不同生長年份、生境人參判別方法的研究進展

郭 靜， 陳丹青， 王士祥

(上海上藥神象健康藥業有限公司，上海 200336)

人參是馳名中外的名貴藥材，具有保肝[1]、調節免疫[2]、抗疲勞[3-5]、抗糖尿病[6]、抗腫瘤[7-8]、抗抑郁[9]、治療心腦血管[10-12]和神經系統疾病[13-15]的功效。根據人參生長環境和栽培方式的不同，可以分為園參、林下山參、野山參和野生人參4類。自然傳播、生長于深山密林的原生態人參，稱為野生人參。野生人參是人參中的極品，產量極少，資源瀕臨枯竭，且不允許私自采挖和買賣，因此市場上以園參、林下山參和野山參為主。其中人工栽培的人參俗稱“園參”；播種在山林野生狀態下自然生長的人參稱“林下山參”，習稱“籽海”；播種后自然生長于深山密林15年以上的人參，可稱為野山參[16]。野山參價值不菲，經常單支售價過萬，林下山參價格從每公斤幾千到十幾萬元不等，而園參的價格僅為每公斤數百至千元。參齡是影響人參品質的重要因素，也是野山參分等定價的重要依據。園參的商品年限多在4～5年，一般不超過6年，林下山參的商品年限多在10年以上，野山參的商品年限多在20年左右。目前不同生境的人參及其生長年份的判別仍以經驗鑒別為主，蘆、艼、體、紋、須、皮、點等方面的外觀特征是其主要的鑒別要點[17-18]，但該方法過于主觀，評價結果不具備可重復性，對鑒定者的鑒別經驗也有極高的要求。近年來得益于現代科技的快速發展，與人參判別相關的技術方法層出不窮，但尚無文獻對其進行系統的整理，本文現就園參、林下山參、野山參及其生長年份的判別方法進行綜述，以期為市售人參的質量評價和年份判別提供參考。

1 不同生境人參的年份判別

參齡和生長環境對人參化學成分和內在品質有著極大的影響，而目前《中國藥典》僅以人參皂苷Rg1、Re和Rb1含量作為檢查指標，方法過于簡單，不能凸顯出不同生長年份人參的成分差異，也無法用于園參、林下山參及野山參等不同生境人參的科學判別。本文對上述3種常見人參的年份判別方法進行了整理，但由于目前尚無野山參年份判別的針對性報道，而常與園參、林下山參一起作為試驗對象進行分類識別，故后續僅對園參的年份判別、林下山參的年份判別以及園參、林下山參、野山參的分類判別方法進行歸納。

1.1 園參的年份判別

1.1.1 顯微鑒別 通過觀察人參的顯微結構可以快速鑒別人參真偽，而根據顯微特征物的變化還可以初步比較人參年份的長短。鄭秀茜等[19]采用顯微定量法，以人參的草酸鈣簇晶為顯微特征物，根據不同年限不同部位特征物含量及形態上的差異對1～7年生園參進行了鑒別，發現蘆頭內的草酸鈣簇晶含量明顯高于其他部位，且隨著生長年限的增加，全參、蘆頭、主根、側根、須根中草酸鈣簇晶的含量明顯上升且體積逐漸增大。而隨著年限的增長，2～5年生石柱參須根中草酸鈣簇晶的含量呈逐漸降低的趨勢。這表明基于特征物的形態和含量變化，顯微鑒別法可用于樣本量較少時同種園參樣本間年限長短的快速比較，但尚不能對單個園參樣本的品種及生長年限進行判別或預測。

1.1.2 成分鑒別 基于不同生長年限園參中多種成分含量的差異，結合現代檢測分析技術，可以較為準確的判別和預測園參年份。這些檢測分析技術主要分為光譜法、色譜法、質譜法及色譜-質譜聯用等方法，其中光譜法又包括紅外光譜法和紫外光譜法，而色譜法則以液相色譜法為主。

1.1.2.1 光譜法 光譜法分紅外光譜法和紫外光譜法。其中紅外光譜法高效、快速，可用于人參的定性和定量分析，還可以實現對人參品種和年份的初步判別。Kwon等[20]比較了4個品種的1、2、3年生園參葉的紅外光譜，并將其數據進行量化，發現不同品種和生長年份的園參葉在多糖、酰胺等代謝成分的組成和含量上均存在明顯差異，并基于此差異建立了PLS-DA判別模型，可以有效的判別和預測園參葉的生長年份，準確率達94.8%。紫外光譜法以紫外分光光度法為主，在園參總皂苷含量的分析測定中較為常用。麻銳等[21]利用紫外分光光度法測定了1～5年生園參的總皂苷含量，對比發現園參總皂苷含量隨生長年限的增加而顯著增加，其中5年生園參是1年生園參的近4倍。

