基于網絡藥理學探析玉液湯對2型糖尿病的作用機制

劉堅輝， 陳楚儀， 楊幃勛， 劉 敏

(1.廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣東 廣州 510405；2.廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東 廣州 510405；3.東莞仁康醫院，廣東 東莞 523952)

2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)是以胰島素抵抗和(或)胰島素分泌障礙引起的一組以葡萄糖和脂肪代謝紊亂，血漿葡萄糖水平增高為特征的代謝內分泌疾病。目前對于T2DM的治療主要有以下方式：飲食治療、運動療法、口服抗糖尿病藥、胰島素治療，GLP-1類似物及減肥手術為主。中醫方面，糖尿病當屬于中醫“消渴病”范疇，其以“三多一少”即飲多、食多、尿多、身體消瘦為特點，辯證當屬“氣陰兩虛”，病位在肺、脾、腎三臟，治療當以“益氣生津”為主。

玉液湯出自清代名醫張錫純所著的《醫學衷中參西錄》[1]，用以治療消渴病，張氏于書中描述此方配伍說：“消渴一證，多由于元氣不升，此方乃升元氣以止渴者也。方中以黃芪為主，得葛根能升元氣。而又佐以山藥、知母、花粉以大滋真陰，使之陽升而陰應，自有云行雨施之妙也。用雞內金者，因此證尿中皆含有糖質，用之以助脾胃強健，化飲食中糖質為津液也。用五味者，取其酸收之性，大能封固腎關，不使水飲急于下趨也。”明確提出玉液湯用以治療消渴病。而在臨床應用上，玉液湯已被廣泛用以治療糖尿病以及其所引起的包括糖尿病腎病在內的并發癥。

但由于復方中藥成分多樣性，以及與人體相互作用機制復雜的問題，目前發掘其明確的作用機制仍相對困難。故希望借助近年發展迅速的網絡藥理學方法，基于系統生物學的角度挖掘玉液湯治療2型糖尿病的作用機理，為以后進一步驗證實驗提供參考基礎。

1 方法

1.1 收集玉液湯的生物信息數據 利用BATMAN-TCM數據庫收集玉液湯的相關成分及靶點數據。BATMAN-TCM是在線生物信息分析工具，主要用于分析中藥成分及潛在靶點，且該數據庫可輸入單味中藥或者以君臣佐使形式輸入中藥復方進行分析以及對復方中藥或單味藥進行網絡藥理學分析。本次研究以玉液湯作為研究對象，輸入山藥、黃芪作為君藥，知母、天花粉作為臣藥，雞內金、五味子、葛根作為佐使藥，一共3個集群，設定P≤0.05，score cutoff≥20為檢索條件。并將得出的與玉液湯相關的化合物成分輸入中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)，通過口服利用度(Oral Bioavailability，OB)，類藥性(Drug-Likeness，DL)作為篩選標準，設定OB≥30%，DL≥0.18，得出玉液湯的生物信息集[2]。

1.2 獲取2型糖尿病的生物信息數據 在DrugBank(https://www.drugbank.ca/)上輸入“type 2 diabetes mellitus”尋找2型糖尿病的相關基因，并運用UniPort(https://www.uniprot.org/)數據庫對靶點進行標準化命名。

1.3 獲取玉液湯-2型糖尿病-基因數據 通過OmicShare平臺(https://www.omicshare.com/)對獲得的玉液湯靶點以及2型糖尿病的相關基因進行映射分析，得出玉液湯-2型糖尿病-基因數據集，并繪制韋恩圖。將玉液湯-2型糖尿病-基因數據集輸入STRING 11.0數據庫(https://string-db.org/)，設定綜合分數>0.4，刪除無連接的節點為篩選標準進行分析，并將得出的數據錄入Cytoscape 3.6.1軟件進行可視化分析，對其進行網絡拓撲學參數分析，得出作用顯著的節點。

1.4 基因本體(GO)分析 將玉液湯-2型糖尿病-基因數據集導入DAVID 6.8 數據(https://david.ncifcrf.gov/)進行GO分析，得出結論后，以P≤0.05為篩選標準進行篩選，從而得出基因的功能水平。

1.5 京都基因與基因組百科全書(KEGG)分析 將玉液湯-2型糖尿病-基因數據集導入DAVID 6.8 數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)進行KEGG分析，以P≤0.05為篩選標準進行篩選，從而得出其富集的生物學通路。

