菊三七致大鼠肝毒性血清膽汁酸的靶向代謝組學(xué)研究

李云鶴， 茍小軍， 陳 龍， 王夏雷， 李修龍， 賈益群*

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)科技實(shí)驗(yàn)中心分析測試室，上海 201203；2.上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，上海 201900)

菊三七又名土三七，為菊科菊三七屬植物菊葉三七Gynurasegetum(Lour.) Merr.的根或全草，具有破血散瘀，消腫止血等功效，始載于《滇南本草》中，長期大量服用可引起肝小靜脈損傷，近年來廣受人們的關(guān)注與重視[1]。

膽汁酸(Bile acids)是以膽固醇為基本原料，在肝臟中通過一系列酶促反應(yīng)合成的一類膽烷酸的總稱，是膽汁的主要成分[2]。有研究表明，機(jī)體內(nèi)膽汁酸代謝與肝、腸系統(tǒng)密切相關(guān)，膽汁酸在合成、排泄過程中，會(huì)經(jīng)過肝臟的生物生化和生物物理這兩大屏障[3]，在其代謝和排泄受阻時(shí)，就會(huì)大量淤積于肝臟中，致使肝臟受損，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體受損及肝細(xì)胞凋亡和壞死[4]。因此研究膽汁酸代謝變化對(duì)肝毒性中藥、肝損傷機(jī)制的研究有極其重要的意義。

代謝組學(xué)是運(yùn)用多種技術(shù)手段探究生物體系中小分子代謝物的種類、數(shù)量和變化規(guī)律的一門科學(xué)[5-6]，主要基于高通量分析儀器對(duì)機(jī)體代謝產(chǎn)物如血漿和尿液等進(jìn)行定性和定量分析[7-9]。代謝組學(xué)分為靶向和非靶向代謝組學(xué)[10]，在以往的研究中主要是以非靶向代謝輪廓分析為主，即應(yīng)用各種分析技術(shù)對(duì)生物體內(nèi)源性小分子代謝產(chǎn)物進(jìn)行無歧視全掃描，以獲得大量的多維的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)信息，尋找生物體樣本中各組分的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律；而靶向代謝組學(xué)是對(duì)特定的幾個(gè)或幾類代謝物群針對(duì)性的檢測與分析，在經(jīng)過非靶向代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)差異代謝物后，再以標(biāo)準(zhǔn)品作為參照，利用靶向代謝組學(xué)進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證與分析[11]。

根據(jù)課題組前期的研究，在基于LC-MS的基礎(chǔ)上，通過分析菊三七致肝毒性大鼠血清、肝臟和尿液中的內(nèi)源性代謝物，從而得出結(jié)論，菊三七致大鼠肝毒性的作用機(jī)制可能與甘油磷脂、膽汁酸等代謝紊亂有關(guān)[12-13]。本文將進(jìn)一步深入探究菊三七致大鼠肝毒性與血清膽汁酸之間的聯(lián)系。

1 材料

1.1 動(dòng)物 健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體質(zhì)量150～170 g，采購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(滬)2017-0005，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)室溫度為22～25 ℃，相對(duì)濕度45%～70%，光照周期12 h/12 h，飼養(yǎng)期間可自由獲取水和食物。18只SD大鼠隨機(jī)分為空白組、高劑量組、低劑量組，每組6只，高劑量組和低劑量組分別給與15、7.5 g/(kg·d)的菊三七水煎劑，連續(xù)給藥10 d。

1.2 藥材 菊三七采摘于湖北省武漢市黃陂區(qū)木蘭湖周家灣，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院崔亞君副教授鑒定為菊科植物菊三七的根塊。根據(jù)文獻(xiàn)[14-15]，通過煎煮配制質(zhì)量濃度為1.5 g/mL的菊三七水煎劑。

