藤梨根制劑抑制白介素8誘導的血管內皮細胞遷移的分子機制

杜英杰， 趙印濤， 張雨涵， 李曉軍， 吳金洋

(承德醫學院中醫學院，河北 承德 067000)

隨著人類飲食結構的改變，心血管疾病逐漸成為威脅人類健康的主要疾病。動脈粥樣硬化是導致心血管疾病發生的最關鍵因素[1]。新生血管形成是粥樣硬化斑塊特征之一，可引發易損斑塊的發展，增加斑塊破裂的風險[2]。血管內皮細胞遷移是血管新生過程的關鍵環節[3]，抑制內皮細胞的遷移和侵襲可有效抑制新血管的生成。藤梨根是獼猴桃科獼猴屬植物硬毛中華獼猴桃的根，性味苦、寒，具有清熱、解毒、活血等功效。研究顯示，藤梨根制劑可抑制結直腸癌[4]、胃癌[5]等腫瘤細胞的遷移和侵襲，具有較好的抗腫瘤轉移作用。但目前，還未見藤梨根制劑影響血管內皮細胞遷移的相關報道。白介素8(interleukin 8，IL-8)是趨化性細胞因子，主要由單核巨噬細胞和內皮細胞產生，參與炎癥和免疫反應[6]。近年來研究顯示，IL-8也是介導內皮細胞遷移的重要因子[7]。因此，本研究采用IL-8誘導人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，探討藤梨根制劑對HUVECs遷移的影響和分子機制。

1 材料

人臍靜脈內皮細胞HUVECs，批號20181215，中國科學院上海細胞庫。藤梨根、水楊梅、茯苓等藥材，河北安國東方藥城。胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)，批號20181211，浙江天杭生物科技股份有限公司；DMEM培養基，批號20190116，北京索萊寶科技有限公司；四甲基噻唑藍(methylthiazoletrazolium，MTT)(批號298-93-1)和胰蛋白酶(批號20180629)，美國Sigma公司；LipofectamineTM2000試劑盒，批號20190111，美國Invitrogen公司；鼠抗人血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)(批號20181027)、單核細胞趨化因子-1(monocyte chemotactic factor-1，MCP-1)(批號20181119)單克隆抗體，福州邁新生物技術開發有限公司；趨化因子受體1(chemokine receptor 1，CXCR1)(批號20181105)和趨化因子受體2(chemokine receptor 2，CXCR2)(批號20181219)多克隆抗體，武漢博士德生物工程有限公司；二喹啉甲酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白檢測試劑盒，批號20190216，上海碧云天生物技術有限公司；CXCR1、CXCR2過表達載體及對照，上海吉凱基因醫學科技股份有限公司。YDS-20-50液氮罐，新鄉市鑫鴻低溫容器制造有限公司；超凈工作臺，四川天利和科技有限公司；CCL-170B-8-UV型ESCO CO2培養箱，北京中豪萊伯科技發有限公司；FlexA-200全自動酶標儀，杭州奧盛儀器有限公司；Transwell小室，美國Millipore公司；IX70倒置顯微鏡，日本Olympus公司；165-8033小型垂直電泳儀、ChemiDoc Touch成像系統，美國Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 藤梨根制劑制備 稱取藤梨根30 g、水楊梅根30 g、虎杖根30 g、茯苓20 g、黨參20 g、白術15 g、薏苡仁30 g，甘草10 g，粉碎并過200目篩，加1 000 mL水煎煮2 h，抽濾，濾液經旋轉蒸發濃縮至20 mL左右，置于真空干燥箱中干燥，得到干燥產物59.7 g。精密稱取10 mg，DMEM培養基溶解并定容至10 mL，配成1 g/L母液，0.45 μL濾頭過濾除菌，4 ℃冰箱保存備用。實驗時，培養基稀釋至所需濃度。

2.2 HUVECs培養 從液氮罐中取出裝有HUVECs的凍存管，迅速置于37 ℃水浴中融化，超凈工作臺內將細胞懸液轉移至15 mL離心管中，加入適量預冷磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)，混勻，1 000 r/min離心5 min，吸棄上清，沉淀再次加入適量PBS清洗細胞，吸棄上清，加入含10% FBS的DMEM培養基并轉移至細胞培養瓶中，置于37 ℃、 5%CO2、相對濕度97%的培養箱中培養。每2～3 d更換1次新鮮培養基。當細胞融合至80%～90%時，0.25%胰蛋白酶消化，以1∶3的比例傳代培養。

