東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)一新型孢壁蛋白的基因克隆、表達(dá)及亞細(xì)胞定位

熊 亮, 敖塘堰, 張 真, 馬振剛, 周澤揚(yáng)

(重慶師范大學(xué), 重慶市動(dòng)物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶市媒介昆蟲(chóng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶 401331)

微孢子蟲(chóng)是一類專性細(xì)胞內(nèi)寄生的單細(xì)胞真核生物，廣泛存在于自然界中包含無(wú)脊動(dòng)物與脊椎動(dòng)物在內(nèi)的所有宿主中(Snowden, 2004; Weiss and Becnel, 2014)。目前約1 500種微孢子蟲(chóng)被鑒定，在今后隨著新的宿主被發(fā)現(xiàn)，越來(lái)越多的微孢子蟲(chóng)被發(fā)現(xiàn)和鑒定(Schotteliusetal., 2000; Keeling and Fast, 2002; Baki and Bekircan, 2018)。蜜蜂微孢子蟲(chóng)Nosemaapis早在1909年時(shí)被發(fā)現(xiàn)(Grobov and Ziuman, 1972)；熊蜂微孢子蟲(chóng)Nosemabombi(Fantham and Porter, 1914)、東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)Nosemaceranae(Friesetal., 1996)先后也被鑒定出來(lái)；Ptaszyńska等(2014)對(duì)蜜蜂微孢子蟲(chóng)和東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析表明兩種微孢子蟲(chóng)具有不同的外部特征(Ptaszyńskaetal., 2014)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，西方蜜蜂Apismellifera能夠被東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)所感染(Higesetal., 2006, 2007)。目前，對(duì)于微孢子蟲(chóng)的致病性分子機(jī)制研究較多，其中有研究指出在蜜蜂微孢子蟲(chóng)極管蛋白3以及NCER_101456和NCER_100157等蛋白基因的有效沉默對(duì)蜜蜂有改善生理和壽命延長(zhǎng)的作用(Rodríguez-Garcíaetal., 2018; Kimetal., 2020)。

微孢子蟲(chóng)宿主范圍廣、種類多以及細(xì)胞類型特異性差異大，但入侵宿主的機(jī)制相似(Franzenetal., 2006)，感染過(guò)程包括從休眠的孢子彈出極管穿透宿主細(xì)胞膜并且從孢子內(nèi)將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中形成新的孢子(Williams, 2009)。微孢子蟲(chóng)的孢壁不僅參與這一過(guò)程，在微孢子蟲(chóng)侵染宿主的細(xì)胞時(shí)黏附、入侵、感染等活動(dòng)中起著重要的作用(Lietal., 2012)，對(duì)孢壁蛋白進(jìn)行分離鑒定以及生物功能的研究意義重大。目前，在家蠶微孢子蟲(chóng)Nosemabombycis中SWP1, SWP2, SWP3, SWP5, SWP11, SWP12和SWP26等10個(gè)孢壁蛋白被鑒定出來(lái), 其中SWP11和SWP26參與孢子的形成與黏附，SWP5不僅是構(gòu)成微孢子蟲(chóng)的一種孢壁蛋白，還存在與極管蛋白之間的相互作用(Lietal., 2009; Lietal., 2012; Chenetal., 2013; Zhuetal., 2013; Yangetal., 2014a; Wangetal., 2015, 2017)；來(lái)源于兔腦炎微孢子蟲(chóng)Encephalitozooncuniculi中的4個(gè)孢壁蛋白EcSWP1, EcSWP2, EcSWP3和EnP1也被鑒定到(Bohneetal., 2000; Haymanetal., 2001; Xuetal., 2006; Southernetal., 2007)，且EcSWP1可為作為兔腦炎微孢子蟲(chóng)臨床診斷的選擇性抗原(Mengetal., 2014)；腸腦炎微孢子蟲(chóng)Encephalitozoonintestinalis中的SWP1和SWP2能夠定位在孢子內(nèi)壁和外壁，參與到孢子壁的構(gòu)成(Haymanetal., 2001)；蝗蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)Antonosporalocustae中的孢壁蛋白AlocSWP2在孢子形成過(guò)程中行使功能(Chenetal., 2017)；EhSWP1在蝦肝腸胞蟲(chóng)Enterocytozoonhepatopenaei中可以作為孢子侵染宿主過(guò)程中重要的媒介蛋白來(lái)介導(dǎo)孢子結(jié)合至宿主細(xì)胞表面的肝素(Jaroenlaketal., 2018)。總的來(lái)講，微孢子蟲(chóng)孢壁蛋白不僅參與微孢子蟲(chóng)的孢壁的構(gòu)成，還在信號(hào)傳導(dǎo)、宿主黏附和介導(dǎo)極管發(fā)芽等方面具有重要的生物學(xué)作用(Haymanetal., 2005; Huangetal., 2007; Lietal., 2009)。