1.3 試劑 膽酸(CA，批號(hào)K1325088)、鵝去氧膽酸(CDCA，批號(hào)H1716012)、去氧膽酸(DCA，批號(hào)H1725076)、甘氨膽酸(GCA，批號(hào)H1520042)、甘氨脫氧膽酸(GDCA，批號(hào)1721065)、豬去氧膽酸(HDCA，批號(hào)K1715026)、石膽酸(LCA，批號(hào)D1712091)、牛磺膽酸(TCA，批號(hào)F1729023)、牛磺鵝去氧膽(TCDCA，批號(hào)SLBH9352)、牛磺脫氧膽酸(TUDCA，批號(hào)H1511086)、熊去氧膽酸(UDCA，批號(hào)E1715044)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甘氨鵝脫氧膽酸(GCDCA，批號(hào)F1 218 A，大連美侖生物技術(shù)有限公司)；甘氨熊去氧膽酸(GUDCA，批號(hào)BCBM2974V，美國Sigma-Aldrich公司)；牛磺豬去氧膽酸(THDCA，批號(hào)AZ1050，臨沂艾澤拉斯生物科技有限公司)。甲醇(國藥集團(tuán)有限公司，批號(hào)M1203AS，色譜純)；甲酸(上海安普實(shí)驗(yàn)科技有限公司，批號(hào)3208k240，色譜純)；乙酸銨(美國霍尼韋爾有限公司，批號(hào)BCBR1129V，分析純)。

1.4 儀器 超高相色譜儀(UPLC，美國Waters公司)-三重四級(jí)桿5500 LC-MS/MS(Triple Quad，美國AB SCIEX公司)；TARGINTMVX-Ⅱ多管漩渦振蕩器(北京踏錦科技有限公司)；1730R冷凍高速離心機(jī)(德國Gene公司)；TBA-40FR全自動(dòng)生化分析儀(日本Toshiba公司)；TP1020全自動(dòng)脫水機(jī)、EG1160自動(dòng)包埋機(jī)、RM2135切片機(jī)(德國Leica公司)；FA2004N電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；Milli-Q純水機(jī)(上海默瑞生物科技有限公司)。

2 方法

2.1 生物樣品采集

2.1.1 血清 末次給藥后于晚上開始禁食12 h，第二天進(jìn)行大鼠腹主動(dòng)脈取血4 mL，4 ℃靜置1 h，3 500 r/min離心15 min后取上清液100 mL，于全自動(dòng)生化檢測儀上檢測ALT、AST、ALB、TBIL水平。

2.1.2 肝臟組織 大鼠處死后取肝組織，分離得肝大葉立即置于10%福爾馬林溶液中固定，制備石蠟切片后進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察肝組織形態(tài)學(xué)變化。

2.2 對(duì)照品溶液配制 精密稱取各對(duì)照品5 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶液溶解至刻度線，搖勻，即得儲(chǔ)備液，保存于4 ℃冰箱中備用。精密移取儲(chǔ)備液，甲醇稀釋成500、200、100、50、20、10、5、0.5 ng/mL，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。

2.3 樣品處理 取大鼠血清100 mL，加入300 mL甲醇，渦旋1 min后，12 000 r/min離心10 min，取上清于進(jìn)樣瓶中進(jìn)樣分析。

2.4 LC-MS/MS分析

2.4.1 色譜條件 Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相0.1%甲酸(含10 mmol/L醋酸銨)(A)-甲醇(B)，梯度洗脫(0～1.0 min，45% A；1～9 min，45%～20%A；9～11.4 min，20%～10%A；11.4～14.0 min，10%A；14.0～14.1 min，10%～45%A；14.1～17 min，45%A)；體積流量0.3 mL/min；柱溫45 ℃；進(jìn)樣量2 μL。

2.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧電離(ESI)，負(fù)離子模式，多級(jí)反應(yīng)模式監(jiān)測(MRM)；毛細(xì)管電壓2.8 kV；錐孔電壓55.0 V；離子源溫度120 ℃；去溶劑化溫度350 ℃；去溶劑化氣流600 L/h；錐孔氣流5.0 L/h。

3 結(jié)果

3.1 菊三七對(duì)大鼠血清生化指標(biāo)影響 如表1所示，與空白組比較，高、低劑量組TBA、ALT、AST、TBIL均升高(P<0.05)，其中高劑量組ALT、TBIL均高于低劑量組(P<0.01)；而高劑量組的TBA則低于低劑量組(P<0.01)。

