黃芪果糖制劑對D-半乳糖衰老模型小鼠肌肉與骨骼的影響

梁美婷， 王可欣， 呂思敏， 崔 燎,2， 許碧蓮,2*， 吳 鐵,2*

(1.廣東醫科大學藥理學教研室，廣東 湛江 524023；2.廣東天然藥物研究與開發重點實驗室，廣東 湛江 524023)

骨質疏松癥已成為全球性的公共健康問題和前沿研究難題。骨質疏松與肌肉、骨骼密切相關，老年人骨骼肌肉系統的衰退會造成肌肉減少、骨質減少，進而引起骨脆性增大，最終導致老年人生活質量下降[1]。但是這種骨質疏松與肌肉之間的聯系尚未得到廣泛接受，如何解決老年性肌肉減少癥所帶來的骨脆性風險是一個不可忽視的問題，黃芪含有多糖、黃酮、苷類和微量元素等多種成分[2]。現代藥理實驗證實[3]，黃芪對骨質疏松癥有較好的預防和治療效果。除此之外，黃芪還具有增強肌肉收縮力，提高耐力和促進疲勞消除等保護骨骼肌的作用[4]。果糖升糖指數低，可以不經過胰島素途徑迅速進入細胞組織，有利于老年人肌肉組織和骨骼組織的能量需求，有助于蛋白質的合成代謝，黃芪與果糖組成的合劑，應該具有增強肌肉和骨骼的蛋白質合成功能、對老年人預防肌肉減少與骨質疏松具有良好的作用，本研究建立D-半乳糖小鼠的衰老模型，探討黃芪果糖制劑是否可通過作用于骨骼-肌肉系統，有效地預防肌減少所帶來的骨質疏松風險，對黃芪果糖制劑在防治老年性肌肉減少癥和骨質疏松癥的開發應用提供一個參考依據。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級白色昆明雄性小鼠50只，17周齡，體質量35～40 g，購于南方醫科大學動物中心，實驗動物使用許可證號SYXK(粵)2015-0147。在普通級動物飼養房內飼養，動物于實驗前適應環境1周，自由攝食飲水，每籠10只。

1.2 藥物 黃芪(湖北金貴中藥飲片有限公司，批號A171102，產地甘肅)；甘草(廣州市怡康藥業有限公司，批號C170702，產地甘肅)。D-半乳糖(北京索萊寶科技有限公司,批號923C057)；生理鹽水(石家莊四藥有限公司，批號1603032103)；果糖(廣東永青生物科技有限公司，批號16110401)；骨化三醇(瑞士Roche公司，批號B2166B05)。

1.3 儀器 AE240電子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；Micro-CT viva CT40儀(瑞士Scanco公司)；858 Mini Bionix型材料測試系統(美國Mst公司)；KQ-250DE數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Spring實驗室純水儀(廣州譽維生物科技儀器有限公司)；JB-P5生物組織包埋機(武漢俊杰電子有限公司)；石蠟切片機(德國Leica公司)；熒光顯微鏡普通光學顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.4 實驗方法 取上述小鼠按隨機區組法，將動物分別按體質量區分為若干個區組，然后將各區組通過隨機函數Rand平均分配到5組，每組10只，具體為(1)正常組，小鼠按0.1 mL/10 g灌胃給予生理鹽水，并背部注射生理鹽水；(2)模型組，每天背部皮下注射150 mg/kgD-半乳糖(用生理鹽水溶解D-半乳糖，濃度為0.083 mol/L)，連續12周，造成衰老模型，并按0.1 mL/10 g灌胃給予生理鹽水[5]；(3)骨化三醇干預組，造模方法同模型組，然后按0.076 μg/kg灌胃骨化三醇溶液(骨化三醇混懸液配制方法為0.25 μg/粒骨化三醇軟膠囊，加2 mL吐溫80，再加入30 mL蒸餾水，最后超聲提取0.5 h，避光保存)；(4)果糖干預組，造模方法同模型組，然后小鼠按每天1.2 g/kg灌胃給予果糖溶液(果糖溶液配制方法為稱取12 g果糖，加入煮沸后放涼的雙蒸水攪拌溶解，定容至100 mL)；(5)黃芪果糖制劑干預組，造模方法同模型組，然后小鼠按每天10 g/kg灌胃黃芪果糖制劑溶液(用黃芪、甘草，按3∶1比例用水提取3次，濃縮至含黃芪生藥量為1 g/mL，最后加入的果糖質量分數為0.12 g/mL，混勻)。所有小鼠于適應性喂養1周后開始實驗，連續給藥12周。實驗過程中每天觀察小鼠進食、飲水、活動情況等變化并記錄，7 d稱體質量1次，并按體質量變化調整給藥量。實驗結束時，采用眼球取血處死小鼠。取雙側股骨做Micro-CT掃描以及生物力學三點彎曲實驗，取腓腸肌稱定質量、HE染色并進行組織學觀察。

