基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討參附強心丸治療心力衰竭的機制

郭麗君， 馬曉昌

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院心血管病中心，北京 100091；2.國家中醫(yī)心血管病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100091；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)西苑臨床醫(yī)學(xué)院，北京 100029)

心力衰竭(以下簡稱心衰)是各種心臟疾病的嚴(yán)重表現(xiàn)或晚期階段，死亡率和再住院率居高不下[1]。中國心衰患者注冊登記研究(China-HF)顯示住院心衰患者病死率為(4.1±0.3)%[2]。心衰治療及執(zhí)行的改善雖然提高了HFrEF(heart failure with reduced ejection fraction)的生存率，降低了住院率，但預(yù)后仍不盡人意，5年內(nèi)HF死亡率高達(dá)50%[3]。在心衰的防治過程中，中醫(yī)藥因具有多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點的作用特點，在控制癥狀、降低病死率及再住院率等方面顯示出獨特優(yōu)勢。

參附強心丸是天津中醫(yī)醫(yī)院馬連珍主任醫(yī)師的臨床經(jīng)驗方，由《金匱要略》中的己椒藶黃丸和《婦人良方》中的參附湯化裁而來。該方具有益氣助陽、強心利水的功效，用于治療慢性心衰，由人參、附子(制)、桑白皮、葶藶子、豬苓、大黃組成。人參、附子、豬苓、桑皮、葶藶子同治心、腎、肺、脾，以固心腎之陽氣，健脾肅肺，利水去濕腫。大黃既活血又清腸熱，為通補合劑。藥理研究表明人參皂苷Rc在抗炎、抗氧化、調(diào)血脂等方面療效顯著[4]。附子具有強心、抗心律失常、降壓、鎮(zhèn)痛等作用[5]。參附聯(lián)用可以抑制神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)過度激活，降低BNP水平、減少JAK1、STAT3 蛋白表達(dá)，抑制心肌重塑，改善心肌舒縮功能[6]。葶藶子具有強心、抗菌、調(diào)血脂等作用[7]。桑白皮具有降血脂、鎮(zhèn)痛、抗炎等功能[8]。豬苓具有利尿、抗炎、抗氧化[9]。大黃主要有抗炎、保護心腦血管、抗衰老等藥理作用[10]。由于中藥復(fù)方化學(xué)成分的復(fù)雜性和功能主治的多樣性，參附強心丸治療心衰作用機制尚不明確，因此借助生物信息學(xué)分析方法，挖掘參附強心丸主要作用靶點，為防治心衰的機制研究提供參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 數(shù)據(jù)庫和軟件主要包括為BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)、GeneCards(https://genecards.weizmann.ac.il/v3/)、OMIM(https://www.omim.org/)、MalaCards(https://www.malacards.org/)、TTD(https://db.idrblab.org/ttd/)、Uniprot(https://www.uniprot.org)、VENNY2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)、STRING(https://string-db.org)、DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)、易漢博生物信息在線作圖網(wǎng)站(http://www.ehbio.com/ImageGP/)、Cytoscape3.7.1軟件和cytoHubba插件、ClueGo 插件。

1.2 參附強心丸活性成分篩選及靶點預(yù)測 通過中藥分子機制的生物信息學(xué)分析工具BATMAN-TCM[11]來進行分析，該數(shù)據(jù)庫并不是簡單的通過整合數(shù)據(jù)獲得，是通過相似產(chǎn)物靶點相近的原理，進行一定的預(yù)測，用蛋白互作交叉驗證進行預(yù)測的驗證，可以分析疾病靶點富集度的顯著性水平并對有效成分與目標(biāo)靶點相關(guān)性進行評分[12]。參附強心丸由人參、附子(制)、桑白皮、葶藶子、豬苓、大黃組成。將6種成分提交給BATMAN-TCM，以score cutoff=20為篩選線，以P<0.05作為“藥物-通路”結(jié)構(gòu)構(gòu)建的基準(zhǔn)，得到參附強心丸的活性成分及靶點。