表1 菊三七不同給藥劑量對(duì)大鼠血清生化指標(biāo)影響

3.2 肝組織病理切片 如圖1所示，空白組肝細(xì)胞正常；高劑量組肝細(xì)胞呈現(xiàn)大面積出血性壞死；低劑量組肝細(xì)胞有炎細(xì)胞浸潤，細(xì)胞間隙變大，有少部分出血性壞死；高劑量組肝損傷程度較低劑量組更大。

圖1 大鼠肝組織HE染色病理切片(×200)

3.3 血清膽汁酸分析 在連續(xù)給藥10 d后，高、低劑量組與空白組比較結(jié)果如表2所示。隨著給藥劑量的增加，部分膽汁酸的濃度有著明顯的上升趨勢(shì)，其中高、低劑量組的CA、CDCA、GCA、GUDCA、TCA、TCDCA、TUDCA、THDCA都升高(P<0.05)；高劑量與低劑量比較，CA、CDCA、DCA、HDCA、TCDCA、TUDCA、THDCA均有差異(P<0.05)，且低劑量組比高劑量組至少升高2到3倍以上。以上結(jié)果表明，在一定的天數(shù)內(nèi)隨著給藥劑量的增加，高、低劑量組血清中部分膽汁酸都升高，但低劑量組血清膽汁酸水平更高，這與低劑量的TBA高于高劑量的結(jié)果一致，提示菊三七致肝毒性與以上膽汁酸水平有一定的相關(guān)性。

表2 菊三七不同給藥量下14種血清膽汁酸水平

3.4 多元分析

3.4.1 PCA分析 采用非監(jiān)督模式的PCA分析方法，將空白組和高、低劑量組進(jìn)行比較分析，以膽汁酸濃度為X變量，組別為Y組，如圖2所示。高、低劑量組和空白組經(jīng)PCA分析能較完全分離，提示大鼠血清中14種膽汁酸已發(fā)生代謝紊亂。圖2中空白組與低、高劑量組比較，R2X分別為0.605、0.627、0.659、0.612，說明該P(yáng)CA模型能解釋樣本間代謝差異。

圖2 大鼠血清膽汁酸樣本PCA分析

3.4.2 OPLS-DA分析 為反應(yīng)不同組別之間的差異關(guān)系，更好地對(duì)模型進(jìn)行解釋，進(jìn)一步采用監(jiān)督性的正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)，本分析對(duì)模型進(jìn)行200次置換檢驗(yàn)，分別對(duì)大鼠血清膽汁酸樣本構(gòu)建OPLS-DA模型，對(duì)高、低劑量組和空白組之間進(jìn)行模型分析，結(jié)果如圖3所示，空白組與高、低劑量組在OPLS-DA圖上能完全分離，方便下一步差異代謝物的尋找。根據(jù)計(jì)算結(jié)果顯示，圖3中R2Y分別為0.966、0.956、0929，Q2分別為0.874、0.899、0.504，表明該模型的擬合度和預(yù)測能力較好。

圖3 大鼠血清膽汁酸樣本OPLS-DA得分圖及其置換檢驗(yàn)

3.5 篩選差異代謝物 通過上述OPLS-DA的分析結(jié)果，根據(jù)變量權(quán)重值VIP>1的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，并結(jié)合P<0.05的標(biāo)準(zhǔn)，篩選差異代謝物。高劑量組與空白組比較，差異代謝物有5個(gè)，分別為DCA、TCA、TCDCA、TUDCA和THDCA；低劑量組與空白組比較，差異代謝物有7個(gè)，分別為CDCA、GCA、GUDCA、TCA、TCDCA、TUDCA和THDCA；高劑量組與低劑量組比較，差異代謝物有5個(gè)，分別是CDCA、DCA、HDCA、TUDCA和THDCA。