1.1.2.2 液相色譜法 液相色譜法是色譜法中應用最為普遍的一種方法，在園參的年份判別研究中多用于分析皂苷類成分含量的整體變化趨勢。余江鋒等[22]采用HPLC技術測定了吉林撫松3～9年生園參中8種人參皂苷的含量，結果發現人參皂苷Rg1含量隨生長年限的增長而逐漸增加，而8種人參皂苷的總含量與人參皂苷Rg1含量的比值，及人參皂苷Re、Rb1、Rc、Rd含量與人參皂苷Rg1含量的比值均呈逐年下降趨勢(P<0.01)。麻銳等[21]通過HPLC法分析了1～5年生園參中6種常見人參皂苷的含量，發現皂苷含量整體呈現逐年遞增趨勢，其中人參皂苷Rb1、Rb2含量隨年限顯著遞增，Rg1、Rc、Rd呈現逐年緩增趨勢，而Re含量在第3年最高，隨后趨于平緩。

1.1.2.3 質譜法 質譜是一種測量離子荷質比的分析方法，具備高特異性、高靈敏度和廣適性，可以在一次分析中提供豐富的結構信息。Bai等[23]采用MALDI-TOF-MSI和MALDI-TOF-MS/MS技術建立了一種有效探索人參皂苷分布規律的方法，并對2、4、6年生園參根進行了定位研究，發現人參皂苷類成分主要集中在形成層以外的韌皮部和皮層中，且以m/z1 117(Rb2/Rc)和m/z1 147(Rb1)處質譜峰所對應的人參皂苷在園參中的含量高于其他成分(P<0.01)，二者峰強度之比可以用于園參和西洋參的區分，以及不同年份園參的鑒別。

1.1.2.4 液相色譜-質譜聯用 液相色譜-質譜聯用技術具有廣適性好、分離能力強、檢測限低、靈敏度高等優點，是植物代謝組學中最重要的分離和鑒定的分析方法之一，在園參年份判別的研究中應用也極為廣泛。Xiu等[24]采用HPLC-MRM/MS技術對不同生長年份園參中14種皂苷類成分進行定量研究，并基于人參皂苷Rg1、Rb1、Rb2、Rc、20(S)-Rf、20(S)-Rh1及Rb3在3年生和5年生園參中含量的顯著差異，建立了PLS-DA模型，準確的判別了園參的年份。張博等[25]采用RRLC-Q-TOF-MS技術發現，3年生和5年生園參中人參皂苷Rb1、Rh4、Rk2等11種成分存在顯著性差異，其中人參皂苷 Rb1、Rk2和 Rh4等成分含量呈現隨生長年限增長而增加的趨勢，人參皂苷Rg1、Rf、Rh1、Rb1等10種成分在不同產地間存在顯著性差異，而基于上述差異可以為人參生長年限和產地的判斷提供一定的信息。Huang等[26]采用UHPLC-QTOF/MS技術對2～6年生園參的整體代謝物質進行研究，結果發現基于35種與糖類、有機酸、脂類、氨基酸和皂苷相關的成分含量存在顯著差異。糖類成分的積累與園參生長年限呈顯著正相關(R2>0.9)；3～5年生園參中氨基酸和皂苷類成分含量高于2、6年生園參，而丙二酰人參皂苷Rd和丙二酰人參皂苷Rc/Rb2含量卻隨著生長年限的增加呈逐漸減少趨勢；3～5年生園參中以氨基酸和有機酸含量差異較為明顯。此外，該研究發現了1種2年生園參的缺失性成分，該成分有可能作為鑒別2年生園參的依據。還建立了差異代謝物峰面積總和與園參生長年限之間的回歸方程，用以預測和判別3～6年生園參樣本的生長年限，準確率高達91.7%。

1.1.2.5 其他方法 雙向電泳技術可以實現對不同年份園參蛋白質表達差異的研究。麻銳等[27]利用雙向電泳技術分離了1～5年生園參根蛋白，重點分析了3年生和5年生根之間的蛋白質組學差異，結果發現在園參生長發育的過程中存在過氧化氫酶、果膠酯酶等多種蛋白的差異性表達，此外，新穎的電子鼻技術近年來在園參的年份判別研究中也有所應用。Cui等[28]同時采用電子鼻技術和氣相色譜-質譜聯用技術對2～5年生園參中揮發性成分的種類和含量進行了比較，基于差異性成分建立了可以有效區分園參生長年限的判別模型和樹狀圖，還通過分析實驗結果初步發現，電子鼻技術較氣相色譜-質譜聯用技術能更好的應用于園參年份的判別研究。

