因(resistance gene, R gene)，其表達(dá)的抗性蛋白可識別效應(yīng)子，進(jìn)而引發(fā)效應(yīng)子觸發(fā)的免疫反應(yīng) (effector-triggered immunity, ETI)，由此進(jìn)一步阻止病原菌的侵染和擴(kuò)展。研究發(fā)現(xiàn)此模型也適用于解釋蚜蟲-植物間的互作關(guān)系，蚜蟲可通過針狀口器分泌唾液蛋白進(jìn)入植物體內(nèi)進(jìn)一步調(diào)節(jié)植物防御反應(yīng)(Hogenhout and Bos, 2011; Elzinga and Jander, 2013)。蚜蟲唾液中可誘導(dǎo)或抑制植物防御反應(yīng)的蛋白因子統(tǒng)稱為效應(yīng)子(Jaouannetetal., 2014)。

對于蚜蟲唾液蛋白效應(yīng)子篩選及功能研究主要有兩個途徑：(1)利用RNAi技術(shù)沉默潛在效應(yīng)子檢測對蚜蟲的影響；(2)在植物體內(nèi)過表達(dá)潛在效應(yīng)子檢測對植株防御反應(yīng)及蚜蟲的影響。Mutti等(2006, 2008)通過向豌豆蚜Acyrthosiphonpisum體內(nèi)注射siRNA，以及桃蚜Myzuspersicae取食含dsRNA的煙草植株，驗證了唾液蛋白C002對蚜蟲的寄主適應(yīng)性及取食起著重要作用。通過注射dsRNA沉默靶標(biāo)基因，從豌豆蚜唾液腺基因中鑒定到一些可參與誘導(dǎo)或抑制植物防御的效應(yīng)子，如ACE(angiotensin-converting enzyme)和Armet等(Wangetal., 2015a, 2015b)。借鑒病原菌效應(yīng)子篩選及功能基因組學(xué)方法，Bos等(2010)成功鑒定了蚜蟲效應(yīng)子。將48個桃蚜候選效應(yīng)子在本氏煙Nicotianabenthamiana中瞬時過表達(dá)，篩選出Mp10參與抑制及誘導(dǎo)植物的防御反應(yīng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Mp10通過參與SA及JA介導(dǎo)的信號通路誘導(dǎo)植物防御反應(yīng)(Rodriguezetal., 2014)。在擬南芥Arabidopsisthaliana中過表達(dá)Mp55可顯著增加桃蚜繁殖率，蚜蟲對Mp55過表達(dá)植株選擇性更強，利用RNAi技術(shù)將Mp55沉默后，蚜蟲繁殖率顯著下降，表明Mp55可促進(jìn)蚜蟲侵染，且可能參與抑制植株的防御反應(yīng)(Elzingaetal., 2014)。在本氏煙中過表達(dá)8個馬鈴薯長管蚜Macrosiphumeuphorbiae潛在效應(yīng)子，其中Me10及Me23可顯著提高桃蚜繁殖率，說明這兩個唾液蛋白作為潛在效應(yīng)子可能參與了抑制植株的防御反應(yīng)(Atamianetal., 2013)。

目前關(guān)于效應(yīng)子篩選及功能研究主要在豌豆蚜和桃蚜等模式昆蟲上，而對于麥蚜尤其是荻草谷網(wǎng)蚜唾液蛋白功能研究的相關(guān)報道較少。有研究通過酶活性測定方法在麥二叉蚜Schizaphisgraminum或荻草谷網(wǎng)蚜唾液中鑒定到多種蛋白酶類，并證實了蚜蟲唾液中的果膠酶及多酚氧化酶可誘導(dǎo)小麥的防御反應(yīng)(Liuetal., 2009; Maetal., 2010)。在前期研究中，我們通過二代轉(zhuǎn)錄組測序獲得了荻草谷網(wǎng)蚜唾液腺全轉(zhuǎn)錄組，并結(jié)合生物信息學(xué)以及組織表達(dá)特異性分析發(fā)現(xiàn)包括Sm13498(unigene名稱: cluster_13498_g1)在內(nèi)的表達(dá)豐度最高的前15個分泌蛋白都在唾液腺特異表達(dá)(Zhangetal., 2017)。利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在荻草谷網(wǎng)蚜水溶性唾液中也成功鑒定到Sm13498蛋白(Zhangetal., 2021)。為進(jìn)一步分析該唾液蛋白在蚜蟲-植物互作中的潛在功能，本研究中我們克隆了Sm13498基因，并分析其序列特征及其時空表達(dá)特性，進(jìn)而通過根癌農(nóng)桿菌Agrobacteriumtumefaciens介導(dǎo)的瞬時表達(dá)方法對其功能開展初步分析，為進(jìn)一步研究麥蚜唾液蛋白功能及蚜蟲-小麥互作分子機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx、質(zhì)粒和菌株