1.3 心衰相關(guān)靶點數(shù)據(jù)構(gòu)建 本研究以“heart failure”為關(guān)鍵詞檢索GeneCards、OMIM、MalaCards、TTD數(shù)據(jù)庫綜合篩選心衰相關(guān)靶點。通過檢索以上數(shù)據(jù)庫，去重后獲得心衰基因靶點，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫的UniprotID對應(yīng)至基因簡稱gene symbol。

1.4 疾病-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將參附強心丸潛在靶點與心衰相關(guān)靶點均進行統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化命名(Uniprot數(shù)據(jù)庫中的Gene name行標(biāo)準(zhǔn)化命名)，通過Excel表獲得參附強心丸-心衰共同靶點，通過韋恩圖展現(xiàn)。采用Cytoscape軟件進行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、可視化分析等。

1.5 藥物-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將參附強心丸-心衰共同靶點導(dǎo)入STRING蛋白質(zhì)互作數(shù)據(jù)庫，進行PPI分析，選擇Required Confidence(combined score)>0.7為蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系的閾值，并下載相關(guān)tsv格式文件。使用Cytoscape軟件對其進行網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建，根據(jù)Degree篩選出關(guān)鍵基因(Hub Gene)。

1.6 GO及KEGG通路富集分析 DAVID數(shù)據(jù)庫是一個包括分析工具和整合生物學(xué)相關(guān)知識的數(shù)據(jù)庫，可以從海量的基因與蛋白簇中提取有價值的生物學(xué)信息，該數(shù)據(jù)庫可以對單個基因進行分析注釋從而可以構(gòu)建GO生物學(xué)過程(Biological Process，BP)、細(xì)胞組成(Cellular Components，CC)、分子功能(Molecular Function，MF)結(jié)果。應(yīng)用Cytoscape 軟件中ClueGO插件關(guān)聯(lián)的KEGG數(shù)據(jù)庫對藥物與疾病共同靶點進行KEGG通路富集分析，將結(jié)果以互作網(wǎng)絡(luò)和餅狀圖呈現(xiàn)。

2 結(jié)果

2.1 參附強心丸活性成分篩選及靶點預(yù)測 在BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫中，檢索參附強心丸干預(yù)心衰的可能靶點，篩選Score cutoff≥20，P<0.05的活性成分。獲得215個藥物活性成分，對應(yīng)靶基因2 257個(表1)。

表1 參附強心丸成分

續(xù)表1

續(xù)表1

2.2 心衰相關(guān)靶點數(shù)據(jù)構(gòu)建及比對分析 以“heart failure”為關(guān)鍵詞在GeneCards、OMIM、MalaCards、TTD數(shù)據(jù)庫中查詢，發(fā)現(xiàn)心衰的藥物治療性靶點有GeneCards(1 539)、OMIM(25)、MalaCards(51)、TTD(42)，篩選GeneCards中相關(guān)度score>0的基因(527)，結(jié)合Uniprot數(shù)據(jù)庫確認(rèn)并轉(zhuǎn)換并刪除重復(fù)靶點，最終得到582個。

2.3 疾病-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將參附強心丸靶點與心衰靶點導(dǎo)入Excel表進行分析，發(fā)現(xiàn)心衰與參附強心丸潛在靶點有242個重合，并于Venny2.1中繪制韋恩圖(圖1)。將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建藥物-成分-疾病-靶點可視化網(wǎng)絡(luò)(圖2)。在網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點表示化合物和靶標(biāo)，連線表示化合物與靶標(biāo)之間的相互作用。