1.2 林下山參的年份判別

1.2.1 顯微鑒別 基于對林下山參顯微結構及其特征物的觀察，可以快速比較林下山參的生長年份。Liang等[29]從1～6年生二馬牙林下山參主根石蠟切片中觀測到了與其年份相對應的清晰年輪，然而當參齡超過6年時年輪不再清晰，不能精確地反映林下山參生長年限。

1.2.2 成分鑒別 林下山參具有和野山參相似的品質和成分，研究表明光譜法、液相色譜法、質譜法、液相色譜-質譜聯用及分子鑒別等方法適用于不同年限林下山參成分的分析，可以從多水平多角度實現林下山參年份的直接或間接判別。

1.2.2.1 光譜法 光譜法在林下山參年份判別研究中的應用以紅外光譜法為主，基于組織橫切面紅外吸收光譜的差異，可以真正實現林下山參年份的無損識別。而研究表明不同生長年限的林下山參同一掃描部位的近紅外吸收光譜有所不同，當年份一致而掃描部位不同時其吸收光譜也不一樣。卜海博等[30]發現林下山參主根上部為無損識別和生長年限判別掃描的最佳部位，并通過掃描采集了12、15年生林下山參的近紅外光譜，在對光譜進行預處理后結合主成分分析-馬氏距離法，建立了12、15年生林下山參的無損識別模型，并實現了準確分類。紫外光譜法則主要用于林下山參中總皂苷、淀粉、糖類成分含量的測定。Pan等[31]通過測定不同生長年限林下山參和園參的供試品溶液在580 nm處的紫外吸收，發現林下山參中淀粉的量不如園參，且林下山參的生長年限越長，所含淀粉量越低。

1.2.2.2 液相色譜法 液相色譜法在林下山參的化學成分分析中也較為常用，多用于皂苷類成分的定量檢測，再通過對測定結果的分析可以初步得到成分含量隨年份的變化規律。余江鋒等[22]采用HPLC法測定了8～18年林下山參中人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd 8種成分的含量，發現人參皂苷Rb1、Rb2的含量及8種皂苷的總量隨生長年限的增長而明顯增加，人參皂苷Rg1含量隨生長年限的增長先增加后減少，在13～14年時達到峰值，人參皂苷Re在15年時達到峰值，并提出可以根據人參皂苷Rg1含量和人參皂苷Re、Rb1與人參皂苷Rg1的含量比值初步推測其生長年限。楊文志等[32]通過比較林下山參和園參的HPLC圖譜發現，林下山參中人參皂苷Rb1的含量明顯高于園參(P<0.01)，且隨著參齡的增長而增加，而Rg1和Re則表現為下降趨勢。

1.2.2.3 質譜法 質譜分析可與蛋白質組學技術結合，用于分析不同生長年限林下山參中的差異性表達蛋白。Ma等[33]基于蛋白組學技術結合MALDI-TOF/TOF MS分析，發現林下山參中192個差異蛋白的表達量隨年份增長而增加，并推測與能量代謝、人參皂苷生物合成和應激反應相關。其結果還表明隨著生長年限的增加，林下山參的外觀、蛋白表達、皂苷合成能力等與野山參相似度越高，初步證明了林下山參可以作為野山參替代資源的可能性。

1.2.2.4 液相色譜-質譜聯用 與園參一樣，液質聯用技術在林下山參的年份判別研究中應用也極為廣泛，不僅可以對整體代謝物進行分析，最大程度的獲取差異性成分，還能結合統計學方法建立有效的年份判別模型，是目前國內外最常用的前沿分析方法。Chang等[34]通過UHPLC/QTOF-MS技術分析了6～18年生林下山參葉中的成分，發現基于人參皂苷Rb1、Rc、Rb2、Rd、Re、F2等成分含量的顯著差異(P<0.05)，不同年份林下山參葉可以被明確劃分為6～10、11～13、14～18年 3個年份區間，其中人參皂苷Rb1、Rc、Rb2、Rd等8種成分在6～10年內含量較高，人參皂苷Re、三七皂苷Fe、三七皂苷Fd在11～13年內含量較高，人參皂苷F2則在14～18年內含量較高。進一步研究發現，6～10年生參葉主要在人參皂苷Re、三七皂苷R1等10種成分含量上存在明顯差異，11～13年生參葉中人參皂苷Rc、Rb2、Rd等8種成分含量差異顯著，14～18年生參葉中人參皂苷Rb1、Rc、Rb2、Rd等10種成分含量存在明顯差異，根據這些差異可以很好的判別和預測各林下山參樣本的生長年份，為林下山參生長年限的無損判別提供了重要參考。常相偉等[35]基于UPLC-Q-TOF/MS技術還發現11～15年生林下山參蘆頭中的代謝物組成也存在明顯差異，其中包含了290個與年份相關的差異代謝物，基于這些代謝物在含量上的顯著差異，再通過PCA和OPLS-DA等統計學方法建立了年份判別模型，有效的區分了不同年份的林下山參樣本，為林下山參生長年限的判別又提供了一種新的方法。Zhu等[36]采用UPLC-QTOF/MS技術從林下山參根部篩選出了棕櫚烯酸、24-羥基齊墩果酸、人參皂苷Re1、Re2、Rs1和丙二酰人參皂苷 Rb2、Rb1異構體7個與年份相關的差異代謝物，建立了OPLS-DA模型，成功將12年生和20年生林下山參進行了區分。

