劉氏正骨方2號對過表達(dá)Sclerostin腺病毒轉(zhuǎn)染后BMSCs促成骨分化的影響

俞云飛， 王建偉， 馮 驊， 尹 恒， 華 臻， 吳 毛

(無錫市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 無錫 214000)

骨折愈合是指骨折位置出現(xiàn)骨組織連續(xù)性修復(fù)。長骨骨折延遲愈合或不愈合的發(fā)生率高達(dá)5%～10%[1]，對患者及社會造成較為嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)，目前西醫(yī)治療主要包括手術(shù)、局部骨生長因子注射以及電磁波等物理治療，雖可取得一定療效，但存在局限性。祖國醫(yī)學(xué)將骨不連其歸屬到“骨痿”“骨虛”范疇，認(rèn)為骨不連的形成與肝、脾、腎關(guān)系密切[2]，“劉氏骨傷”作為無錫市非物質(zhì)文化遺產(chǎn)[3]，多年來總結(jié)、完善形成的經(jīng)驗方——劉氏正骨方2號，臨床驗證效果確切[4-6]，但對其作用機制尚不明確。

近年來骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)作為有關(guān)骨愈合的相關(guān)研究中的明星干細(xì)胞，可在特定條件下向骨折處聚集、遷移并定向分化為骨組織細(xì)胞，被廣泛應(yīng)用骨不連、骨質(zhì)疏松、骨與軟骨組織修復(fù)等多種疾病[7]。現(xiàn)代研究表明[8]，多種生物信號因子及信號通路可以調(diào)控骨代謝過程，其中骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)可以通過Smad、Wnt等信號通路參與BMSCs成骨分化過程[9]。硬骨素(Sclerostin/SOST)主要表達(dá)于軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞等骨源性細(xì)胞[10]，早期研究被作為BMP的抑制劑，抑制BMSCs增殖和成骨方向分化的同時，還可以促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡、降低細(xì)胞鈣化沉積作用[11]。近期研究表明[12]，Sclerostin主要通過抑制Wnt信號通路激活，而非既往認(rèn)為的直接抑制Smad通路參與骨代謝的調(diào)節(jié)。Wnt信號通路激活可促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，是BMSCs成骨分化的關(guān)鍵途徑[13]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[10]，通過siRNA抑制Sclerostin基因可以促進(jìn)BMSCs體外成骨分化過程。因此，本研究通過觀察劉氏正骨方2號對BMSCs體外成骨分化過程中Sclerostin基因及Wnt信號通路的影響，探討劉氏正骨方2號促進(jìn)骨折愈合的可能作用機制，為其作為誘導(dǎo)劑應(yīng)用于骨組織工程治療骨不連提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 動物 5～6周齡清潔級SD大鼠，體質(zhì)量200～250 g，雌雄比例1∶1，共30只，購自揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，動物生產(chǎn)許可證號 SCXK(蘇)2017-0007。本研究經(jīng)無錫市中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批件號 2018020)。

1.2 試劑和儀器 DMEM(貨號SH30022.01，美國HyClone公司)；胎牛血清(貨號12662-029，美國Gibco公司)；CCK-8試劑盒(貨號ab228554，英國Abcam公司)；QuontiChrom鈣分析試劑盒(美國BioAssay Systems公司)；茜素紅(貨號A5533，美國Sigma公司)；重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)(貨號120-02-50，加拿大PeproTech公司)；一抗Col1A2(貨號ab96723)、OCN(貨號ab13420)、OPN(貨號ab8448)、Sclerostin(貨號ab63097)、LRP5(貨號ab203201)、Runx2(貨號ab23981)、β-catenin(貨號ab6302)、GAPDH(貨號ab9485)均購自英國Abcam公司；二抗山羊抗兔抗體(貨號7074)、馬抗小鼠抗體(貨號7076)均購自美國CST公司；實時PCR試劑盒(貨號FSQ-201，日本Toyobo公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號K1622，美國Fermentas公司)；ALP定量檢測(貨號P0321S)總蛋白提取試劑盒(貨號P0033)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(貨號P0012A)、BeyoECL Plus(貨號P0018M)均由上海碧云天生物技術(shù)有限公司提供。實時PCR儀(LightCycler480，瑞士Roche公司)；NanoDrop 2000(美國Thermo&Scintific公司)；細(xì)胞計數(shù)儀、Trizol(美國Invitrogen公司)。