2.3 細胞分組 HUVECs分為對照組、IL-8組、不同劑量藤梨根制劑+IL-8組，對照組細胞正常培養，IL-8組細胞用含100 ng/mL[8]的IL-8誘導，不同劑量藤梨根制劑+IL-8組分別用含3.2、16、80、160 mg/L[9]藤梨根制劑及100 ng/mL IL-8的培養基共同作用。

2.4 MTT檢測藤梨根制劑對IL-8誘導HUVECs存活率的影響 對數生長期的HUVECs接種于96孔板中，每孔5×103個細胞。培養2 h后，按照“2.3”項下方法分組處理。每組設置3個復孔。繼續培養24 h，每孔加入20 μL MTT溶液(5 g/L)繼續孵育4 h。吸棄培養基，每孔加入150 μL二甲基亞砜，反應5 min，結晶紫溶解后混勻，全自動酶標儀490 nm處測定每孔的吸光度值(absorbance，A)。實驗重復3次。

2.5 Transwell檢測藤梨根制劑對IL-8誘導HUVECs遷移和侵襲 對數生長期的HUVECs用不含FBS的DMEM培養基調整濃度為5×104個/mL，將帶有8 μm微孔聚碳酸酯膜的Transwell小室(美國Millipore公司)置于24孔板中，上室加入100 μL細胞懸液，下室加入500 μL含10% FBS的DMEM培養基。培養2 h后，上室細胞分為對照組、IL-8組、不同劑量藤梨根制劑+IL-8組，其中對照組細胞正常培養，IL-8組細胞用含100 ng/mL的IL-8的培養基培養，不同劑量藤梨根制劑+IL-8組分別用含3.2、16、80 mg/L藤梨根制劑與100 ng/mL IL-8的培養基共同培養；下室均為500 μL含10% FBS的培養基，每組設置3個復孔，繼續培養24 h后吸棄培養基，取出小室，PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定30 min，0.4%結晶紫室溫染色15 min，PBS清洗至無色，自然晾干后置于倒置顯微鏡觀察，隨機選取5個視野，對穿膜細胞計數。預冷Matrigel基質膠用不含FBS的DMEM培養基以1∶8比例稀釋后鋪于Transwell上室，自然晾干，然后加入100 μL細胞懸液，后續步驟同細胞遷移實驗。實驗重復3次。

2.6 細胞劃痕實驗檢測藤梨根制劑對IL-8誘導HUVECs劃痕愈合率 對數生長期的HUVECs接種于6孔板中，每孔1×105個細胞。培養2 h后，用移液器在6孔板上劃兩條直線，預冷PBS洗去刮下的脫落細胞。按“2.3”項下方法分組處理，每組設置3個復孔。繼續培養0、24 h后，在顯微鏡下觀察，隨機選取5個位置測量細胞劃痕寬度，Image J 軟件計算劃痕愈合率，公式為劃痕愈合率=(1-24 h空白區域面積/0 h空白區域面積)×100%。實驗重復3次。

2.7 蛋白印跡(Western blot)法檢測藤梨根制劑對IL-8誘導HUVECs中VEGF、MCP-1、CXCR1和CXCR2蛋白表達 加入含蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液，提取細胞中總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取適量蛋白，100 ℃煮沸5 min，變性后每孔取30 μg蛋白行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉至聚偏乙烯二氟膜，于5%脫脂牛奶中封閉1 h，分別置于VEGF、MCP-1、CXCR1和CXCR2抗體孵育液中，4 ℃孵育過夜。洗膜后，置于辣根過氧化酶標記的二抗孵育液中，室溫孵育1 h，滴加化學發光試劑ECL避光顯影，凝膠成像系統曝光拍照。以β-actin為內參，Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值。

2.8 過表達CXCR1/2對藤梨根制劑干預的HUVECs遷移、侵襲及VEGF和MCP-1蛋白表達的影響 對數生長期的HUVECs接種于6孔板中，每孔1×105個細胞，當細胞融合至60%時，更換不含FBS的培養基。參照LipofectamineTM2000試劑盒說明書，分別轉染CXCR1過表達載體(pcDNA-CXCR1)、CXCR2過表達載體(pcDNA-CXCR2)、共轉染CXCR1與CXCR2過表達載體(pcDNA-CXCR1/2)及陰性對照(pcDNA)至HUVECs。轉染后的細胞均用含16 mg/L藤梨根制劑與100 ng/mL IL-8的培養基共同作用，并依次記為藤梨根制劑+IL-8+pcDNA-CXCR1組、藤梨根制劑+IL-8+pcDNA-CXCR2組、藤梨根制劑+IL-8+pcDNA-CXCR1/2組和藤梨根制劑+IL-8+pcDNA組。分別采用Transwell、細胞劃痕實驗、Western blot檢測各組細胞遷移和侵襲、劃痕愈合率及細胞中VEGF、MCP-1、CXCR1和CXCR2蛋白表達，方法同“2.5”“2.6”和“2.7”項。每組設置3個復孔，實驗重復3次。