1.2.3 分子鑒別 林下山參在分子水平上的年限刻錄主要體現在端粒長度的變化上。黃璐琦課題組基于人參端粒和端粒酶的分子機制，探索了不同產地和品種的林下山參端粒長度與年限的相關性。其中Liang等[29]首先發現，二馬牙林下山參蘆頭下約1厘米主根處的端粒長度是最好的年齡指標，該長度隨著林下山參年限的增長逐漸延長，可用于2～8年生林下山參的年份判別。程春松[37]發現1～14年生石柱參的平均端粒長度隨著年限的增長而縮短，表明林下山參端粒長度的變化趨勢受到品種的影響。此外，該研究還基于端粒分子技術建立了以林下山參生長年限和端粒長度為自變量的數學模型，并在年份刻度明顯、生長環境相似的維管植物赤芍中得以技術重現，證明了平均端粒的縮短可以作為年份鑒定的指標。該課題組研究從分子水平上提供了一種可操作、可量化、科學準確而又近乎無損識別的林下山參年份判別技術，對于林下山參內在質量的科學把控具有重要意義。

此外，荊禮等[38]通過比較多種內參基因表達量的穩定性，發現延伸因子1-α及V型質子ATP酶亞基B1在各年份林下山參中表達量最穩定，從而提出可以將其作為矯正實時熒光定量PCR數據的內參基因，有助于提高基因表達分析的準確性，也為林下山參分子水平上的年份鑒別研究奠定了基礎。

2 園參、林下山參和野山參的判別

2.1 顯微鑒別 顯微鑒別是一種基于組織切片或粉末的鑒別方法，這種方法以觀察細胞中后含物特征、數量為主。研究表明，園參、林下山參和野山參的顯微特征有所不同。徐世義等[39]發現，園參、林下山參和野山參主根的木質部和須根的橫切面特征存在差別，主要表現為主根橫切面木質部比例隨參齡增長而有所增加，主根簇晶、木質部導管的數量及輻射狀排列的連續程度均隨生長年限的增加呈顯著增加趨勢，而淀粉粒的數量則隨年份增加而顯著減少。

此外，X射線相襯顯微成像技術具有無損、原位、三維定量等優點，文獻[40]報道可以用于園參、野山參等的三維顯微結構的定量分析，并同時掌握草酸鈣簇晶的大小和位置分布信息，在物種鑒定和年齡鑒定等方面具有重要意義。

2.2 紅外光譜鑒別 紅外光譜具有高效、快速、可進行無損檢測等優點，也可用于園參、林下山參和野山參的鑒別。Liu等[41]發現，在1 200～1 000 cm-1范圍內，野山參和林下山參于1 049 cm-1處有最強峰，而園參的最強峰則在1 017 cm-1處；野山參和林下山參在1 318 cm-1處有一極強峰，而園參沒有；野山參和林下山參在1 628 cm-1處有一尖峰，而園參相應位置卻為一拱形峰。Zhang等[42]發現不同生境的人參在紅外光譜和二級衍生光譜1 800～400 cm-1范圍內，以及二維同步相關譜1 730～1 045 cm-1和1 730～1 410 cm-1范圍內差異明顯。基于上述光譜形狀和強度的差異，可能作為園參、林下山參和野山參快速識別的依據。而通過與統計學方法的進一步結合，可更準確、快速、有效的識別園參、林下山參和野山參。另外，卜海博等[30]采集了園參和林下山參的近紅外光譜，并對光譜進行平滑和多元散射校正等預處理后，結合主成分分析-馬氏距離法進行判別分析，所建立的判別模型可以實現園參和林下山參的準確分類。其后續研究采用顯微紅外光譜技術也實現了林下山參和園參的無損判別[43]。