1.3 方法

1.3.1 含藥血清制備 劉氏正骨方2號(丸劑)主要由地鱉蟲2 g、血竭1 g、續(xù)斷3 g、川芎1 g、沒藥1 g、白術(shù)1 g、熟地5 g、自然銅1 g等藥材組成，均由無錫市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科王卿副主任中藥師鑒定為正品由為無錫市中醫(yī)醫(yī)院藥劑室統(tǒng)一制備，再將其分為甲組(地鱉蟲2 g、血竭1 g、續(xù)斷3 g、川芎1 g等)和乙組(沒藥1 g、白術(shù)1 g、熟地5 g、自然銅1 g等)。甲組烘干，打成細(xì)粉，混合均勻；乙組煎湯，濃縮成稠膏，將2組混合均勻，采用泛制法制成濃縮丸，成藥一付約21 g，成年人臨床推薦藥量為1 d 2次，每次1.5 g，將其溶解、濃縮至17.5 g/L，瓶裝，封蓋，滅活，置于4 ℃冰箱中保存。取相同劑量的0.9%氯化鈉溶液，配制對照溶液。

每只大鼠每天共給藥0.07 g(約4 mL)，8點、20點分別灌服1次，連續(xù)7 d，第7天上午8點灌注全天量。給藥后1 h下腹主動脈采血，經(jīng)靜置、離心、滅活補體、過濾除菌等步驟制備含藥血清，在-20 ℃下保存?zhèn)溆谩？瞻籽褰M大鼠給予等量生理鹽水灌胃給藥。

1.3.2 BMSCs分離與培養(yǎng) 大鼠斷頸處死后消毒，剝離折斷脛骨、股骨，用含雙抗PBS液(青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL)沖洗出骨髓細(xì)胞，離心去上清液，PBS重懸，細(xì)胞計數(shù)，按4×105/cm2濃度將細(xì)胞均勻接種于MGM培養(yǎng)基上，加入10%FBS、1%雙抗，置于37 ℃、5%CO2環(huán)境的恒溫箱中培養(yǎng)，每3 d換液1次，繼續(xù)培養(yǎng)7 d后收集細(xì)胞，取一部分用于實驗，另一部分液氮冷藏保存。

1.3.3 BMSCs成骨分化誘導(dǎo) 將BMSCs按1×105/cm2濃度接種于6孔板，使用含MGM培養(yǎng)基的成骨誘導(dǎo)液(100 nmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 mg/L抗壞血酸)培養(yǎng)24 h后，依據(jù)干預(yù)培養(yǎng)條件分為空白對照組(20%空白大鼠血清)、中藥組(20%含藥大鼠血清)、BMP-2組(50 ng/mL BMP-2)，每3 d換液1次，共培養(yǎng)28 d。采用CCK-8檢測細(xì)胞活性，實時熒光PCR、Western Blot檢測成骨分化相關(guān)分子(Col1A2、OCN、OPN)及Sclerostin mRNA、蛋白表達(dá)，ALP、茜素紅染色檢測細(xì)胞礦化程度。

1.3.4Sclerostin過表達(dá)重組腺病毒載體構(gòu)建 NCBI數(shù)據(jù)庫查詢參考核苷酸序列Sclerostin(ID80722，669 bp)，采用 Primer5.0設(shè)計PCR引物，KpnⅠ、NotⅠ酶切位點添加在兩邊，將穿梭質(zhì)粒相連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài) DH5α，對提取的重組穿梭質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定，將鑒定正確的重組腺病毒包裝質(zhì)粒命名為過表達(dá)Sclerostin[14]。收集對數(shù)期3代BMSCs，將BMSCs制成濃度為1×104/mL的懸浮液，按每孔2 000個接種于96孔板培養(yǎng)皿，置于37 ℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h后，使用包裝好的重組腺病毒顆粒轉(zhuǎn)染BMSCs(MOI=50)。為驗證過表達(dá)轉(zhuǎn)染效率，將處于對數(shù)生長期3代的BMSCs細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板上，每孔1.5×105個細(xì)胞，24 h后待細(xì)胞融合為40%～50%時進(jìn)行干預(yù)，分組為未使用重組腺病毒轉(zhuǎn)染的BMSCs(NT組)、使用空載腺病毒顆粒轉(zhuǎn)染的BMSCs(Ad-null組)、使用包裝好的重組腺病毒顆粒轉(zhuǎn)染BMSCs(Ad-SOST組)，3組細(xì)胞均預(yù)處理(不轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)染)24 h后棄除原有培養(yǎng)基，再使用含20%FBS的普通培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h，收集樣本進(jìn)行檢測分析，使用實時熒光PCR、Western Blot檢測Sclerostin表達(dá)效率。