本實驗所用的荻草谷網(wǎng)蚜于2017年4月采自河北省廊坊市中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院中試基地小麥田，在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所溫室中的養(yǎng)蟲籠內(nèi)使用小麥(中麥175)進(jìn)行人工飼養(yǎng)。飼養(yǎng)溫度為20±1℃，相對濕度為65%～70%，光周期為16L∶8D。pSUC2T7M13ORI(pSUC2)載體、陽性對照pSUC2-Avr1b、陰性對照pSUC2-Mg87和釀酒酵母SaccharomycescerevisiaeYTK12由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所王忠躍研究員提供。 pGR107載體、pGR107-BAX、pGR107-INF1及根癌農(nóng)桿菌GV101和EHA105菌株本實驗室保留。

1.2 RNA提取及cDNA的合成

取10頭生長期一致且饑餓處理6 h的荻草谷網(wǎng)蚜無翅成蚜置于生態(tài)盒(2.5 cm×2.5 cm×2.5 cm)內(nèi)，在小麥(中麥175)葉片上取食6, 12, 24和48 h后分別收集生態(tài)盒內(nèi)所有成蚜，置于無RNase的1.5 mL離心管中，液氮迅速冷凍后保存于-80℃冰箱內(nèi)備用。使用TRIzol(Invitrogen, 美國)提取不同取食時間的荻草谷網(wǎng)蚜無翅成蚜的總RNA，通過超微量紫外可見光光度計DS-11(DeNovix, 美國)檢測濃度，并經(jīng)過2.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量。以1 μg總RNA為模板，按照EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(全式金生物技術(shù)有限公司, 北京)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA第1鏈。

1.3 Sm13498基因克隆

基于前期獲得的荻草谷網(wǎng)蚜唾液腺全轉(zhuǎn)錄組中的Sm13498(unigene名稱: cluster_13498_g1)序列(Zhangetal., 2017, 2021)，使用Primer Premier 5.0軟件(PREMIER Biosoft, 美國)設(shè)計擴(kuò)增Sm13498的ORF的PCR引物(表1)。PCR反應(yīng)體系(50 μL): 取1.2節(jié)中獲得的荻草谷網(wǎng)蚜成蟲cDNA模板1 μL, 上下游引物(10 mmol/L)各1 μL, 2×TransStart FastPfu PCR SuperMix 25 μL, ddH2O 22 μL。反應(yīng)條件: 95℃預(yù)變性2 min; 95℃變性20 s, 50℃退火20 s, 72℃延伸60 s, 40個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測并將條帶進(jìn)行膠回收。將回收的PCR產(chǎn)物連接到pEASY-Blunt克隆載體(全式金生物技術(shù)有限公司, 北京)中，轉(zhuǎn)入到大腸桿菌EscherichiacoliTrans-1-T1感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，用M13引物篩選陽性克隆送到博邁德公司(北京)進(jìn)行測序。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.4 序列生物信息學(xué)分析

利用OFR Finder(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)預(yù)測獲取Sm13498氨基酸序列；利用Expasy(https:∥web.expasy.org/compute_pi/)分析Sm13498 預(yù)測分子量和等電點；利用SignalP4.1 Server (http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測Sm13498信號肽序列；利用TMHMM 2.0 (http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)分析跨膜結(jié)構(gòu)域；利用Pfam(http:∥pfam.xfam.org/)預(yù)測功能結(jié)構(gòu)域，利用NLStradamus(http:∥www.Moseslab.csb.utoronto.ca/NLStradamus/)分析核定位信號。NCBI上利用Blast查找其他蚜蟲同源蛋白序列；利用Clustal Omega (https:∥www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)進(jìn)行序列比對；利用MEGA6軟件的鄰接法構(gòu)建荻草谷網(wǎng)蚜Sm13498和其他物種蛋白序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹，設(shè)置1 000次bootstraps進(jìn)行檢驗。