1.5 觀察指標及測定方法

1.5.1 小鼠體質量 每周稱小鼠體質量1次，實驗第12周在實驗結束前停止供應飼料12 h，稱重，作為最終的體質量。

1.5.2 小鼠腓腸肌 實驗結束時小鼠處死，解剖取出完整的腓腸肌，精確稱量濕重，計算臟器系數，臟器系數計算公式是臟器系數=(器官濕重/體質量)×100%[6]。HE染色為取小鼠腓腸肌，橫向切取0.5 cm3大小的腓腸肌組織，浸入4%多聚甲醛中固定12 h，梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋塊用于制作石蠟切片。HE 染色后，采用LEICA MP30熒光顯微鏡及顯維照相機采集圖片并進行組織學觀察。

1.5.3 小鼠股骨的生物力學分析 測試時，將-80 ℃保存的股骨室溫解凍，用酒精-生理鹽水復濕，進行試驗。實驗時，用858 Mini Bionix型材料測試系統分析右側股骨的三點彎曲實的生物力學性能。把小鼠股骨放在MTS試驗機上，加載速度為0.155 mm/s，跨距5 mm。由載荷、橈度換算并繪制應力-應變曲線，從曲線上讀取及根據公式計算相應的指標: 最大載荷、斷裂載荷、彈性載荷、剛度等[7]。

1.5.4 Micro-CT對小鼠股骨的分析 將小鼠股骨除盡肌肉和附著組織，放入Micro-CT儀，對股骨干骺端進行X射線掃描。viva CT40選擇掃描參數: 圖像矩陣為2 048×2 048，整合時間為200 ms，能量/強度為70 kVp，114 μA，8 W，以0°旋轉進行掃描。掃描完成后，選取距生長板遠端1.0 mm、層厚2.0 mm的骨組織為松質骨感興趣區域(ROI)行三維重建，以最低閾值為150提取圖像信息。定量分析使用其軟件(Scanco Medical AG)，分析參數。參數如下：連接密度(connectivity density, Conn.D.)、結構模型指數(structure model index,SMI)、骨密度(bone mineral density, BMD)、骨體積分數(bone volume/tissue volume, BV/TV)、骨小梁數量(trabecular number, Tb.N)、骨小梁厚度(trabecular thickness, Tb.Th)、骨小梁分離度(trabecular separation, Tb.Sp)[7]。

2 結果

2.1 各組小鼠體質量的變化 各組小鼠體質量的變化見表1，可見開始用藥前，各組間小鼠體質量差異無統計學意義。在實驗結束時，各組小鼠體質量均有增加，但各組間小鼠體質量差異仍無統計學意義(P>0.05)。

表1 各組小鼠體質量的變化

2.2 各組小鼠腓腸肌質量的變化 各組小鼠腓腸肌質量的變化見表2，可見與正常組比較，模型組的腓腸肌質量和腓腸肌重/體質量比稍有下降趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)，說明D-半乳糖對雄性小鼠腓腸肌質量影響不大。與模型組比較，骨化三醇干預組的腓腸肌質量和腓腸肌重/體質量比差異亦無統計學意義(P>0.05)，說明骨化三醇不影響D-半乳糖雄性小鼠腓腸肌的質量；與模型組比較，果糖干預組的腓腸肌質量和腓腸肌重/體質量比分別增加13.29%(P<0.05)和14.06%(P<0.05)，說明12%果糖可以增加D-半乳糖雄性小鼠腓腸肌的質量；而黃芪果糖干預組的腓腸肌質量和腓腸肌重/體質量比分別增加18.50%(P<0.05)和11.72%(P<0.05)，說明黃芪果糖制劑可以明顯增加D-半乳糖雄性小鼠腓腸肌的質量。