東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)對(duì)蜜蜂的生存及蜂產(chǎn)品的生產(chǎn)危害巨大，對(duì)我國(guó)的蜜蜂養(yǎng)殖業(yè)乃至世界蜜蜂養(yǎng)殖業(yè)造成了不可估量的經(jīng)濟(jì)損失。為了分析東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢壁蛋白在侵染宿主中行使的功能，本研究以團(tuán)隊(duì)前期質(zhì)譜鑒定獲得的東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)候選孢壁蛋白AAJ76_1400036761為研究對(duì)象，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行原核表達(dá)并以重組表達(dá)蛋白為抗原制備多克隆抗體，對(duì)其亞細(xì)胞定位進(jìn)行深入的研究。對(duì)孢壁蛋白AAJ76_1400036761開(kāi)展系統(tǒng)深入的研究，有助于揭示微孢子蟲(chóng)孢壁蛋白與孢子侵染的關(guān)系，可為了解微孢子蟲(chóng)侵染機(jī)制及建立行之有效的東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)診斷和防治措施奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的分離和純化

取健康成年西方蜜蜂Apismellifera，按每頭蜜蜂添食105個(gè)東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)，感染第20天后取蜜蜂中腸，用滅菌后的研缽研磨成勻漿、紗布過(guò)濾；濾液以300 r/min進(jìn)行離心，獲得的上清再經(jīng)3 000 r/min離心收集沉淀；用滅菌水重懸沉淀后再次重復(fù)上述差速離心過(guò)程；經(jīng)過(guò)5次重復(fù)差速離心后上清以3 000 r/min離心，收集的沉淀經(jīng)適量滅菌超純水復(fù)懸。將上述獲得的微孢子蟲(chóng)在12 000 r/min離心30 min的條件下，在濃度為100%, 75%, 50%和25% Percoll溶液中進(jìn)行密度梯度離心，收集底部純化的蜜蜂微孢子蟲(chóng)。最后用滅菌的0.01 mol/L PBS溶液清洗孢子3次，經(jīng)3 000 r/min離心5 min后的沉淀保存于含終濃度為1 000 U/mL的鏈霉素和氨芐青霉素的滅菌超純水中，置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 載體菌株和主要試劑

原核表達(dá)載體pCold Ⅱ由重慶師范大學(xué)媒介昆蟲(chóng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌Eescherichiacoli克隆菌株DH5α和表達(dá)菌株Rosetta (DE3)購(gòu)于北京博邁德生物技術(shù)有限公司。蛋白胨、酵母粉、瓊脂粉、NaCl、β-巰基乙醇、甘氨酸、尿素和吐溫20購(gòu)自上海生工生物；ECL Marker購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；PAGE凝膠快速制備試劑盒、蛋白marker購(gòu)自上海雅生物科技有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于北京博邁德生物技術(shù)有限公司；Alexa Fluor 488熒光標(biāo)記羊抗鼠二抗、多聚賴氨酸、DAPI、HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗購(gòu)自Thermo Scientific公司；PCR酶(Premix ExTaq),SalⅠ,BamH Ⅰ和Solution Ⅰ連接試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；Ni-NAT預(yù)裝His親和層析柱購(gòu)自Qiagen公司；免疫電鏡專用固定液A液和B液均購(gòu)自Servicebio公司；10 nm膠體金顆粒標(biāo)記羊抗鼠二抗購(gòu)自Sigma公司。

1.3 東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢壁蛋白AAJ76_1400036761的序列特征分析