1.5 Sm13498在取食小麥葉片不同時間的荻草谷網(wǎng)蚜無翅成蚜中的相對表達(dá)量檢測

基于1.3節(jié)克隆的Sm13498序列使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計RT-qPCR引物(表1)。采用試劑盒TB Green Premix Ex Taq(TaKaRa, 大連)在實時熒光定量PCR儀ABI-7500(ABI, 美國)上進(jìn)行。qPCR反應(yīng)體系(20 μL): cDNA模板2 μL, 上下游引物(10 mmol/L)各0.5 μL, TB Green Premix 10 μL, ROXⅡ 0.4 μL, ddH2O 6.6 μL。反應(yīng)條件: 95℃預(yù)變性2 min; 95℃變性30 s, 60℃退火30 s, 40個循環(huán)。以荻草谷網(wǎng)蚜β-actin(GenBank登錄號： NM_001126200)和NADPH(GenBank登錄號： NM_001162323)為內(nèi)參基因(Yangetal., 2014)，引物序列見表1。取生態(tài)盒內(nèi)10頭處理后的無翅成蚜樣品為一個生物學(xué)重復(fù)，每個處理設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，每生物學(xué)重復(fù)樣品重復(fù)測定3次。

1.6 酵母分泌系統(tǒng)檢測信號肽功能

使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計含有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點Sm13498信號肽PCR引物(表1)。以1.2節(jié)中獲得的荻草谷網(wǎng)蚜成蟲cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系(50 μL): cDNA模板1 μL, 上下游引物(10 mmol/L)各1 μL, 2×TransStart FastPfu PCR SuperMix 25 μL, ddH2O 22 μL。反應(yīng)條件: 95℃預(yù)變性2 min; 95℃變性20 s, 60℃退火20 s, 72℃延伸60 s, 40個循環(huán); 72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物連接到pEASY-Blunt克隆載體中，轉(zhuǎn)入到大腸桿菌Trans-1-T1感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，用M13引物篩選陽性克隆送到博邁德公司進(jìn)行測序。用質(zhì)粒小提試劑盒(Axygen, 美國)提取測序正確的重組質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ將重組質(zhì)粒和pSUC2同時進(jìn)行雙酶切。利用凝膠回收試劑盒(Axygen, 美國)回收目的片段。將目的片段通過T4 DNA連接酶于16℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選出陽性重組質(zhì)粒pSUC2-Sm13498。

采用酵母轉(zhuǎn)化試劑盒Frozen-EZ Yeast Transformation IITMKit(Zymo Research, 美國)將酵母菌株YTK12制備成酵母感受態(tài)細(xì)胞，將重組質(zhì)粒pSUC2-Sm13498、陽性對照pSUC2-Avr1b和陰性對照pSUC2-Mg87轉(zhuǎn)化到Y(jié)TK12中，在具有 pSUC2重組菌株篩選作用的CMD-W培養(yǎng)基(6.7 g YNB, 0.75 g Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplement, 20 g蔗糖, 20 g瓊脂, 1 000 mL去離子水)培養(yǎng)2～3 d。挑取驗證正確的酵母菌株在CMD-W液體培養(yǎng)基30℃ 250 r/min進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)48 h。在為所有菌株提供營養(yǎng)物質(zhì)的YPDA(YPDA 50 g, 瓊脂20 g, 1 000 mL去離子水)、CMD-W和具有信號肽功能鑒定作用的YPRAA(酵母提取物10 g，蛋白胨20 g，棉籽糖20 g，瓊脂20 g，1 000 mL去離子水)的培養(yǎng)基平板中央滴加20 μL OD600=0.6的含有pSUC2-Sm13498, pSUC2-Avr1b和pSUC2-Mg87質(zhì)粒的YTK12菌株，倒放置培養(yǎng)箱中，30℃培養(yǎng)2～4 d。取1 mL菌液放于含2 mL 5%蔗糖(過濾滅菌)溶液的15 mL離心管中，震蕩混勻。加入1% 2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride, TTC)(索萊寶科技有限公司, 北京)溶液(現(xiàn)用現(xiàn)配或避光保存)，使其終濃度為0.1%，避光水浴35℃ 30 min，邊孵育邊觀察，室溫放置5 min。通過菌落的生長情況和溶液顏色變化來驗證Sm13498信號肽的分泌活性。