4 討論

膽汁酸代謝在肝損傷疾病的發(fā)生與發(fā)展中有著越來越重要的作用，是用于診斷肝功能及肝臟疾病的一類敏感的標(biāo)志物[16]。Márcia等[17]通過研究發(fā)現(xiàn)脂肪性肝炎患者體內(nèi)的CA、CDCA和DCA水平顯著性升高。而膽汁酸是一類雙親性分子，可分為疏水性和親水性，其中疏水性膽汁酸主要有CA、CDCA、DCA、LCA和GCDCA[18]。有研究認(rèn)為疏水性膽汁酸蓄積可促進(jìn)肝細(xì)胞損傷、凋亡或壞死[19]。本實(shí)驗(yàn)通過檢測大鼠血清中14種膽汁酸的水平，探究不同劑量下大鼠血清膽汁酸的變化。結(jié)果表明，在一定時(shí)間內(nèi)，隨著給藥劑量升高，菊三七致肝毒性也逐漸增強(qiáng)，其中DCA、CDCA在大鼠血清中濃度顯著增高，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)論一致。可推測菊三七給藥已造成大鼠肝損傷，同時(shí)引起肝臟吸收和排泄功能障礙，最終使得血清中膽汁酸濃度升高。加上DCA、CDCA為疏水性膽汁酸會(huì)進(jìn)一步加重肝損傷，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞的凋亡或壞死。給藥后大鼠血清膽汁酸升高，進(jìn)一步推測菊三七致大鼠肝損可能是與膽汁酸在體內(nèi)淤積有關(guān)，通過病理切片的觀察，可知在一定的時(shí)間下，菊三七給藥量和肝損傷嚴(yán)重程度成正比關(guān)系。

雖然高、低劑量組的膽汁酸濃度均高于空白組，但高劑量組的血清膽汁酸濃度均低于低劑量組，且生化指標(biāo)TBA的檢測中發(fā)現(xiàn)，高劑量組的TBA值同樣比低劑量組的低，由此猜測可能是由于高劑量組對(duì)大鼠肝損傷較為嚴(yán)重，反而抑制了體內(nèi)膽汁酸的合成，這與陳楚穎等[20]研究中發(fā)現(xiàn)當(dāng)膽汁酸水平上升后會(huì)反饋性調(diào)控膽汁酸的合成、排泄基因的表達(dá)，進(jìn)而維持膽汁酸的穩(wěn)態(tài)的研究結(jié)果相印證。Jia[21]等人的研究中也同樣表明膽汁酸合成會(huì)受到FXR的負(fù)反饋性調(diào)節(jié)機(jī)制的影響，正是通過這種負(fù)反饋性機(jī)制的調(diào)節(jié)從而限制了膽汁酸在肝臟中積累，提示高濃度肝毒性藥物對(duì)肝臟損害較嚴(yán)重，進(jìn)而激活了體內(nèi)FXR，從而導(dǎo)致膽汁酸合成能力下降，雖然總膽汁酸合成能力有所下降，但是體內(nèi)膽汁酸水平仍高于正常組，最終造成膽汁酸淤積。

綜上所述，本文通過對(duì)大鼠血清中14種膽汁酸進(jìn)行靶向代謝組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)在一定給藥時(shí)間內(nèi)，不同給藥劑量的菊三七對(duì)大鼠血清中膽汁酸濃度有一定影響。應(yīng)用t檢驗(yàn)和多元統(tǒng)計(jì)分析，由結(jié)果發(fā)現(xiàn)CDCA、GCA、DCA、HDCA、GUDCA、TCA、TCDCA、TUDCA和THDCA在給藥菊三七后會(huì)發(fā)生一定的變化，且隨著給藥劑量增加菊三七肝毒性也在增加，提示這些膽汁酸可作為菊三七致大鼠肝毒性的潛在標(biāo)志物。

5 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，采用菊三七水煎劑灌胃給藥法建立大鼠肝損傷模型，應(yīng)用LC-MS/MS對(duì)大鼠血清樣本進(jìn)行14種膽汁酸水平檢測，利用代謝組學(xué)的研究方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，找尋菊三七致肝損傷的潛在標(biāo)志物。結(jié)論，菊三七致肝損傷可能與大鼠體內(nèi)膽汁酸紊亂與淤積有關(guān)，通過數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)大鼠給藥菊三七后，體內(nèi)CDCA、GCA、DCA、HDCA、GUDCA、TCA、TCDCA、TUDCA和THDCA受影響較大，這表明這些膽汁酸可作為菊三七致大鼠肝損傷的潛在標(biāo)志物。同時(shí)，該研究為毒性中藥的研究提供了新的研究思路與方法。