1.3.5 中藥血清干預(yù)過表達(dá)Sclerostin重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染BMSCs BMSCs細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，分為NT組、Ad-SOST組，分別使用空載腺病毒(NT組)、過表達(dá)Sclerostin重組腺病毒轉(zhuǎn)染24 h(Ad-SOST組)，再分別置換為含20%空白大鼠血清、20%含藥血清干預(yù)3 d，采用CCK-8法檢測細(xì)胞活性，實時熒光PCR、Western Blot檢測Wnt信號通路相關(guān)分子LRP5、β-catenin、Runx2的mRNA、蛋白表達(dá)。

1.3.6 主要檢測方法

1.3.6.1 CCK-8法 將BMSCs按1×107/cm2濃度接種于96孔板上，在37 ℃、5%CO2下培養(yǎng)24 h后進(jìn)行干預(yù)，設(shè)立空白對照組，每組3個復(fù)孔，分別干預(yù)3、14、28 d后，按照CCK-8試劑盒操作步驟進(jìn)行實驗，酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測各孔吸光度(A)，計算細(xì)胞活性，公式為細(xì)胞活性=[(加藥板A值-空白板A值)/(無加藥板A值-空白板A值)]×100%。

收集細(xì)胞樣品，抽取總RNA，以2 μg反轉(zhuǎn)20 μL體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以檢測目的基因mRNA表達(dá)，將反轉(zhuǎn)的cDNA稀釋5倍，進(jìn)行實時PCR，擴(kuò)增體系為10.0 μL，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 25 s擴(kuò)增50個循環(huán)；溶解曲線分析95 ℃ 5 s，發(fā)現(xiàn)為單一峰，說明是特異性擴(kuò)增；陰性對照為ddH2O，以GAPDH為內(nèi)參，每個模板3個復(fù)孔，采用相對定量2-△△CT法分析，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3.6.2 Western blot法 收集細(xì)胞樣品，PBS清洗2次，按100∶1比例加入蛋白提取緩沖液RIPA、蛋白酶抑制劑PMSF提取蛋白，置于冰上30 min后在4 ℃、12 000 r/min下離心10 min，吸除上清，在 -20 ℃下保存。采用BCA法檢測蛋白濃度，SDS-PAGE電泳，0.22 μm PVDF膜轉(zhuǎn)膜，5%BSA封閉1 h，4 ℃一抗孵育過夜后用0.05%TBST充分洗滌，孵育二抗，常規(guī)ECL發(fā)光液顯色。

1.3.6.3 茜素紅、ALP染色及鈣含量測定 在成骨誘導(dǎo)的第28天，使用固紫B試劑盒及茜素紅染色法進(jìn)行染色，并通過倒置顯微鏡觀察拍照記錄。按照堿性磷酸酶分析試劑盒操作步驟，進(jìn)行ALP定量檢測(405 nm波長處吸光度)。按照QuantiChrom鈣分析試劑盒操作步驟，進(jìn)行鈣含量測定(584 nm波長處吸光度)。

2 結(jié)果

2.1 劉氏正骨方2號含藥血清對BMSCs體外成骨分化及Sclerostin的影響 與對照組(1.033±0.092)比較，中藥組(1.557±0.241)、BMP-2組(5.843±0.289)BMSCs中ALP活性增強(P<0.05)；與對照組(1.047±0.026)比較，中藥組(2.047±0.315)、BMP-2組(4.883±0.694)細(xì)胞中鈣沉積程度增加(P<0.05)，見圖1。

注：A為ALP、茜素紅染色，B為ALP活性，C為鈣含量。與對照組比較，aP<0.05；與中藥組比較，bP<0.05。圖1 各組BSMCs細(xì)胞礦化程度

成骨誘導(dǎo)28 d后，與對照組[(106.1±3.7)%]比較，中藥組[(145.7±19.7)%]細(xì)胞活性增強(P<0.05)，BMP-2組[(83.7±5.4)%]降低(P<0.05)；中藥組、BMP-2組BMSCs成骨相關(guān)分子(Col1A2、OCN、OPN)mRNA、蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05)；中藥組Sclerostin mRNA、蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，但BMP-2組SclerostinmRNA表達(dá)上調(diào)(P<0.05)。見圖2。