2 結果

2.1 玉液湯的生物信息數據 經過BATMAN-TCM檢索后，剔除無效成分，共得到293個化合物，由于化合物較多，故錄入TCMSP篩選后只顯示各個群集OB≥30%、DL≥0.18的化合物，見表1。玉液湯的主要生物通路富集在視黃醇代謝，鈣信號通路，心肌細胞腎上腺素能信號轉導，糖酵解/糖異生，逆行內源性大麻素信號轉導，谷氨酸能突觸，酪氨酸代謝，甲狀腺激素信號途徑，神經活性配體-受體相互作用，多巴胺能突觸，脂肪酸降解，膽堿能突觸，晝夜夾帶，心肌收縮，催產素信號通路，cGMP-PKG信號通路，胰島素分泌，γ-氨基丁酸能突觸，5-羥色胺能突觸；分子功能(Molecular function，MF)主要富集在轉錄因子活性，蛋白質結合，信號傳感器活動，脂質結合，氧化還原酶活性，轉移酶活性，轉移酰基等；細胞組分(Cellular component，CC)主要富集在胞漿，質膜，核染色體，內質網，過氧化物酶體等；生物過程(Biological process，BP)主要富集在蛋白質靶向，細胞骨架依賴性細胞內轉運，神經系統過程，蛋白質復合物組裝，trna代謝過程等。網絡所示為OB≥30%、DL≥0.18的化合物與靶點網絡圖，見圖1。

表1 玉液湯中具有較好口服利用度及類藥性的化合物

圖1 玉液湯中OB≥30%、DL≥0.18的化合物網絡關系圖(粉紅色代表化合物，綠色代表靶點)

本次通過BATMAN-TCM檢索篩選后，共得出1 680個靶點，以君，臣，佐使形式分為3個合集，共同靶點403個，見圖2，對其進行PPI互作網絡分析以及拓撲學分析后，發現其相互作用較強的靶點為胰島素、白細胞介素6、腫瘤壞死因子、FOS蛋白、多巴胺受體D2等，進一步說明玉液湯是通過多靶點協同作用發揮治療疾病的作用,見表2。

表2 玉液湯君、臣、佐使的共同基因PPI網絡拓撲學分析

2.2 2型糖尿病的生物信息數據 通過DrugBank對“type 2 diabetes”進行檢索以及通過Uniport對靶基因進行標準化命名后，得到197個基因，刪除重復基因后，共得到108個基因與2型糖尿病相關，其生物信號通路主要富集于視黃醇代謝、藥物代謝-細胞色素p450、膽汁分泌、細胞色素p450對外源物質代謝的影響、5-羥色胺能突觸、神經活性配體-受體相互作用。分子功能(Molecular function，MF)主要富集在atp酶活性與物質跨膜運動，氧結合，類固醇羥化酶，藥物結合，陰離子跨膜轉運atp酶活性等；生物過程(Biological process，BP)主要富集在藥物反應，外源代謝過程，類固醇代謝過程，陰離子跨膜轉運，藥物代謝過程等；細胞組分(Cellular component，CC)主要富集于質膜的整體組成，質膜，細胞器膜，膜的整體組成，內質網膜等,見圖3。

注：左圖為玉液湯的君、臣、佐使的各項基因靶點數，右圖為玉液湯的君、臣、佐使的共同基因PPI網絡集。圖2 玉液湯的基因靶點集

圖3 2型糖尿病的基因靶點集

2.3 玉液湯-2型糖尿病-基因數據 將玉液湯的1 680個靶點與2型糖尿病的108個靶點導入OmicShare平臺進行映射，共得出交集基因61個，將其錄入STRINGpingt進行蛋白與蛋白PPI互作分析，并運用Cytoscape的NetworkAnalyzer功能進行網絡拓撲學分析，得出其較關鍵的基因為白蛋白(ALB，Degree為21)、細胞色素P4503A4(CYP3A4，Degree為20)、單胺氧化酶(MAOB，Degree為20)、SLCO1B1基因、三磷酸腺苷結合盒運轉體A1(ABCA1，Degree為15)等。如圖4所示，節點顏色越深，則代表該節點的度(degree)越高，代表其在PPI網絡中起著更關鍵的作用，其中三角形節點代表玉液湯-2型糖尿病的共同基因靶點，邊代表基因間的相互作用關系，玉液湯-2型糖尿病-基因的PPI互作網絡共有節點60個及248個相互作用聯系。

注：左圖為玉液湯-2型糖尿病相互交聯的基因靶點數，右圖為玉液湯-2型糖尿病相互交聯的基因靶點PPI 網絡(顏色越深，作用越強)。圖4 玉液湯-2型糖尿病-基因的數據集分析