將團(tuán)隊(duì)前期質(zhì)譜鑒定獲得的東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)候選孢壁蛋白的質(zhì)譜數(shù)據(jù)與MicrosporidiaDB(https:∥microsporidiadb.org/micro/app)數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)，并下載獲得AAJ76_1400036761蛋白序列及對(duì)應(yīng)的編碼基因序列，將其在GenBank中進(jìn)行BLASTP序列比對(duì)以完成序列驗(yàn)證。采用在線分析序列特征，其中包括：分子量/等電點(diǎn)預(yù)測(cè)，ExPASy(https:∥web.expasy.org/compute_pi/)；疏水性分析，ProtParam(http:∥web.expasy.org/protparam/)；信號(hào)肽預(yù)測(cè)，SignalP 5.0 (http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)；跨膜域分析，TMHMM Server v2.0(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)；磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)， NetPhos(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)；O-糖基化位點(diǎn)分析，NetOGlyc(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)；蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，PSIPRED Server(http:∥bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)；為了進(jìn)一步研究 AAJ76_140036761的系統(tǒng)進(jìn)化情況，以及在其他微孢子蟲(chóng)中同源基因和基因座位之間位置的保守性，利用來(lái)自于東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)、家蠶微孢子蟲(chóng)Nosemabombycis、兔腦炎微孢子蟲(chóng)Encephalitozooncuniculi、蝦肝腸胞蟲(chóng)Enterocytozoonhepatopenaei、腸腦炎微孢子蟲(chóng)Encephalitozoonintestinalis、海倫腦炎微孢子蟲(chóng)Encephalitozoonhellem、比氏腸胞蟲(chóng)Enterocytozoonbieneusi、北美蝗蟲(chóng)腦炎微孢子蟲(chóng)Encephalitozoonromaleae、肌炎微孢子蟲(chóng)Anncaliiaalgerae、結(jié)膜炎微孢子蟲(chóng)Vittaformacorneae等微孢子蟲(chóng)基因組數(shù)據(jù)及相關(guān)序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析和基因座位共線性分析MicrosporidiaDB(https:∥microsporidiadb.org/micro/app/search/transcript/UnifiedBlast)。

1.4 東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢壁蛋白AAJ76_1400036761基因的克隆與原核表達(dá)

根據(jù)AAJ76_140036761基因序列設(shè)計(jì)引物，分別在上游引物與下游引物增加BamHⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)，引物序列：36761_F(5′-GCGCGGATCCATGATATTTTTTTTTATTTC-3′, 下劃線序列為BamHⅠ酶切位點(diǎn))；36761_R(5′-CGCGTCGACGTATTCTTCCGATTGTTGGTT-3′, 下劃線序列為SalⅠ酶切位點(diǎn))。利用CTAB法(Heetal., 2019)提取1.1節(jié)東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)基因組DNA，作為PCR反應(yīng)的模板，利用上述引物對(duì)AAJ76_140036761基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系: Premix ExTaq 25.0 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL， 模板cDNA 1 μL, 加滅菌去離子水至50 μL。PCR擴(kuò)增程序: 94℃ 5 min; 94℃ 40 s, 54.6℃ 1 min, 72℃ 90s, 35個(gè)循環(huán); 72℃延伸10 min。目的片段經(jīng)切膠回收后連接到pCold II原核表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選獲得重組表達(dá)載體。將測(cè)序正確的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，用終濃度為1.0 mmol/L IPTG在37℃ 200 r/min下誘導(dǎo)表達(dá)8 h。經(jīng)分離膠濃度為12%的SDS-PAGE電泳檢測(cè)重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)情況。收獲的重組蛋白為包涵體蛋白，使用Ni-NTA親和層析柱(QIAGEN, 德國(guó))純化目標(biāo)蛋白，用PBS溶液透析復(fù)性后存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 多克隆抗體制備及免疫印跡分析

參照前人報(bào)道的多克隆抗體制備方法(劉澤鋒等, 2017)，將純化獲得的外源表達(dá)蛋白AAJ76_1400036761-His作為免疫抗原。第1次免疫將抗原與弗氏完全佐劑(Sigma, 美國(guó))等體積混合并乳化完全，每只小鼠免疫量約為110 μg重組蛋白。隨后每隔7 d對(duì)小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫一次，共加強(qiáng)免疫3次；每次均將抗原與弗氏不完全佐劑(Sigma, 美國(guó))按體積比1∶1充分乳化，抗原量為每只小鼠110 μg。第4次免疫后的第7天進(jìn)行眼球采血。采集后的血液置于37℃培養(yǎng)箱中靜置1 h后取出置于4℃過(guò)夜，收集抗血清后分裝并于-20℃保存。

東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)成熟孢子經(jīng)玻璃珠破碎后提取總蛋白。分別將重組表達(dá)蛋白AAJ76_1400036761-His和東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移到 PVDF膜上，多克隆抗體Anti-AAJ76_1400036761按1∶3 000(v/v)稀釋后為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(Thermo, USA)為二抗，使用ECL試劑(Solarbio, 北京)進(jìn)行顯色以分析多克隆抗體的特異性及AAJ76_1400036761蛋白在東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)中的表達(dá)情況。