注：A為細(xì)胞活性，B～D分別為Col1A2、OCN、OPN mRNA表達(dá)，E為Sclerostin mRNA表達(dá)，F(xiàn)為Col1A2、OCN、OPN、Sclerostim蛋白表達(dá)。與對照組比較，aP<0.05；與中藥組比較，bP<0.05。圖2 各組BSMCs中成骨相關(guān)基因與Sclerostin mRNA、蛋白表達(dá)

2.2 腺病毒轉(zhuǎn)染BMSCs過表達(dá)Sclerostin與NT組[(105.2±5.5)%]比較，Ad-null組[(91.5±12.1)%]BMSCs細(xì)胞活性無明顯變化(P>0.05)，而Ad-SOST組[(57.9±5.4)%]降低(P<0.05)；與NT組(1.066±0.046)比較，Ad-null組(1.048±0.054)Sclerostin mRNA、蛋白表達(dá)無明顯變化(P>0.05)，而Ad-SOST組(1.719±0.202)升高(P<0.05)，見圖3。

注：A為細(xì)胞活性，B為Sclerostin mRNA表達(dá)，C為Sclerostin蛋白表達(dá)。與NT組比較，*P<0.05。圖3 重組腺病毒轉(zhuǎn)染BMSCs后Sclerostin mRNA、蛋白表達(dá)

2.3 劉氏正骨方2號含藥血清對過表達(dá)Sclerostin腺病毒轉(zhuǎn)染BMSCs細(xì)胞活性的影響 與空白血清比較，培養(yǎng)24、72 h后含藥血清可提高NT組、Ad-SOST組細(xì)胞活性(P<0.05)，見表2。

表2 血清干預(yù)后過表達(dá)Sclerostin腺病毒轉(zhuǎn)染后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的活性

2.4 劉氏正骨方2號含藥血清對過表達(dá)Sclerostin腺病毒轉(zhuǎn)染BMSCs的LRP5、β-catenin、Runx2表達(dá)的影響 空白血清組中，與NT組比較，Ad-SOST組LRP5、β-catenin、Runx2表達(dá)下調(diào)(P<0.05)；含藥血清干預(yù)后，NT組、Ad-SOST組三者表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，但不能完全阻斷Sclerostin過表達(dá)引起的三者表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，見圖4。

注：A～C分別為LRP5、β-catenin、Runx2 mRNA表達(dá)，D為Western Blot檢測。與同組空白血清組比較，*P<0.05；與NT組同一血清比較，△P<0.05。圖4 劉氏正骨方2號含藥血清對過表達(dá)Sclerostin腺病毒轉(zhuǎn)染BMSCs的LRP5、β-catenin、Runx2表達(dá)的影響