2.4 玉液湯-2型糖尿病-基因的生物學過程 將玉液湯-2型糖尿病的交集基因錄入DAVID 6.8數據庫進行GO分析，并以P≤0.05為篩選標準進行篩選，得出結果后，按照其顯性程度進行部分排列展示，GO分析提示玉液湯-2型糖尿病-基因主要的生物學過程顯著富集在藥物反應、腺苷酸環化酶激活腎上腺素能受體信號通路、磷脂酶c激活g蛋白偶聯受體信號途徑、藥物跨膜轉運、行為調節、5-羥色胺受體信號通路、突觸傳遞，多巴胺能、可卡因的行為反應、去甲腎上腺素腎上腺素血管收縮與系統性動脈血壓的調節、游離鈣離子在胞漿中的釋放、血管收縮等；分子功能主要富集在藥物結合、血清素結合、神經遞質受體活性、G蛋白偶聯5-羥色胺受體活性、多巴胺神經遞質受體活性、多巴胺結合、atp酶活性與物質跨膜運動等；細胞組分主要富集在質膜的整體組成、質膜等，見表3。

表3 玉液湯-2型糖尿病-基因的生物學過程

2.5 玉液湯-2型糖尿病-基因的生物學通路 將玉液湯-2型糖尿病的交集基因錄入DAVID 6.8數據庫進行KEGG分析，共得到24條通路，并以P≤0.05為篩選標準進行篩選，得出結果后，按照其顯性程度進行部分排列展示，見表4。KEGG分析提示玉液湯-2型糖尿病-基因主要的生物學過程顯著富集在神經活性配體-受體相互作用、過氧化物酶體增殖物激活受體信號通路、膽汁分泌、5-羥色胺能突觸、ABC轉運蛋白、鈣信號通路等。

表4 玉液湯-2型糖尿病-基因的生物學通路

3 討論

本研究通過BATMAN-TCM檢索獲得玉液湯化學成分108種、靶點1 680個，可能與視黃醇代謝、藥物代謝-細胞色素p450、膽汁分泌、細胞色素p450對外源物質代謝的影響、5-羥色胺能突觸、神經活性配體-受體相互作用等有關，可發揮協同作用以調控2型糖尿病。

3.1 玉液湯具有調節關鍵靶點的潛在作用 本研究通過PPI蛋白互作網分析，得出玉液湯中蛋白互作性較強的靶點。其中ABL是2型糖尿病早期診斷、病情進展和監測的重要指標，2型糖尿病腎臟損傷越大，其ALB丟失則越多[3]；CYP3A4是細胞色素P540氧化酶家族成員之一，隨2型糖尿病胰島素抵抗的增強會導致CYP3A4蛋白活性下降[4]；MAOB是存在于胰島當中的酶，2型糖尿病β細胞中其表達顯著降低，導致β細胞功能障礙[5]；SLCO1B1是溶質載體有機陰離子轉運體家族成員之一，其基因多態性對藥物代謝、治療效果及相關不良反應方面有影響[6]；ABCA1可影響胰島β細胞，是維持正常胰島素分泌的關鍵作用，對膽固醇逆向轉運與高密度脂蛋白生成起重要作用，膽固醇可能抑制胰島素分泌[7]。

3.2 玉液湯在調節生物學通路方面的作用 對玉液湯與2型糖尿病的共同基因進行KEGG富集分析，發現該方對神經活性配體-受體相互作用通路進行調節，有促炎、抗炎作用，對2型糖尿病的發展和治療有直接作用[8]。有研究發現，PPARs能調控脂質代謝過程，也調節糖代謝，與脂肪酸代謝、脂肪酸β氧化和轉運調節脂質平衡有關[9]。膽汁酸是影響血糖穩定的重要因素，除了影響脂肪的消化和吸收外，在大腸及小腸中可誘導2型糖尿病藥物的關鍵作用靶點胰高血糖素樣肽-1的分泌，調節腸道微生物菌群的組成，減少2型糖尿病患者餐后血糖的上升[10]。通過KEGG富集分析發現，玉液湯作用于膽汁分泌通路，對2型糖尿病的調控亦與5-羥色胺能突觸有關。有研究證明，胰島素分泌代謝亦受到了5-羥色胺等單胺類神經遞質控制[6]，其中ABCA1轉運體與糖尿病發病機制有關，小鼠胰島β細胞中缺失ABCA1后，出現了葡萄糖不耐受等情況[11]，而玉液湯可能對ABC轉運體進行調控，從而對2型糖尿病起調控作用。本研究發現，玉液湯對2型糖尿病的調控亦與鈣信號通路有關，可促進AKT活化和鈣相關的eNOS活化，并參與了調節AKT2B1抑制HUVECs的胰島素敏感性[12]。

綜上所述，玉液湯具體多靶點、多通路的特點，可能透過調控ALB，CYP3A4，MAOB，SLCO1B1， ABCA1等多個靶點，以及作用于神經活性配體-受體相互作用、過氧化物酶體增殖物激活受體信號通路、膽汁分泌、5-羥色胺能突觸、ABC轉運蛋白、鈣信號通路等多條通路對2型糖尿病起到治療作用。但鑒于網絡藥理學的局限性，本研究未發現基因表達與通路的正負調節關系，因此仍需進一步探索玉液湯作用于2型糖尿病的機制。