1.7 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化本氏煙瞬時表達(dá)Sm13498

使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計含有SalⅠ和SmaⅠ酶切位點的擴(kuò)增Sm13498全長序列和去除N端信號肽序列的片段Sm13498-sp的PCR引物(表1)，進(jìn)行PCR，反應(yīng)體系(50 μL): 取1.2節(jié)中獲得的荻草谷網(wǎng)蚜成蟲cDNA模板1 μL，上下游引物(10 mmol/L)各1 μL, 2×TransStart FastPfu PCR SuperMix 25 μL, ddH2O 22 μL。通過雙酶切再連接到pGR107載體中，轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌GV3101菌株。將根癌農(nóng)桿菌的重組菌株用含卡那霉素(50 μg/mL)和利福平(50 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)過夜后，4 000 g離心收獲菌體，在浸潤緩沖液[10 mmol/L 2-(N-嗎啉)乙磺酸、20 mmol/L乙酰丁香酮、10 mmol/L MgCl2]中重懸至OD600=0.3。室溫黑暗保存3 h，用1 mL不帶針的注射器將懸浮液浸潤到本氏煙(4周齡)葉片中。在本氏煙上分別注射包含pGR107-GFP(本實驗室所構(gòu)建并保存), pGR107-Sm13498和pGR107-Sm13498-sp根癌農(nóng)桿菌24 h，然后在對相應(yīng)位置上分別注射含Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein, BAX)的pGR107-BAX和含晚疫霉Phytophthorainfestans中可誘導(dǎo)植物超敏反應(yīng)的激發(fā)子INF1(Kamounetal., 1993)的pGR107-INF1，5 d后觀察葉片表型，并將葉片置于脫色液(乙醇∶乙酸=6∶1， v/v)中至完全脫色后拍照。

1.8 Sm13498蛋白的煙草亞細(xì)胞定位

使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計含有Eco31Ⅰ酶切位點去除N端信號肽的Sm13498 PCR引物(表1)，進(jìn)行PCR，反應(yīng)體系(50 μL): 取1.2節(jié)中獲得的荻草谷網(wǎng)蚜成蟲cDNA模板1 μL, 上下游引物(10 mmol/L)各1 μL, 2×TransStart FastPfu PCR SuperMix 25 μL, ddH2O 22 μL。反應(yīng)程序: 95℃預(yù)變性2 min; 95℃變性20 s, 65℃退火20 s, 72℃延伸60 s, 40個循環(huán); 72℃延伸10 min。通過克隆連接到C端融合TagGFP的pBWA(V)HS-GLosgfp(作為對照組，本實驗室保存)載體中，構(gòu)建pBWA(V)HS-GLosgfp-Sm13498，轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌EHA105菌株。28℃培養(yǎng)過夜后，4 000 g離心收獲菌體，在與1.7節(jié)相同的浸潤緩沖液中重懸至OD600=0.3。室溫保存4～6 h，用1 mL不帶針的注射器將懸浮液浸潤到本氏煙(4周齡)葉片中。4 d后，用蔡司LSM 880激光共聚焦顯微鏡(Zeiss, Jena, 德國)收集浸潤的葉片并觀察。GFP和葉綠素的自熒光分別在561和488 nm處被激發(fā)，在586-647和680-700 nm處采集。實驗重復(fù)進(jìn)行3次。

1.9 數(shù)據(jù)分析

采用2-ΔΔCt法計算Sm13498基因在取食不同時間的蚜蟲體內(nèi)的相對表達(dá)量變化(Livak and Schmittgen, 2001)，以0 h時的基因表達(dá)量作為對照，基因表達(dá)量以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)表示。所有數(shù)據(jù)采用SPSS20(IBM)軟件中Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較，顯著性差異水平設(shè)置為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 Sm13498基因克隆及序列特征

擴(kuò)增獲得荻草谷網(wǎng)蚜Sm13498開放閱讀框(ORF)(GenBank登錄號: MW346655)，序列全長783 bp，編碼260個氨基酸，預(yù)測分子量為28.01 kD，第1-22位氨基酸為N端信號肽序列，ORF中含有1個半胱氨酸，無功能結(jié)構(gòu)域，無跨膜結(jié)構(gòu)域和核定位信號。