表2 各組小鼠腓腸肌肌重和腓腸肌/體質量比的變化

2.3 各組小鼠腓腸肌HE染色及結果觀察 各組小鼠腓腸肌HE染色結果見圖1，由此可見，正常組肌細胞結構均一，細胞間隙較小。模型組與正常對照組比較，肌細胞大小不一，形態不規整，細胞間隙增寬，肌細胞圓形化，有肌肉減少的明顯形態學改變。骨化三醇組與正常組無太大差異。與模型組比較，果糖干預組、黃芪果糖干預組的肌細胞形態規則，結構清晰，連接有序且緊湊，沒有肌肉減少的形態學變化，與正常組相比較接近，提示應用12%果糖、黃芪果糖制劑可以預防D-半乳糖衰老小鼠腓腸肌肌肉減少的形態學變化。

注：A為正常組, B為模型組, C為骨化三醇干預組, D為果糖干預組, E為黃芪果糖干預組。圖1 各組小鼠腓腸肌橫切面HE圖(5 μm, ×200)

2.4 各組小鼠股骨生物力學指標的變化 各組小鼠股骨生物力學指標的變化見表3，可見與正常組比較，模型組小鼠股骨生物力學參數彈性載荷、最大載荷、斷裂載荷有下降趨勢，但差別均未達統計學差異(P>0.05)，提示D-半乳糖對雄性小鼠股骨生物力學性能影響不大。與模型組比較，骨化三醇干預組的彈性載荷、最大載荷、斷裂載荷和剛性系數分別增加58.84%(P<0.05)、53.27%(P<0.05)、36.02%(P<0.05)和36.10%(P<0.05)，提示骨化三醇可明顯增加D-半乳糖雄性衰老小鼠的股骨生物力學性能。果糖干預組的彈性載荷、最大載荷、斷裂載荷有上升趨勢，但差別均未達統計學差異(P>0.05)，提示12%果糖對D-半乳糖對雄性小鼠股骨生物力學性能影響不大。黃芪果糖干預組與模型組比較，其彈性載荷、最大載荷和斷裂載荷分別增加37.61%(P<0.05)、30.90%(P<0.05)和27.03%(P<0.05)，提示黃芪果糖制劑可明顯增加D-半乳糖雄性衰老小鼠的股骨生物力學性能。

表3 各組小鼠骨生物力學性能的變化

2.5 各組小鼠股骨遠端松質骨Micro-CT二維圖和三維圖結果觀察 各組小鼠股骨遠端松質骨 Micro-CT 三維圖和二維圖結果見圖2～3，圖2為各組三維TH圖，反映骨小梁的厚度分布情況，從綠到紅，反映了骨從薄到厚；圖3為各組小鼠股骨遠端松質骨Micro-CT的二維圖，可見骨髓腔內骨小梁數量，可見正常組小鼠的股骨骨小梁較粗，間隙較小，數目較多，連續性較好；而模型組小鼠的股骨則出現了骨小梁斷裂，變短，網狀結構退化，而且在中央還出現較大的間隙。骨化三醇干預組小鼠股骨的骨小梁分布排列均勻有序，緊密，且間隙較小，連續性較好，與對照組無顯著性差異。果糖干預組小鼠的股骨出現了骨小梁斷裂，變短，網狀結構退化，而且在中央還出現較大的間隙，與模型組無顯著性差異。黃芪果糖干預組小鼠股骨的骨小梁分布排列均勻有序，緊密，且間隙較小，連續性較好，與正常對照組無顯著性差異。結果表明，雄性小鼠給予D-半乳糖12周后，小鼠股骨的骨量減少，骨微觀結構受到破壞，與雄性小鼠骨質疏松表現一致，可建立骨質疏松動物模型，骨化三醇和黃芪果糖制劑均可增加D-半乳糖雄性小鼠股骨的骨量，使骨微觀結構得到改善，對該模型的骨質疏松表現有預防作用。