1.6 東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢壁蛋白AAJ76_1400036761的間接免疫熒光定位分析

采取玻璃珠破碎提取的東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上；使用Anti-AAJ76_14000367611為一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG為二抗進(jìn)行Western blotting，以進(jìn)一步分析AAJ76_1400036761在東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)中的表達(dá)情況。隨后，參照文獻(xiàn)(Peuvel-Fangetetal., 2006; Lietal., 2009; Lietal., 2012)進(jìn)行免疫熒光定位分析，方法如下：取適量多聚賴氨酸于載玻片上涂抹均勻，待干燥；添加?xùn)|方蜜蜂微孢子蟲(chóng)懸液至載玻片上并涂抹均勻，待其快干燥時(shí)用4%的多聚甲醛固定15 min，PBST溶液清洗3次，每次5 min；待干燥后加封閉液1 h，清洗同上；實(shí)驗(yàn)組將獲得的多克隆抗體以1∶200(v/v)稀釋后為一抗，對(duì)照組以小鼠陰性抗體1∶200(v/v)稀釋后為一抗，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組都以1∶1 000 (v/v)稀釋的Alexa Fluor 488(Thermo, 美國(guó))熒光抗體為二抗，分別與孢子在室溫下孵育1 h，PBST溶液清洗5 min，重復(fù)清洗3次；DAPI染色10 min，清洗同上；半干狀態(tài)下滴加適量抗熒光淬滅劑(碧云天，北京)，封片后在奧林巴斯FV1200激光共聚焦顯微鏡(OLYMPUS, 日本)下觀察并采集圖像，以分析AAJ76_1400036761在東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)中的亞細(xì)胞定位情況。

1.7 東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢壁蛋白AAJ76_1400036761的免疫膠體金定位分析

取1.1節(jié)純化后的東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)，用ddH2O清洗后5 000 r/min離心收集沉淀，固定液A液固定2 h，再用固定液B液清洗3次后于4℃固定過(guò)夜；以3 000 r/min離心收集孢子，棄上清后加入4℃預(yù)冷的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液，漂洗后離心收集沉淀；在2%的瓊脂糖中固定微孢子蟲(chóng)；最后，用30%, 50%, 70%, 80%, 85%, 90%和95%酒精于-20℃下進(jìn)行梯度脫水；樹(shù)脂包埋并低溫聚合后進(jìn)行切片。將其粘附在200目的鎳網(wǎng)上的切片，4℃取出后用超純水懸浮5 min；TBS清洗3次后利用1%的BSA/TBS封閉液室溫封閉30 min；實(shí)驗(yàn)組以制備的多克隆抗體為一抗，陰性對(duì)照組以鼠陰性抗體為一抗，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別與封閉液體積比1∶30稀釋后于4℃過(guò)夜孵育；室溫復(fù)溫后TBS清洗3次，10 nm膠體金顆粒標(biāo)記的羊抗鼠IgG(Sigma，美國(guó))二抗與二抗稀釋液體積比按1∶50孵育；TBS清洗5次，每次5 min后，超純水清洗5次，鎳網(wǎng)于2%醋酸鈾飽和酒精溶液避光染色8 min；70%酒精清洗3次；超純水清洗3次；清洗后的鎳網(wǎng)用濾紙吸干后放入網(wǎng)板中，37℃烘箱放置10 min烘干備用；在透射電子顯微鏡下觀察并采集圖像，黑色10 nm大小的金顆粒即陽(yáng)性表達(dá)或蛋白位置。

1.8 AAJ76_1400036761重組蛋白與幾丁質(zhì)殼的互作檢測(cè)

參照Yang等(2014b)提出的方法制備東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的幾丁質(zhì)殼。取200 μg AAJ76_1400036761重組蛋白與幾丁質(zhì)殼于4℃孵育2 h；在轉(zhuǎn)速為8 000 r/min的條件下離心1 min分離上清與沉淀，其中上清作為結(jié)合上清存于-20℃暫存?zhèn)溆茫挥?.01 mol/L PBS溶液將沉淀清洗10次，每次按8 000 r/min離心1 min收集沉淀；最后一次洗滌后的上清(作為清洗上清樣品)和沉淀(作為結(jié)合沉淀樣品)備用。取上述處理后得到的結(jié)合上清、清洗上清和結(jié)合沉淀樣品，以anti-AAJ76_1400036761為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗進(jìn)行Western blotting。