注：藍(lán)色圓形為參附強心丸靶點集合，黃色圓形為心衰靶點集合。圖1 參附強心丸與心衰相關(guān)靶點韋恩圖

注：綠色代表藥物成分，藍(lán)色代表參附強心丸-心衰共同靶標(biāo)。圖2 藥物-成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 靶點-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將參附強心丸-心衰共同靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫中。利用Multiple proteins工具，限定物種為人，設(shè)定置信度閾值≥0.7，隱藏網(wǎng)絡(luò)中不相關(guān)聯(lián)的節(jié)點，對蛋白相互作用進行篩選。獲取蛋白相互作用。共涉及241個節(jié)點，1 523條邊，平均節(jié)度點為12.6，平均局部聚類系數(shù)為0.528。將全節(jié)點關(guān)系信息導(dǎo)出并導(dǎo)入Cytoscape，用節(jié)點的大小和顏色表示degree值的大小，節(jié)點越大對應(yīng)的degree值越大，顏色由紅變藍(lán)對應(yīng)的 degree值越大。用邊的粗細(xì)表示Combine score值的大小，邊越粗，Combine score值越大(圖3)。利用cytoHubba插件根據(jù)Degree篩選出前20種PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因，并進行柱狀圖可視化(圖4)。

圖3 參附強心丸作用于心衰潛在靶點之間相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因

2.5 GO及KEGG通路富集分析 通過DAVID軟件對獲得的242個參附強心丸-心衰共同靶點進行富集分析，富集分析采用超幾何分布設(shè)計的算法，針對富集分析顯著性P值的多重檢驗校正使用Benjamini-Hochberg校正方法。GO屬于基因功能分類體系，有3個分支，即生物過程、分子功能、細(xì)胞組分，最終得到757個生物過程(Biological Process，BP)、81個細(xì)胞組成(Cellular Components，CC)、132個分子功能(Molecular Function，MF)。參附強心丸治療心衰的靶點在生物過程中主要富集到炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)血管收縮、腺苷酸環(huán)化酶調(diào)節(jié)G-蛋白偶聯(lián)受體信號通路、ERK1和ERK2級聯(lián)的正調(diào)控、衰老、蛋白激酶B信號的正向調(diào)控、血壓的負(fù)調(diào)節(jié)、血管舒張的正調(diào)控、胞質(zhì)鈣離子濃度的正調(diào)控、血管收縮的正向調(diào)節(jié)、藥物反應(yīng)、心臟傳導(dǎo)調(diào)節(jié)、血壓調(diào)節(jié)、缺氧應(yīng)答；細(xì)胞組成富集到細(xì)胞外基質(zhì)、肌漿網(wǎng)、溶酶體、肌漿網(wǎng)膜等；分子功能中富集到鈣調(diào)蛋白結(jié)合、細(xì)胞因子活性、腎上腺素結(jié)合、生長因子活性、酶結(jié)合、激素的活動、受體結(jié)合等。通過易漢博生物信息在線作圖網(wǎng)站對GO富集分析前10結(jié)果進行可視化處理(圖5)。其中，X軸代表富集因子(目標(biāo)基因中屬于這個分支的基因的數(shù)量/背景基因集中這個分支所有基因的數(shù)量)，Y軸代表名稱，氣泡面積大小代表目標(biāo)基因集中屬于這個分支的基因數(shù)量，氣泡顏色代表富集顯著性，即P值的大小。

圖5 參附強心丸潛在靶點治療心衰GO分析的氣泡圖(前10)

經(jīng)ClueGO插件關(guān)聯(lián)的KEGG數(shù)據(jù)庫，共分析出60 條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，經(jīng)Bonferroni校正P值均<0.05。KEGG通路富集到cAMP信號通路、FoxO信號通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路、腎素-血管緊張素系統(tǒng)、腫瘤壞死因子(TNF)信號通路、胰高糖素信號通路、脂肪細(xì)胞脂解的調(diào)控、腎素分泌、醛固酮的合成和分泌、膽固醇代謝、肥厚性心肌病、擴張型心肌病、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化等(圖6)。將得出的60條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路根據(jù)Kappa算法，進一步再聚類分為22組，為心肌細(xì)胞腎上腺素能信號、精氨酸生物合成、鈣信號通路、膽固醇代謝、補體和凝血級聯(lián)、缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)信號通路、TRP通道炎癥介質(zhì)調(diào)控、胰島素抵抗、腎素分泌、腎素-血管緊張素系統(tǒng)及信號通路、cGMP-PKG信號通路等(圖7)。