3 討論

骨不連是骨科康復(fù)醫(yī)療過程中較為棘手的難題，是骨折遠(yuǎn)期嚴(yán)重并發(fā)癥[15-16]。祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為骨不連的形成與肝、脾、腎關(guān)系密切，且以腎的強弱最為關(guān)鍵。腎主骨髓以養(yǎng)骨，骨髓為腎精所化生，骨骼的生長、發(fā)育、修復(fù)均賴腎氣的滋養(yǎng)。我科經(jīng)驗方—劉氏正骨方2號以補腎活血方為基礎(chǔ)經(jīng)多代傳人總結(jié)、完善形成并入選無錫市非物質(zhì)文化遺產(chǎn)，該方中杜仲、骨碎補、自然銅入腎經(jīng)，補腎壯骨，續(xù)骨止痛；土鱉蟲、熟地主入肝經(jīng)，土鱉蟲性善走竄，能活血消腫續(xù)筋，熟地補血養(yǎng)陰，填精益髓；諸藥合用共奏“活血祛瘀，接骨續(xù)筋、補腎養(yǎng)肝”之功效，臨床研究表明療效確切[4-6]，但針對其作用機制尚缺乏系統(tǒng)化、深層次的理論研究。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為[7]，骨折愈合的關(guān)鍵在于成骨細(xì)胞誘導(dǎo)的骨組織再生與重建，而成骨細(xì)胞重要來源于干細(xì)胞的定向分化。BMSCs屬于多向分化干細(xì)胞，當(dāng)機體發(fā)生骨折時，細(xì)胞會趨向性遷移、聚集于骨折斷端處并促成骨分化形成骨細(xì)胞，促進(jìn)骨代謝及骨折愈合[8]，而骨形成是由眾多生物信息網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行調(diào)控，其中ALP、Col1A2、OCN、OPN鈣結(jié)節(jié)形成是評估成骨分化程度的重要因素。基于上述中醫(yī)理論及現(xiàn)代研究結(jié)果，課題組為探究劉氏正骨方2號對BMSCs成骨分化的影響設(shè)計實驗。研究結(jié)果表明，使用含劉氏正骨方2號的含藥血清可以有效提高BMSCs的細(xì)胞活性及ALP活性。同時，本研究結(jié)果中茜素紅染色及成骨相關(guān)標(biāo)志基因的表達(dá)情況也證實劉氏正骨方2號含藥血清可以有效促進(jìn)BMSCs體外成骨分化。該實驗研究結(jié)果與既往活血類及續(xù)骨類藥物中藥可促進(jìn)成骨因子誘導(dǎo)的成骨分化與骨代謝結(jié)果相一致[17-18]。

為探究劉氏正骨方2號誘導(dǎo)BMSCs介導(dǎo)的成骨分化作用機制，文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)[19-20]，Sclerostin基因作為BMP抑制物，可以通過抑制BMP因子活性降低骨源性細(xì)胞或成骨細(xì)胞的增殖[21]。本研究結(jié)果：劉氏正骨方2號含藥血清在促進(jìn)BMSCs成骨分化的同時，還可以抑制Sclerostin基因的表達(dá)，提示劉氏正骨方2號促進(jìn)BMSCs成骨分化可能與Sclerostin基因表達(dá)抑制有關(guān)。既往研究及我們前期研究證實[10，22]，siRNA轉(zhuǎn)染沉默Sclerostin基因后可以促進(jìn)BMP-4體外誘導(dǎo)BMSCs成骨分化及細(xì)胞礦化過程。Wnt信號通路是及其下游多種成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和靶基因表達(dá)是成骨分化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[13]；Sclerostin通過與Wnt 通路中關(guān)鍵受體Lrp5/6競爭性結(jié)合，促進(jìn)β-catenin磷酸化來抑制Wnt/β-catenin信號激活以及下游轉(zhuǎn)錄因子Runx2的表達(dá)，而Runx2是正向調(diào)節(jié)BMSCs促成骨分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。因此，本研究采用重組腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)過表達(dá)BMSCs中Sclerostin基因，再使用空白血清和中藥血清分別對其進(jìn)行體外干預(yù)，并觀察Wnt信號通路相關(guān)因子LRP5、β-catenin以及成骨相關(guān)因子Runx2的表達(dá)情況。本次實驗結(jié)果顯示：與空白血清比較，Ad-SOST組LRP5、β-catenin和Runx2因子表達(dá)明顯下調(diào)，含藥血清干預(yù)后NT組和Ad-SOST組中LRP5、β-catenin和Runx2因子表達(dá)呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，但含藥血清不能完全阻斷Sclerostin過表達(dá)引起的LRP5、β-catenin和Runx2因子下調(diào)，提示劉氏正骨方2號含藥血清可以提高抑制Sclerostin過表達(dá)BMSCs的細(xì)胞活性，上調(diào)Wnt通路關(guān)鍵因子LRP5、β-catenin和成骨相關(guān)分子Runx-2因子的表達(dá)，但不能完全拮抗腺病毒轉(zhuǎn)染的Sclerostin過表達(dá)作用，可能還存在其他影響B(tài)SMCs成骨分化的作用機制有待進(jìn)一步探討。

綜上所述，劉氏正骨方2號可以促進(jìn)BMSCs成骨分化，該作用可能與抑制Sclerostin基因、激活Wnt信號通路及其下游Runx2成骨轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)有關(guān)。本研究從中醫(yī)祛瘀、活血、補腎角度探討劉氏正骨方2號促進(jìn)骨折愈合的作用機制，為其作為誘導(dǎo)劑應(yīng)用于骨組織工程治療骨不連提供新的思路。