序列比對結(jié)果表明(圖1)，Sm13498與豌豆蚜功能未注釋蛋白LOC100159087 precursor(GenBank登錄號: NP_001313548.1)氨基酸序列一致性為71.7%，與桃蚜未注釋蛋白LOC111028600(GenBank登錄號: XP_022163007.1)氨基酸序列一致性為60.9%。通過MEME分析，Sm13498、豌豆蚜LOC100159087 precursor(GenBank登錄號: NP_001313548.1)和桃蚜LOC111028600(GenBank登錄號: XP_022163007.1)這3個蛋白共預(yù)測得到5個motif(選擇較為準(zhǔn)確得分較高的前2個motif在圖1中進(jìn)行標(biāo)注展示)，其中E值最高為9.0e-039的motif1定位在第77-126位氨基酸的位置，E值為4.7e-030的motif2定位在第162-219位氨基酸的位置。 系統(tǒng)發(fā)育樹表明，荻草谷網(wǎng)蚜Sm13498與豌豆蚜的未注釋功能蛋白LOC100159087 precursor(GenBank登錄號: NP_001313548.1)親緣關(guān)系最近，與麥雙尾蚜Diuraphisnoxia的未注釋功能蛋白LOC107172580(GenBank登錄號: XP_015378361.1)親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，氨基酸序列一致性為45.74%。荻草谷網(wǎng)蚜Sm13498與豌豆蚜LOC100159087 precursor以及桃蚜LOC111028600在同一分支上(圖2)。

圖1 荻草谷網(wǎng)蚜Sm13498與其他昆蟲唾液蛋白的氨基酸序列比對Fig. 1 Amino acid sequence alignment of Sm13498 of Sitobion miscanthi with salivary proteins of other insects蛋白來源物種及GenBank登錄號Origin species of proteins and their GenBank accession numbers: Sm13498: 荻草谷網(wǎng)蚜 Sitobion miscanthi, MW346655; LOC100159087 precursor: 豌豆蚜Acyrthosiphon pisum, NP_001313548.1; LOC111028600: 桃蚜Myzus persicae, XP_022163007.1.

圖2 基于氨基酸序列的荻草谷網(wǎng)蚜Sm13498和其他昆蟲唾液蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree of Sm13498 of Sitobion miscanthi and salivary proteins of other insects based on amino acid sequences使用MEGA 6軟件的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，設(shè)置1 000次bootstraps進(jìn)行檢驗。The phylogenetic tree was constructed using the neighbor-joining method of MEGA 6 with 1 000 bootstrap replicates. 蛋白來源物種及GenBank登錄號Origin species of proteins and their GenBank accession numbers: Sm13498: 荻草谷網(wǎng)蚜 Sitobion miscanthi, MW346655; LOC100159087 precursor: 豌豆蚜Acyrthosiphon pisum, NP_001313548.1; LOC111028600: 桃蚜Myzus persicae, XP_022163007.1; AGLY_001142: 大豆蚜Aphis glycines, KAE9545599.1; LOC114130459: 棉蚜 Aphis gossypii, XP_027851238.1; FWK35_00017591: 苜蓿蚜Aphis craccivora, KAF0755754.1; LOC112598442: 高粱蚜 Melanaphis sacchari, XP_025200691.1; LOC113552996: 玉米縊管蚜Rhopalosiphum maidis, XP_026811885.1; LOC107172580: 麥雙尾蚜 Diuraphis noxia, XP_015378361.1.

2.2 Sm13498在取食小麥葉片不同時間的荻草谷網(wǎng)蚜無翅成蚜中的相對表達(dá)量

結(jié)果(圖3)表明，荻草谷網(wǎng)蚜無翅成蚜在取食小麥葉片的不同時間內(nèi)，Sm13498均有表達(dá)，取食6, 12, 24和48 h表達(dá)量分別是對照組的1.39, 1.68, 1.35和1.34倍，其中在取食12 h時表達(dá)量達(dá)到最高，且顯著高于在其他取食時間的表達(dá)量(F4,10=2.416,P<0.05)。

圖3 Sm13498基因在取食小麥葉片不同時間的荻草谷網(wǎng)蚜無翅成蚜中的相對表達(dá)量Fig. 3 Relative expression levels of Sm13498 inapterous adults of Sitobion miscanthi feedingon Triticum aestivum leaves for different time圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；以0 h時的基因表達(dá)量作為對照，柱上不同字母表示不同取食時間基因表達(dá)量差異顯著(P<0.05, Duncan氏新復(fù)極差法)。Data in the figure are mean±SE. The gene expression level at 0 h was used as the control. Different letters above bars indicate significant difference in the gene expression level among different feeding time points (P<0.05, Duncan’s new multiple range test).