2 結(jié)果

2.1 東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)AAJ76_140036761基因序列特征及系統(tǒng)進(jìn)化

東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)AAJ76_140036761基因序列下載自MicrosporidiaDB(https:∥microsporidiadb.org/micro/app)，分析并獲得其完整CDS序列，基因全長(zhǎng)681 bp。AAJ76_1400036761蛋白由226個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，蛋白分子質(zhì)量預(yù)測(cè)為26.19 kD，等電點(diǎn)為6.84。該蛋白質(zhì)的氨基酸的疏水性平均值為-0.688，表明其具有一定親水性。該蛋白無(wú)信號(hào)肽，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域，無(wú)典型的肝素結(jié)合基序。對(duì)該蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果表明該蛋白由 6個(gè) α 螺旋，16個(gè) β 折疊和 20 個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲組成。翻譯后修飾分析表明，AAJ76_140036761蛋白上有1個(gè)N糖基化位點(diǎn)(圖1: A)，3個(gè)O-糖基化位點(diǎn)；具有25個(gè)磷酸化位點(diǎn)(圖1: B)，其主要存在于絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)上。GPI錨定位點(diǎn)分析表明，第 157 位的絲氨酸/S為AAJ76_140036761蛋白的錨定位點(diǎn)(圖1: C)。

圖1 東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢壁蛋白AAJ76_140036761的翻譯后修飾位點(diǎn)與錨定位點(diǎn)Fig. 1 Analysis of post-translational modification sites and anchoring sites of spore wallprotein AAJ76_140036761 from Nosema ceranaeA: 糖基化位點(diǎn)，星號(hào)表示O-糖基化位點(diǎn)，箭頭表示N-糖基化位點(diǎn)Glycosylation sites, the asterisk representing O-glycosylation sites, and arrows indicating N-glycosylation sites; B: 磷酸化位點(diǎn)，加粗字母表示磷酸化位點(diǎn)Phosphorylation sites, bold letters indicating phosphorylation sites; C: GPI錨定位點(diǎn)，下劃線表示GPI錨定位點(diǎn)GPI anchoring site, the underline indicating the GPI anchor sites.

基因座位共線性分析結(jié)果表明，AAJ76_140036761基因與家蠶微孢子蟲(chóng)CQ1 contig上的NBO_32g0011基因在染色體上的基因座位具有共線性，說(shuō)明二者的基因座位在東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)和家蠶微孢子蟲(chóng)基因組中的基因座位比較保守。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，AAJ76_140036761與家蠶微孢子蟲(chóng)的NBO_32g0011聚為一枝(圖2)，表明它們序列進(jìn)化關(guān)系較近，暗示其可能具有類似的生物學(xué)功能。但值得注意的是，在所有具有序列相似性的序列中，只有來(lái)自蝦肝腸胞蟲(chóng)E.hepatopenaei的EHP00_6被注釋為信號(hào)識(shí)別顆粒受體(signal recognition particle receptor, SRPR)，其他的均被注釋為假定蛋白。

圖2 東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢壁蛋白AAJ76_140036761與其他微孢子蟲(chóng)中同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 2 Phylogenetic tree of spore wall protein AAJ76_140036761 of Nosema ceranae and homologs of other insectsHSP: 假定蛋白Hypothetical protein; SRPR: 信號(hào)識(shí)別顆粒受體Signal recognition particle receptor. 圖中標(biāo)尺代表遺傳距離。Scale bar represents the genetic distance.

2.2 東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢壁蛋白AAJ76_140036761的原核誘導(dǎo)表達(dá)與純化

IPTG誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果表明，獲得一條約30 kD左右的差異性蛋白條帶(圖3)。經(jīng)過(guò)Ni-NAT預(yù)裝His親和層析柱純化后獲得一條目的蛋白，該蛋白質(zhì)的分子量與預(yù)測(cè)分子量大小一致，表明實(shí)驗(yàn)成功純化獲得重組蛋白AAJ76_140036761。將該蛋白作為抗原，免疫小鼠制備獲得多克隆抗體后，以制備獲得的多克隆抗體為一抗的Western blotting結(jié)果表明，在分子量大小約28 kD左右處雜交獲得一條明顯的條帶(圖4)，表明AAJ76_140036761的多克隆抗體能夠特異性地識(shí)別目的抗原重組蛋白AAJ76_140036761，可以用于后續(xù)蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位研究。