3 結果

3.1 藤梨根制劑對IL-8誘導HUVECs存活的影響 與對照組比較，IL-8組細胞存活率無明顯變化(P>0.05)；與IL-8組比較，3.2、16、80 mg/L藤梨根制劑+IL-8組細胞存活率無統計學意義(P>0.05)，160 mg/L藤梨根制劑+IL-8組細胞存活率降低(P<0.05)，見表1。

表1 藤梨根制劑對IL-8誘導HUVECs存活的影響

3.2 藤梨根制劑對IL-8誘導HUVECs遷移和侵襲 與對照組比較，IL-8組細胞遷移和侵襲數、細胞愈合率升高(P<0.05)；與IL-8組比較，不同劑量藤梨根制劑+IL-8組細胞遷移和侵襲數、細胞愈合率降低(P<0.05)，見表2、圖1。

表2 藤梨根制劑對IL-8誘導HUVECs遷移和侵襲的影響

注：A為Transwell檢測細胞遷移和侵襲，B為劃痕實驗檢測細胞遷移。圖1 藤梨根制劑對IL-8誘導HUVECs遷移和侵襲的影響

3.3 藤梨根制劑對IL-8誘導HUVECs中VEGF和MCP-1表達的影響 與對照組比較，IL-8組細胞VEGF和MCP-1蛋白表達升高(P<0.05)；與IL-8組比較，不同劑量藤梨根制劑+IL-8組細胞VEGF和MCP-1蛋白表達降低(P<0.05)。見圖2、表3。

圖2 Western blot檢測HUVECs中VEGF、MCP-1蛋白表達

表3 藤梨根制劑對IL-8誘導HUVECs中VEGF、MCP-1蛋白表達的影響

3.4 藤梨根制劑對IL-8誘導HUVECs中IL-8受體CXCR1/2表達的影響 與對照組比較，IL-8組細胞CXCR1和CXCR2蛋白表達升高(P<0.05)；與IL-8組比較，不同劑量藤梨根制劑+IL-8組細胞CXCR1和CXCR2蛋白表達降低(P<0.05)。見圖3、表4。

圖3 Western blot檢測HUVECs中CXCR1和CXCR2蛋白的表達

表4 藤梨根制劑對IL-8誘導HUVECs中CXCR1和CXCR2蛋白表達的影響

3.5 過表達CXCR1/2部分逆轉藤梨根制劑對IL-8誘導HUVECs遷移和侵襲的抑制作用 與藤梨根制劑+IL-8+pcDNA組比較，藤梨根制劑+IL-8+pcDNA-CXCR1組、藤梨根制劑+IL-8+pcDNA-CXCR2組細胞CXCR1、CXCR2蛋白表達升高(P<0.05)，細胞遷移和侵襲數、細胞愈合率升高(P<0.05)；與藤梨根制劑+IL-8+pcDNA-CXCR1組、藤梨根制劑+IL-8+pcDNA-CXCR2組比較，藤梨根制劑+IL-8+pcDNA-CXCR1/2組細胞CXCR1、CXCR2蛋白表達升高(P<0.05)，細胞遷移和侵襲數、細胞愈合率升高(P<0.05)。見圖4～5、表5。

圖4 Western blot檢測HUVECs中CXCR1、CXCR2蛋白表達

注：A為Transwell檢測細胞遷移和侵襲，B：劃痕實驗檢測細胞遷移。圖5 過表達CXCR1/2逆轉藤梨根制劑對IL-8誘導HUVECs遷移和侵襲的影響

表5 過表達CXCR1/2逆轉藤梨根制劑對IL-8誘導HUVECs中CXCR1、CXCR2蛋白表達及細胞遷移和侵襲的影響

3.6 過表達CXCR1/2逆轉藤梨根制劑對IL-8誘導HUVECs中VEGF、MCP-1蛋白的抑制作用 與藤梨根制劑+IL-8+pcDNA組比較，藤梨根制劑+IL-8+pcDNA-CXCR1組、藤梨根制劑+IL-8+pcDNA-CXCR2組細胞VEGF、MCP-1蛋白表達升高(P<0.05)；與藤梨根制劑+IL-8+pcDNA-CXCR1組、藤梨根制劑+IL-8+pcDNA-CXCR2組比較，藤梨根制劑+IL-8+pcDNA-CXCR1/2組細胞VEGF、MCP-1蛋白表達升高(P<0.05)。見圖6、表6。