注：A為正常組，B為模型組，C為骨化三醇干預組，D為果糖干預組，E為黃芪果糖干預組。圖2 各組小鼠股骨Micro-CT的與ROI區三維重建圖(TH)

注：A為正常組，B為模型組，C為骨化三醇干預組，D為果糖干預組，E為黃芪果糖干預組。圖3 各組小鼠股骨Micro-CT的二維圖

2.6 各組小鼠股骨Micro-CT掃描形態計量指標的變化 各組小鼠股骨Micro-CT掃描指標的變化見表4～5，可見與正常對照組比較，模型組股骨Micro-CT指標的Conn.D.、BMD、BV/TV和Tb.N分別降低了68.08%(P<0.05)、71.89%(P<0.05)、61.54%(P<0.05)和58.87%(P<0.05)，SMI增加了39.34%(P<0.05)，提示D-半乳糖可以降低正常生長雄性小鼠股骨的骨密度，骨小梁由桿狀結構轉變為板狀結構，骨微結構受到破壞。與模型組比較，骨化三醇干預組股骨Micro-CT指標的BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th分別增加了439.48%(P<0.05)、256.36%(P<0.05)、152.63%(P<0.05)和37.50%(P<0.05)，SMI降低了30.98%(P<0.05)，提示骨化三醇可以改善D-半乳糖雄性小鼠骨丟失的情況，骨小梁由板狀結構轉變為桿狀結構，改善骨小梁的微觀結構；果糖干預組的Conn.D.、BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th有增加的趨勢，SMI和Tb.Sp有降低的趨勢，但差別均無統計學差異(P>0.05)，提示12%果糖對D-半乳糖雄性小鼠骨丟失的情況改善不明顯，亦不能改善骨小梁的微觀結構；黃芪果糖制劑干預組的Conn.D.、BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th分別增加了207.97%(P<0.05)、329.56%(P<0.05)、224.45%(P<0.05)、166.32%(P<0.05)和26.79%(P<0.05)，SMI降低了38.04%(P<0.05)，提示黃芪果糖制劑可以明顯改善D-半乳糖雄性小鼠骨丟失的情況，骨小梁由板狀結構轉變為桿狀結構，改善骨小梁的微觀結構。

表4 各組小鼠股骨Micro-CT掃描參數的變化

表5 各組小鼠股骨Micro-CT掃描參數的變化

3 討論

3.1D-半乳糖對雄性小鼠的骨骼與肌肉的影響 模型組小鼠體腓腸肌質量體質量比稍有下降趨勢，同時石蠟切片HE染色結果可見模型組肌細胞有減少和形態的改變。D-半乳糖對小鼠股骨生物力學性能影響不大，但通過Micro-CT形態學觀察，發現小鼠股骨出現了骨小梁斷裂，變短，網狀結構退化，而且在中央還出現較大的間隙；模型組Conn.D.、BMD、BV/TV和Tb.N降低了，SMI增加，提示了D-半乳糖可造成雄性小鼠骨質疏松和肌肉減少。主要原因與D-半乳糖代謝過程中產生過多的自由基，后者能誘導脂質體氧化，進而損傷細胞有關。

3.2 骨化三醇對D-半乳糖對雄性小鼠骨骼與肌肉的影響 與模型組比較，骨化三醇組的BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th均增加，SMI降低，斷裂載荷、彈性載荷、最大載荷和剛性系數均增加，說明骨化三醇可增加D-半乳糖雄性小鼠的股骨生物力學性能，并且在微觀結構上改善D-半乳糖雄性衰老小鼠骨小梁損傷與骨量丟失的情況。骨化三醇在臨床上治療骨質疏松已經有大量的研究報道，其對骨骼中的鈣磷平衡方面發揮重要調節作用，維持了骨量的平衡，阻止骨質疏松的出現[8]。但骨化三醇并不能同時預防老年骨質疏松與預防老年肌肉減少癥的發生。