圖3 東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)重組蛋白AAJ76_1400036761的原核表達(dá)與純化Fig. 3 Prokaryotic expression and purification ofthe recombinant protein AAJ76_1400036761of Nosema ceranaeM: 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn) Protein molecular weight marker; 1: 含pCold II質(zhì)粒, 未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)pCold II plasmid without IPTG induction; 2: 含pCold II質(zhì)粒, 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)pCold II plasmid after induction with IPTG; 3: 含pCold II-AAJ76_1400036761質(zhì)粒，未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)pCold II-AAJ76_1400036761 plasmid without IPTG induction; 4: 含pCold II-AAJ76_1400036761質(zhì)粒, 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)pCold II-AAJ76_1400036761 plasmid after induction with IPTG; 5: 純化后的AAJ76_1400036761蛋白 Purified AAJ76_1400036761 protein.

圖4 Western blot檢測(cè)東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)AAJ76_1400036761多克隆抗體的特異性Fig. 4 Specificity detection of polyclonal antibody of AAJ76_1400036761 of Nosema ceranae by Western blotM: 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)Protein molecular weight marker; 1: 重組蛋白AAJ76_1400036761 Recombinant protein AAJ76_1400036761.

2.3 東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢壁蛋白AAJ76_1400036761在成熟孢子中的表達(dá)

Western blotting分析結(jié)果顯示在東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)總蛋白中，可以雜交獲得一條分子量大小約為28 kD的單一條帶(圖5)，其分子量與AAJ76_1400036761蛋白的預(yù)測(cè)分子量大小一致，表明Anti-761可以特異識(shí)別總蛋白中的AAJ76_1400036761蛋白，且該蛋白在成熟孢子中有表達(dá)。結(jié)果為后續(xù)開(kāi)展該蛋白在東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)中的亞細(xì)胞定位奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

圖5 東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)總蛋白中AAJ76_1400036761的免疫印跡Fig. 5 Western blotting of AAJ76_1400036761 in totalproteins of Nosema ceranaeM: 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)Protein molecular weight marker; 1: 東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)總蛋白Total proteins of N. ceranae.

2.4 東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢壁蛋白AAJ76_1400036761的亞細(xì)胞定位

間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，在東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)成熟孢子周圍發(fā)現(xiàn)一圈明亮的綠色熒光(圖6)，與白光下的成熟孢子疊加后發(fā)現(xiàn)綠色熒光信號(hào)分布在東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的孢壁上面，表明AAJ76_1400036761蛋白可以定位到成熟孢子的表面，可能為東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的孢壁蛋白。

圖6 間接免疫熒光法分析AAJ76_140036761在東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)中的定位Fig. 6 Localization of AAJ76_140036761 in Nosema ceranae by indirect immunofluorescence method以鼠陰性抗體為一抗孵育組為對(duì)照。Incubation group with mouse negative antibody as the primary antibody was used as the control. Anti-761: AAJ76_140036761蛋白的多克隆抗體Polyclonal antibody of protein AAJ76_140036761; Alexa Fluor 488: 熒光抗體，作為二抗Fluorescent antibody as the secondary antibody; DAPI: 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚，用于核酸染色4,6-Diamidino-2-phenylindole, for nucleic acid staining.

免疫膠體金定位分析結(jié)果表明，陰性對(duì)照組中的孢子內(nèi)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的黑色膠體金顆粒定位信號(hào)(圖7: A)，而實(shí)驗(yàn)組中黑色的膠體金顆粒主要在成熟微孢子蟲(chóng)的孢壁上有分布，且在孢子內(nèi)壁分布明顯(圖7: B, C)。這一結(jié)果與該蛋白的間接免疫熒光定位分析結(jié)果一致，說(shuō)明AAJ76_140036761確實(shí)在東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的孢壁上有分布，是鑒定到的一種新的東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢壁蛋白。這可為后續(xù)進(jìn)一步開(kāi)展AAJ76_140036761在參與孢子孢壁構(gòu)成等方面的功能研究打下堅(jiān)持的基礎(chǔ)。值得注意的是，免疫膠體金定位結(jié)果顯示膠體金顆粒除了在孢壁上有定位外，在孢子近極管區(qū)域也有少量的分布(圖7: C)。結(jié)果暗示東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢壁蛋白AAJ76_140036761可能與極管蛋白存在相互作用。