2.3 Sm13498信號肽功能

在YPDA培養(yǎng)基中，含pSUC2-Sm13498, pSUC2-Avr1b和pSUC2-Mg87重組酵母菌株YTK12以及野生型YTK12均可以正常生長；在缺少色氨酸的CMD-W培養(yǎng)基中，由于野生型YTK12缺少pSUC2質(zhì)粒無法生長；攜帶pSUC2-Sm13498和pSUC2-Avr1b的YTK12酵母菌株，能在以棉籽糖為唯一碳源的YPRAA培養(yǎng)基上生長，說明陽性對照Avr1b與 Sm13498信號肽都具有活性，可以與SUC2融合后能夠使蔗糖酶正常分泌到胞外，從而將棉籽糖分解為酵母可直接利用的單糖。pSUC2-Mg87信號肽不具備分泌活性，與野生型YTK12菌株一樣不能將合成蔗糖酶分泌到細(xì)胞外，因此不能在YPRAA培養(yǎng)基上正常生長(圖4)。

攜帶pSUC2-Sm13498和pSUC2-Avr1b的YTK12酵母菌株可以分泌蔗糖酶能把蔗糖水解成單糖，單糖則與無色的2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)反應(yīng)產(chǎn)生暗紅色且不溶于水的氯化三苯基四氮唑(triphenylformazan, TTF)。野生型YTK12和pSUC2-Mg87不能分泌蔗糖酶，無法與TTC發(fā)生顯色反應(yīng)(圖4)。

圖4 酵母表達(dá)系統(tǒng)中荻草谷網(wǎng)蚜Sm13498信號肽活性鑒定Fig. 4 Identification of the signal peptide activity of Sm13498 of Sitobion miscanthi in yeast expression system在YPDA培養(yǎng)基中，pSUC2-Sm13498, pSUC2-Avr1b和pSUC2-Mg87重組酵母菌株YTK12以及野生型YTK12可以正常生長；在CMD-W培養(yǎng)基中，由于缺少pSUC2質(zhì)粒，野生型YTK12無法生長；攜帶pSUC2-Sm13498和pSUC2-Avr1b的YTK12能在以棉籽糖為唯一碳源的YPRAA培養(yǎng)基上生長，無色的2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)被還原為暗紅色且不溶于水的氯化三苯基四氮唑(TTF)；pSUC2-Mg87信號肽不具備分泌活性，含pSUC2-Mg87的菌株與野生型YTK12一樣不能在YPRAA培養(yǎng)基上正常生長。The YTK12 strains containing pSUC2-Sm13498, pSUC2-Avr1b and pSUC2-Mg87 and the wild-type YTK12 could grow normally on YPDA medium. The wild-type YTK12 could not grow on CMD-W medium due to the lack of pSUC2 plasmid. YTK12 carrying pSUC2-Sm13498 and pSUC2-Avr1b could grow on YPRAA medium with raffinose as the only carbon source, and catalyze the conversion of colorless 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) to the insoluble dark-red-colored triphenylformazan (TTF). The signal peptide of pSUC2-Mg87 had no secreting activity and the strain containing pSUC2-Mg87 could not grow normally on YPRAA medium as the wild-type YTK12.

2.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)Sm13498在本氏煙中抑制細(xì)胞壞死的功能及亞細(xì)胞定位

在單獨注射pGR107-GFP和MgCl2的位點葉片沒有出現(xiàn)組織壞死；在分別單獨注射pGR107-Sm13498和pGR107-Sm13498-sp的位點也無組織壞死，說明唾液蛋白Sm13498本身不會引起細(xì)胞死亡。分別注射pGR107-BAX和pGR107-INF1能夠引起葉片的壞死反應(yīng)，pGR107-GFP不能抑制BAX和INF1引起的壞死，但分別注射pGR107-Sm13498和pGR107-Sm13498-sp24 h后，再次pGR107-BAX和pGR107-INF1不會引起葉片的壞死反應(yīng)(圖5)。結(jié)果表明Sm13498有效抑制BAX和INF1引發(fā)程序性細(xì)胞死亡。