3.3 果糖對雄性小鼠骨骼與肌肉的影響 與模型組比較，果糖組對D-半乳糖小鼠的骨生物力學性能、Micro-CT指標等有改善作用；12%果糖組的腓腸肌質量和腓腸肌重/體質量均增加，同時HE染色可見12%果糖組的肌細胞形態規則且飽滿，連接緊湊有序，可以增加D-半乳糖衰老小鼠的腓腸肌肌重，從而預防老年肌肉減少。果糖增加腓腸肌質量的原因還不清楚，可能與果糖進入腸道和肌肉不依賴于胰島素有關，可直接進入腸道被人體消化利用，在肝臟中的代謝速度非常快[9]。除此以外，果糖和葡萄糖在促進腸道果糖吸收、肝臟能量吸收和糖原合成方面具有協同作用，可增加肌肉能量供應[10-11]。

3.4 黃芪果糖制劑對雄性小鼠骨骼與肌肉的影響 與模型組比較，黃芪果糖組增加小鼠腓腸肌質量和腓腸肌指數，通過HE染色觀察，黃芪果糖組的腓腸肌形態學變化與正常組比較較接近，說明黃芪果糖制劑可以預防D-半乳糖導致的肌肉減少。小鼠股骨生物力學指標檢測證明，與模型組比較，其彈性載荷、最大載荷和斷裂載荷均增加，提示黃芪果糖制劑可增強小鼠的股骨生物力學性能。通過Micro-CT對小鼠股骨遠端松質骨進行三維和二維檢測結果可見，與模型組比較，黃芪果糖干預組小鼠股骨的骨小梁分布排列均勻有序，緊密，且間隙較小，連續性較好，與正常對照組無顯著性差異。提示黃芪果糖制劑可增加D-半乳糖雄性小鼠股骨的骨量，使骨微觀結構得到改善。通過Micro-CT對小鼠股骨掃描形態計量指標的比較，黃芪果糖制劑干預組Conn.D.、BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th均增加，SMI則降低，結果證明黃芪果糖可以改善D-半乳糖雄性小鼠骨小梁的微觀結構。黃芪是一味具有補氣益氣作用的中藥，主要含黃芪皂苷、黃芪多糖、多種氨基酸等，有擴張血管、抗自由基損傷、保護心肌等多種藥理作用，是臨床應用較為廣泛的中藥[12-15]。有研究者觀察了黃芪聯合局部熱敷對武警官兵集訓期間機體損傷的保護作用，證明了黃芪聯合熱敷能通過調節氧化與抗氧化平衡來抑制長時間運動中所導致的肌肉損傷[16]。研究結果表明，黃芪對肌肉損傷有較好的保護作用；本課題組早期通過研究證明了黃芪對骨質疏松有很好的延緩作用，可明顯增加骨形成，減少骨丟失，與性激素相類似，可以促進膠原蛋白的合成，促進骨細胞對類骨質的分泌，對破骨細胞有抑制作用，并具有促進骨的形成[17-20]。本實驗研究表明黃芪果糖制劑對骨骼與肌肉均產生有益的作用，這與果糖是一種特殊的能量補充劑且不易升高血糖有著密切關系，果糖可以不通過胰島素途徑直接進入肌肉，直接轉化為肌糖原，及時補充了肌肉組織細胞因能量缺乏導致的代謝障礙，果糖也可以直接進入骨骼細胞，補充細胞的能量，與黃芪配合可以更好地促進受傷肌肉組織與骨骼組織的修復，同時預防肌肉丟失及骨質疏松的發生。因此黃芪和果糖組成的復方合劑，共同發揮了壯骨強肌的作用，是一種可預防老年肌肉減少癥與骨質疏松癥的創新復方制劑。

4 結論

本實驗發現，黃芪果糖制劑可改善該模型小鼠股骨的微觀結構并有助于預防肌肉的衰老和丟失，為肌肉減少性骨質疏松癥提供一個新的防治方案，且具有較好的創新性和潛在應用轉化價值，但單純的 2.5%D-半乳糖雖能在幾個月內造成明顯的骨量丟失但是不能造成明顯的肌肉減少現象，肌肉質量減少只有下降的趨勢。這是本次實驗的不足之處，考慮加大D-半乳糖的劑量是肌肉衰老減少的現象更加明顯。