圖7 AAJ76_140036761在東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)中的免疫膠體金定位Fig. 7 Localization of AAJ76_140036761 in Nosema ceranae using immune colloidal gold techniqueA: 陰性抗體處理的陰性對(duì)照組Negative control treated with negative antibody; B: AAJ76_140036761抗體處理的實(shí)驗(yàn)組Treatment group treated with antibody of AAJ76_140036761; C: AAJ76_140036761蛋白質(zhì)定位信號(hào)的放大觀察Amplification observation of location signal of AAJ76_140036761 protein. 黑色三角形表示AAJ76_140036761蛋白在孢壁上的定位；箭頭表示AAJ76_140036761蛋白在極管區(qū)域的定位。The black triangle indicates the location of the AAJ76_140036761 protein at spore wall. The arrow indicates the location of the AAJ76_140036761 protein at the area of polar tube.

2.5 AAJ76_1400036761重組蛋白與幾丁質(zhì)殼的互作

微孢子蟲(chóng)的孢壁分為內(nèi)壁和外壁，其中幾丁質(zhì)層為孢子內(nèi)壁的主要成分，起著銜接原生質(zhì)膜和孢子外壁的橋梁作用。由上述蛋白質(zhì)定位結(jié)果可知，AAJ76_140036761可以定位于孢子內(nèi)壁，進(jìn)一步的幾丁質(zhì)結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明，在重組蛋白AAJ76_1400036761孵育幾丁質(zhì)殼的泳道中發(fā)現(xiàn)了一條明顯的蛋白質(zhì)條帶(圖8)，其與結(jié)合前的重組蛋白AAJ76_1400036761分子量大小一致，表明重組蛋白AAJ76_1400036761能夠與蜜蜂微孢子蟲(chóng)的幾丁質(zhì)殼結(jié)合，其可能參與了蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢子內(nèi)壁的構(gòu)成。

圖8 重組蛋白AAJ76_140036761與東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)幾丁質(zhì)殼的互作Fig. 8 Interaction between recombinant proteinAAJ76_140036761 and the chitin spore coat ofNosema ceranaeM: 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)Protein molecular weight marker; S0: 重組蛋白 AAJ76_140036761與幾丁質(zhì)殼孵育后的上清Supernatant of the recombinant protein AAJ76_140036761 after incubation with chitin spore coats; S: 與重組蛋白 AAJ76_140036761孵育后幾丁質(zhì)殼經(jīng)10次清洗后的上清Supernatant of chitin spore coats after 10 times of washing after incubation with the recombinant protein AAJ76_140036761; P: 與重組蛋白 AAJ76_140036761孵育后的幾丁質(zhì)殼經(jīng)10次清洗后的沉淀Precipitation of chitin spore coats after 10 times of washing after incubation with the recombinant protein AAJ76_140036761. 在P泳道中的條帶表示重組蛋白 AAJ76_140036761可以結(jié)合到幾丁質(zhì)殼上。The band in line P indicates that the recombinant protein AAJ76_140036761 can bind with chitin spore coats.

3 討論

微孢子蟲(chóng)表面有著由蛋白質(zhì)和幾丁質(zhì)組成的較厚的孢壁，其在微孢子蟲(chóng)抵御外界不良環(huán)境而得以生存的過(guò)程中扮演重要的角色(Vávra and Larsson, 1976)。同時(shí)，作為微孢子蟲(chóng)與宿主細(xì)胞最先接觸的組織，孢壁蛋白在參與孢壁構(gòu)成與侵染宿主的過(guò)程中也起到十分關(guān)鍵的功能(Jaroenlaketal., 2018; Yangetal., 2018)。本研究在東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)中鑒定出一種新的孢壁蛋白AAJ76_140036761，間接免疫熒光定位分析和免疫膠體金定位研究結(jié)果表明該蛋白可以定位在孢壁上(圖6和7)，且主要分布在孢子內(nèi)壁上，表明其可能參與了孢子內(nèi)壁的組成。在對(duì)家蠶孢壁蛋白NbSWP26的研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)該蛋白能夠參與孢子內(nèi)壁構(gòu)成，同時(shí)在介導(dǎo)對(duì)宿主細(xì)胞的粘附與侵染的過(guò)程中也發(fā)揮重要的功能(Lietal., 2009)；而家蠶類IG蛋白BmTLP(turtle-like protein)作為互作蛋白，介導(dǎo)了孢子與宿主細(xì)胞粘附，進(jìn)而提高孢子對(duì)宿主的侵染力(Zhuetal., 2013; Shravanetal., 2020)。積極探尋AAJ76_140036761蛋白與孢子自身及宿主細(xì)胞中的互作蛋白并研究其互作機(jī)制，成為后續(xù)系統(tǒng)揭示AAJ76_140036761蛋白生物學(xué)功能的重要研究?jī)?nèi)容之一。