2.3 成分鑒別 基于成分組成和含量差異，研究者們先后報道了多種判別園參、林下山參和野山參的方法，主要以液相色譜法和液相色譜-質譜聯用的方法為主。徐世義[44]建立了野山參、林下山參和園參的HPLC指紋圖譜，指出園參與林下山參差別較大，園參總體成分含量明顯較林下山參低；林下山參與野山參指紋圖譜相似，但野山參所含組分在數量及含量上均高于林下山參，且野山參在保留時間為13 min左右有1個專屬性色譜峰。因此通過HPLC指紋圖譜的比對，也可將園參、林下山參和野山參初步區分開。Xu等[45]采用UPLC-QTOF-MS/MS技術結合主成分分析等對4～7年生園參和15年生林下山參的代謝物差異進行了研究，基于代謝物差異有效區分了園參和林下山參，并篩選了人參皂苷Ra1等12種差異性成分。朱海林[46]采用UPLC-QTOF-MS/MS技術對12～20年生林下山參與4～6年生園參之間的成分差異進行研究，篩選出三七皂苷R1、丙二酰人參皂苷Rb2等11種區別于園參的林下山參差異性成分，其中9種成分未在園參中檢出，而園參中存在人參環氧炔醇等6種區別于林下山參的特異性成分。其后續研究[36]采用UPLC-QTOF/MS技術研究了4～6年生園參、12年和20年生林下山參整體代謝物的差異，篩選出了α-亞麻酸、油酸、亞油酸、人參環氧炔醇、人參皂苷Ro、Rf等17個園參和林下山參的差異代謝物，并建立了OPLS-DA模型，成功將園參和12年生林下山參、園參和20年生林下山參進行了區分。其中α-亞麻酸、油酸、亞油酸和人參環氧炔醇均是園參和12年生林下山參、園參和20年生林下山參的差異代謝物，可能作為鑒別園參和林下山參的依據。

此外，還有研究基于質譜法、凝膠電泳法[47]等對園參、林下山參和野山參中的無機元素、氨基酸、蛋白質等成分種類和含量進行比較，其比較結果也有利于不同生境人參的準確判別。

2.4 分子鑒別 近年來，直接擴增片段長度多態性(DALP)分子標記技術日趨成熟，使得人們可以從分子水平上認識不同生境人參之間的差異，也為其鑒別提供了良好的平臺。王帥等[48]采用DALP分子標記技術，建立了林下山參與園參的DALP指紋鑒定圖譜，經對比篩選出林下山參共有而園參沒有的6條特異性DNA片段，可以作為鑒別林下山參與園參的有效依據。Li等[49]通過對不同人參樣品線粒體nad7內含子3區進行多重比對，發現了俄羅斯野山參特有的SNP位點，并基于該位點的差異成功區分了園參和野山參。基于上述文獻資料，對不同生長年份、生境人參的判別研究進行歸納，見表1。

表1 不同生長年份、生境人參的判別研究

3 結語

園參、林下山參和野山參的栽培方式和生長環境不同，常見的商品年限也有所差異。國內外研究表明，不同生長年份、不同生境的人參在多種成分種類和含量上存在差異，顯微特征及吸收光譜也有所不同，而基于這些差異再結合統計學方法可以建立科學的判別模型，有效判別不同生境的人參及其生長年限。目前研究者們已不局限于對人參皂苷等單一活性成分的研究，而更傾向于對整體代謝物質的比較，力求尋找到與年份、品種、產地相關的差異性或特異性指標成分，為不同年份、不同品種、不同產地人參間的質量和價值差異作出科學解釋。

如何科學準確、快速無損地識別人參產地、品種和生長年限等信息，一直是研究者們努力探索的課題。但就目前而言，野山參年份判別相關的研究甚少，且與移山參等趴貨的差異性成分仍不明確，有待深入系統的探討。此外，國內外文獻中對半野生和野生人參的稱謂都比較混亂，如野生山參、野山人參、林下參、wild ginseng、mountain wild ginseng、wild grown ginseng、cultured/cultivated wild ginseng、forest ginseng、mountain cultivated ginseng等，并未指出其具體的生境，也幾乎沒有樣本圖，這給樣本來源的準確性判斷帶來了極大困擾。建議在今后的比較分析研究中，敘述樣本采集環境，規范統一樣本稱謂，并在文章中保留樣本的圖片資料。