圖5 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)荻草谷網(wǎng)蚜Sm13498在本氏煙中瞬時表達(dá)Fig. 5 Transient expression of Sm13498 of Sitobion miscanthi in Nicotiana benthamiana mediated by Agrobacterium tumefaciens左圖示意右圖中各圓圈對應(yīng)的處理。The left figure shows the corresponding treatments for circles in the right figure. Sm13498-sp: 去除N端信號肽Removal of N-terminal signal peptide; BAX: Bcl-2相關(guān)X蛋白Bcl-2-associated X protein; INF1: 晚疫霉Phytophthora infestans中可誘導(dǎo)植物超敏反應(yīng)的激發(fā)子Host-specific elicitor of Phytophthora infestans to induce the plant hypersensitivity. GFP+BAX/INF1: 注射pGR107-GFP 24 h后再注射pGR107-BAX/INF1 (Injection of pGR107-BAX/INF1 after 24 h of injection of pGR107-GFP); Sm13498+BAX/INF1: 注射pGR107-Sm13498 24 h后再注射pGR107-BAX/INF1 (Injection of pGR107-BAX/INF1 after 24 h of injection of pGR107-Sm13498); Sm13498-sp+BAX/INF1: 注射pGR107-Sm13498-sp 24 h后再注射pGR107-BAX/INF1 (Injection of pGR107-BAX/INF1 after 24 h of injection of pGR107-Sm13498-sp). 注射MgCl2和pGR107-GFP為對照組。Injections of MgCl2and pGR107-GFP were set as the control groups, respectively. 右側(cè)照片為左側(cè)葉片脫色處理后的照片。The right photo is the photo of the left leaf post decolorization treatment.

通過共聚焦顯微鏡觀察(圖6)顯示，pBWA(V)HS-GLosgfp對照組在本氏煙葉片的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均顯示出熒光; Sm13498-GFP融合蛋白組的熒光只出現(xiàn)在細(xì)胞的質(zhì)膜上，初步表明Sm13498定位在本氏煙葉片細(xì)胞膜。

圖6 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)荻草谷網(wǎng)蚜Sm13498在本氏煙葉片中的亞細(xì)胞定位Fig. 6 Subcellular localization of Sm13498 of Sitobion miscanthi in Nicotiana benthamiana leaves mediatedby Agrobacterium tumefaciensFluorescence: 熒光觀察Observation of fluorescence; Chloroplast: 葉綠體觀察Observation of chloroplast; Bright field: 明場Bright field; Merged: 前3張圖片融合Fusion of the former three pictures. 標(biāo)尺Scale bars=20 μm.

3 討論

在前期研究中，我們通過轉(zhuǎn)錄組及蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)成功鑒定到一個表達(dá)豐度高且在荻草谷網(wǎng)蚜唾液腺特異表達(dá)的唾液蛋白，并將其命名為Sm13498(Zhangetal., 2017, 2021)。為進(jìn)一步探究Sm13498在蚜蟲-寄主互作中的潛在功能，本研究首先通過基因克隆驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中Sm13498序列的完整性與真實性，擴(kuò)增得到該基因ORF全長序列，其編碼260個氨基酸，N端具有分泌蛋白特有的信號肽序列，氨基酸序列中含有1個半胱氨酸，無功能結(jié)構(gòu)域，無跨膜結(jié)構(gòu)域和核定位信號，符合效應(yīng)蛋白基本的序列特征。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果表明，Sm13498與豌豆蚜未注釋功能蛋白LOC100159087 precursor(GenBank登錄號: NP_001313548.1)氨基酸序列相似性較高，且親緣關(guān)系最近(圖2)。

在病原菌侵染寄主過程中，其相關(guān)分泌蛋白的基因表達(dá)量是否顯著升高，成為篩選潛在效應(yīng)子的重要指標(biāo)之一(Yangetal., 2020)。本研究以此病原菌篩選效應(yīng)子的模式為參考，以取食0 h的荻草谷網(wǎng)蚜為對照，通過RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)Sm13498在荻草谷網(wǎng)蚜各個取食時間均有所表達(dá)，在取食12 h時表達(dá)量達(dá)到峰值且顯著高于在其他取食時間的表達(dá)量(圖3)。有研究表明，蚜蟲取食12 h后可誘導(dǎo)小麥葉片內(nèi)大量防御相關(guān)基因表達(dá)(趙麗艷, 2006)，因此Sm13498蛋白可能參與調(diào)節(jié)寄主植物的早期防御反應(yīng)。Sm13498基因在蚜蟲取食過程中的高表達(dá)及其在唾液腺組織特異表達(dá)模式，表明該唾液蛋白可能在荻草谷網(wǎng)蚜取食及其與寄主互作中發(fā)揮重要作用。