微孢子蟲(chóng)的孢壁分為內(nèi)壁和外壁，其中幾丁質(zhì)層為孢子內(nèi)壁的主要成分，起著銜接原生質(zhì)膜和孢子外壁的橋梁作用。本研究發(fā)現(xiàn)，孢壁蛋白AAJ76_140036761定位于孢子內(nèi)壁，且其能夠與蜜蜂微孢子蟲(chóng)的幾丁質(zhì)殼結(jié)合(圖8)。在家蠶微孢子蟲(chóng)中，rSWP26, rNbSWP30和NbSWP32都被證明可以結(jié)合到家蠶微孢子蟲(chóng)的幾丁質(zhì)殼上，而NbSWP25則不具有類似的生物學(xué)功能(Yangetal., 2014b)。孢壁蛋白與幾丁質(zhì)殼的結(jié)合表明其可能參與了孢壁的構(gòu)成，對(duì)保持孢子完整形態(tài)，保護(hù)成熟孢子不受外界傷害等方面行使功能(Yangetal., 2014b)。這就表明AAJ76_140036761蛋白參與了蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢子內(nèi)壁的構(gòu)成，在維持孢壁完整性上能夠起到一定的作用。

極管作為微孢子蟲(chóng)特有的侵染器官，在其侵染宿主細(xì)胞過(guò)程中扮演了重要的角色(Han and Weiss, 2017)。孢壁在孢子侵染宿主過(guò)程中最先與宿主細(xì)胞接觸，其在粘附宿主細(xì)胞與起始侵染過(guò)程中發(fā)揮重要功能(Lietal., 2009; Jaroenlaketal., 2018)。孢壁與極管都被認(rèn)為是所有微孢子蟲(chóng)共有的特殊的侵染裝置(Hanetal., 2017)。在本研究中，免疫膠體金定位結(jié)果顯示膠體金顆粒除了在孢壁上有定位信號(hào)外，在孢子極管區(qū)域也有少量的分布，這表示東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢壁蛋白AAJ76_140036761可能與其自身極管蛋白存在相互作用。前人的研究表明，家蠶微孢子蟲(chóng)NbSWP9可以定位于孢子母細(xì)胞和成熟孢子的極管部位，且NbSWP9可以與極管蛋白相互作用，其作為支架蛋白參與了極管與孢子壁的連接(Yangetal., 2017)。NbSWP5則能夠通過(guò)與極管蛋白互作而影響孢子發(fā)芽，且能保護(hù)孢子免受細(xì)胞吞噬(Caietal., 2011; Lietal., 2012)。類似地，家蠶孢壁蛋白NbSWP5和EOB14572同樣被證明可以與極管蛋白相互作用，其功能與孢壁構(gòu)成及孢子發(fā)芽相關(guān)(Lietal., 2012; Wangetal., 2017)。這就暗示孢壁蛋白AAJ76_140036761在孢子發(fā)芽及極管固定過(guò)程中可能行使一定的生物學(xué)功能，進(jìn)一步篩選與之互作的極管蛋白，深入揭示該蛋白與極管蛋白的互作機(jī)制，成為后續(xù)AAJ76_140036761功能分析的另一個(gè)重要內(nèi)容。

本研究制備了針對(duì)孢壁蛋白AAJ76_140036761特異性較好的多克隆抗體，基于這種抗體進(jìn)行的亞細(xì)胞定位分析結(jié)果表明AAJ76_140036761蛋白可以定位于東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的孢壁上，其能夠與東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的幾丁質(zhì)殼互作，AAJ76_140036761蛋白在極管部位的分布暗示該蛋白可能與極管存在互作。研究結(jié)果為后續(xù)系統(tǒng)開(kāi)展AAJ76_140036761蛋白在孢子孢壁構(gòu)成、對(duì)孢子發(fā)芽影響及其與極管蛋白的互作機(jī)制等方面研究提供科學(xué)依據(jù)，為深入揭示東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢壁蛋白生物學(xué)功能及微孢子蟲(chóng)致病機(jī)理提供參考。