圖6 Western blot檢測HUVECs中VEGF、MCP-1蛋白表達

4 討論

IL-8屬于趨化因子家族CXC亞家族成員，與細胞上的CXCR受體具有高度親和力。CXCR受體是一種G蛋白偶合體。內皮細胞可同時表達CXCR1和CXCR2兩種受體，這兩種受體均可與IL-8特異性結合[10]。IL-8通過激活CXCR1和CXCR2受體后，引起細胞收縮及細胞與細胞間隙增加，提高細胞基底膜通透性，促進血管生成[11]。VEGF是目前公認的功能最強的新生血管生成促進因子，可作用于血管內皮細胞膜上的相應受體，通過一系列信號傳導促進內皮細胞分裂、增殖和遷移[12]。MCP-1屬于CC趨化因子家族成員，主要參與機體免疫調節、腫瘤生長及血腦屏障[13]。研究顯示，MCP-1通過趨化因子受體2誘導血管平滑肌細胞遷移[14]。本研究發現，IL-8誘導HUVECs后，細胞遷移和侵襲數、劃痕愈合率升高，與相關報道結果一致，提示IL-8促進了HUVECs遷移和侵襲。本研究還顯示，IL-8誘導HUVECs后，細胞中VEGF、MCP-1、CXCR1和CXCR2蛋白表達增加，提示IL-8可能通過與CXCR1和CXCR2受體結合激活其表達以及上調細胞中VEGF和MCP-1表達促進HUVECs遷移。

近年來，我國傳統中藥具有多治療靶點、藥性溫和、毒副作用低等優點，成為疾病治療研究的熱點。藤梨根制劑是以我國特有種中華獼猴桃的根為君藥，以水楊梅根、虎杖根為臣藥，加之黨參、白術等組成的祛除解毒、扶助正氣的復方藥。目前，對藤梨根制劑功效的研究多為抗腫瘤作用研究。如復方藤梨根制劑可能通過下調乙酰肝素酶表達來抑制胃癌細胞的遠處轉移，發揮抗胃癌作用[15]。藤梨根制劑可抑制小鼠體內結腸癌細胞肺轉移[16]，其聯合伊立替康與卡培他濱可改善晚期結腸癌肝轉移患者生存質量和免疫功能，減輕化療毒副反應[17]。藤梨根制劑可能通過下調卵巢癌A2708細胞MMP-2、MMP-9表達及上調TIMP-1表達抑制卵巢癌A2780細胞增殖、遷移及侵襲[18]。復方藤梨根制劑能抑制腫瘤生長，減少CT26瘤體中MVD，具有抗腫瘤血管生成作用[19]。但藤梨根制劑能否抑制內皮細胞的遷移還未見相關研究。

本研究顯示，藤梨根制劑在一定濃度范圍內對IL-8誘導HUVECs活性無顯著影響，而濃度升高時可抑制HUVECs存活。選擇對HUVECs活性無顯著影響濃度的藤梨根制劑，觀察其對IL-8誘導HUVECs遷移及VEGF、MCP-1、CXCR1和CXCR2蛋白表達的影響，結果顯示，藤梨根制劑作用后，IL-8誘導HUVECs遷移和侵襲數、劃痕愈合率及VEGF、MCP-1、CXCR1和CXCR2蛋白表達均降低，提示藤梨根制劑可能通過抑制VEGF、MCP-1、CXCR1和CXCR2蛋白表達抑制IL-8誘導HUVECs遷移。本研究還顯示，過表達CXCR1或CXCR2可逆轉藤梨根制劑對IL-8誘導HUVECs遷移的抑制作用，且同時過表達CXCR1和CXCR2的逆轉作用更強，進一步說明藤梨根制劑通過抑制CXCR1和CXCR2蛋白表達來抑制IL-8誘導HUVECs遷移。

綜上所述，藤梨根制劑可能通過抑制CXCR1和CXCR2蛋白表達來抑制血管內皮細胞的遷移，為動脈粥樣硬化的治療提供了新途徑。