信號肽一般位于分泌蛋白的N端，并與蛋白質(zhì)的分泌特性有關(guān)(韋雪芳等, 2006)。效應(yīng)子只有被病原菌或者昆蟲分泌到植物組織或細(xì)胞內(nèi)，才能與寄主植物內(nèi)的互作蛋白結(jié)合，從而調(diào)節(jié)植物防御反應(yīng)或其他生理過程，因此具有分泌活性的N端信號肽也為效應(yīng)蛋白的結(jié)構(gòu)特征之一。Sm13498序列N端1-22氨基酸為預(yù)測信號肽，為進(jìn)一步驗證其具有分泌活性，本研究利用酵母分泌系統(tǒng)對Sm13498的信號肽序列進(jìn)行功能鑒定。結(jié)果顯示，含有Sm13498信號肽序列的酵母菌株可以在只含有棉籽糖的YPRAA培養(yǎng)基上生長，并使TTC顯色，證實了其信號肽序列能夠使缺陷型酵母重新分泌蔗糖酶(圖4)。這表明Sm13498的信號肽具有分泌活性，從而推斷Sm13498蛋白可能被分泌到細(xì)胞外來執(zhí)行生物學(xué)功能。Chaudhary等(2015)通過人工飼料飼喂馬鈴薯的蚜蟲以收集唾液蛋白，并通過蛋白質(zhì)組技術(shù)鑒定到Sm13498同源蛋白。Zhang等(2020)利用類似方法在荻草谷網(wǎng)蚜唾液蛋白中鑒定到Sm13498蛋白，進(jìn)一步說明Sm13498可被蚜蟲分泌到體外。但是，有研究表明，用于收集蚜蟲唾液蛋白的人工飼料成分、蚜蟲數(shù)量等因素會直接影響唾液蛋白組分(Milesetal., 1999; Bosetal., 2010)，因此后續(xù)仍需通過Western blot或者免疫共定位等技術(shù)直接證實Sm13498可被荻草谷網(wǎng)蚜分泌到小麥組織內(nèi)。

亞細(xì)胞定位可以提供效應(yīng)子或唾液蛋白在細(xì)胞上的具體存在部位，為后續(xù)蛋白作用位點及功能研究提供重要信息。馬鈴薯長管蚜唾液蛋白Me10(Chaudharyetal., 2019)以及禾谷縊管蚜Rhopalosiphumpadi唾液蛋白Rp1與Rp58(Escudero-Martinezetal., 2020)均定位在本氏煙葉片的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核上，而桃蚜唾液蛋白MpC002定位于煙草細(xì)胞膜中(Bosetal., 2010)。本研究通過類似方法確定了荻草谷網(wǎng)蚜唾液蛋白Sm13498定位在本氏煙葉片表皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上(圖6)，說明其作用位點或者靶標(biāo)蛋白可能存在于寄主細(xì)胞膜上。相比于對照組GFP，Sm13498- GFP融合蛋白在熒光信號較弱，推測可能Sm13498在煙草細(xì)胞中轉(zhuǎn)化率較低。不同蚜蟲唾液蛋白在細(xì)胞中的定位不同，這也表明蚜蟲唾液蛋白在寄主植株中作用位點或作用方式的多樣性。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達(dá)方法可實現(xiàn)對病原菌、蚜蟲及其他昆蟲的效應(yīng)蛋白的高通量鑒定及功能分析(Wangetal., 2011)。在煙草中瞬時過表達(dá)小鼠Bcl-2 家族的促凋亡因子(Boumelaetal., 2009)及馬鈴薯晚疫霉激發(fā)子INF1(Kamounetal., 1993)，可觸發(fā)程序性細(xì)胞死亡，出現(xiàn)類似于植物防御相關(guān)的過敏性壞死反應(yīng)(hypersensitive response, HR)，而且能夠激發(fā)寄主植物相關(guān)抗病蛋白的表達(dá)(Lacomme and Santa Cruz, 1999)。因此，在煙草葉片中過表達(dá)病原菌分泌蛋白或昆蟲唾液蛋白，并觀察對BAX或INF1誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的抑制作用，可推斷該蛋白是否具有抑制植物防御反應(yīng)的功能活性。在本研究中，Sm13498以及去除N端信號肽的Sm13498片段均可以抑制由BAX和INF1誘導(dǎo)的煙草細(xì)胞死亡(圖5)，初步說明唾液蛋白Sm13498可抑制寄主植物的防御反應(yīng)，但Sm13498的具體功能仍需要進(jìn)行后續(xù)實驗來進(jìn)一步驗證。