注：不同顏色的節(jié)點代表不同信號通路，節(jié)點越大代表調(diào)控作用越強，邊代表不同信號通路的相互作用。圖6 參附強心丸對心衰作用靶點的KEGG分析關(guān)系網(wǎng)絡(luò)

圖7 參附強心丸對心衰作用靶點的KEGG分析餅狀圖

3 討論

參附強心丸用于治療慢性心衰所引起的心悸、氣短、胸悶喘促、面肢浮腫等癥。該方作用于心衰的確切靶點尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于“疾病-基因-靶點-藥物”相互作用網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)綜合觀察藥物對疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)與影響，在中藥已知化學(xué)成分，疾病已知靶點的基礎(chǔ)上，揭示“藥物-基因-疾病”共模關(guān)聯(lián)，體現(xiàn)了中醫(yī)藥的整體觀與系統(tǒng)性，為中醫(yī)藥治療多因素導(dǎo)致的復(fù)雜疾病提供了新的途徑[13]。這有助于將中醫(yī)從經(jīng)驗醫(yī)學(xué)向循證醫(yī)學(xué)體系轉(zhuǎn)化，降低重要新藥開發(fā)及研究的風(fēng)險，輔助中藥新藥的二次開發(fā)，加快中醫(yī)藥的發(fā)展[14-16]。

前期研究顯示參附強心丸可以通過降低心腎組織腎素原受體(PRRmRNA)表達(dá)，抑制絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路蛋白激酶(ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、P38磷酸化[17]，上調(diào)心腎綜合征大鼠Bcl-2表達(dá)，抑制LC3b、Bax表達(dá)，降低心腎組織凋亡[18-19]。參附強心丸可能抑制心衰患者炎性細(xì)胞因子[20]、下調(diào)血管緊張素Ⅱ和腦鈉素[21]，聯(lián)合西藥可顯著降低機體氧化應(yīng)激損傷，改善血管內(nèi)皮功能，抑制炎性反應(yīng)[22]，與本研究預(yù)測的參附強心丸調(diào)控心衰的通路基本一致，表明預(yù)測的潛在活性成分與靶點具有一定的可靠性。

研究結(jié)果顯示參附強心丸的多個化合物可作用于同一個靶點，一個化合物也可以調(diào)控多個靶點，同一靶點可參與不同的信號通路及生物學(xué)過程。通過PPI網(wǎng)絡(luò)可以發(fā)現(xiàn)參附強心丸作用于心衰的核心基因IL-6、TNF、CRP均參與炎癥反應(yīng)，在心衰的進展中起關(guān)鍵作用[23]。KEGG信號通路主要富集在糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號通路、腎素分泌、cGMP-PKG信號通路。有研究表明AGEs及其受體在心血管疾病的發(fā)病機制中起著核心作用，導(dǎo)致糖尿病患者高致殘率和高死亡率[24]。血漿腎素增多激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)，使血漿血管緊張素Ⅱ和醛固酮分泌增多。心血管并發(fā)癥的累積導(dǎo)致全身炎癥、氧化應(yīng)激和冠狀動脈微血管內(nèi)皮炎癥的增加，最終導(dǎo)致環(huán)磷酸鳥苷酸(cGMP)通過多種途徑降解，從而降低蛋白激酶G(PKG)的活性。該途徑可能是治療心衰的潛在靶點[25]。

綜上所述，參附強心丸治療心衰具有“多成分、多靶點、多途徑”的作用特點，本研究為今后驗證該藥具體作用靶點和信號通路奠定了良好的理論基礎(chǔ)。由于目前對參附強心丸治療心衰的機制研究尚處于較淺階段，且網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究是基于生物信息學(xué)及大量數(shù)據(jù)庫計算得出的結(jié)果[26]，后續(xù)將在此基礎(chǔ)上進行體內(nèi)外實驗驗證，從而明確參附強心丸治療心衰的作用機制。