HPLC法同時測定趕黃草中4種成分

史鵬杰， 程嘉希， 黃豆豆， 董志穎， 孫連娜

(上海中醫(yī)藥大學中藥學院，上海 201203)

趕黃草為虎耳草科扯根菜屬植物扯根菜PenthorumchinensePursh的干燥地上部位，別名扯根菜、水楊柳、水澤蘭，具有利水除濕、祛瘀止痛的作用，常用于治療黃疸、經(jīng)閉、水腫跌打損傷等癥[1]，以其為原料的單方制劑在臨床中多用于治療慢性乙肝、急性病毒性肝炎等癥[2-4]，在治療、保護肝損傷等方面也有較多研究報道[5-11]。根據(jù)文獻調(diào)研結果，趕黃草中主要化學成分為黃酮、木脂素及酚酸，一些萜類、酯類、揮發(fā)油類等成分也均有報道[12]。目前，2020年版《中國藥典》中尚未收載趕黃草的質(zhì)量標準，地方質(zhì)量標準僅要求槲皮素含量不少于0.1%，但該成分在趕黃草中含量低，不具備專屬性，無法作為質(zhì)量標志物來評價藥材品質(zhì)。喬松素-7-O-β-D-葡萄糖苷具有較好的抗肝損傷活性[13]，同時連有多個沒食子酰基且成環(huán)的多酚類成分，pinocembrin-7-O-[4″,6″-(S)-hexahydroxydiphenoyl]-β-D-glucose、pinocembrin-7-O-[3″-O-galloyl-4″,6″-(S)-hexahydroxydiphenoyl]-β-D-glucose、thonningianin A亦具有較好的抗肝纖維化活性[7]。此外，亦有報道上述大環(huán)多酚具有一定的降糖活性[8]，具有成為趕黃草質(zhì)量標志物的潛力。在此基礎上，本研究建立了HPLC法同時測定趕黃草中上述4種活性成分的含量，以期更加全面科學地對其質(zhì)量進行評價。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1200型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；XS105DU 電子天平、XS104 電子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；Centrifuge 5810R高速臺式冷凍離心機(德國Eppendorf 公司)；Milli-Q超純水凈化儀(美國Millipore公司)；N-1300旋轉蒸發(fā)儀(東京理化器械株式會社)；SY-360H超聲儀、HWS-24恒溫水浴鍋(上海誠獻儀器設備有限公司)。

1.2 藥物與試劑 喬松素-7-O-β-D-葡萄糖苷對照品(自制，純度≥98%，批號20181117)、pinocembrin-7-O-[4″,6″-(S)-hexahydroxydiphenoyl]-β-D-glucose對照品(自制，純度≥98%，批號20181117)、TH A對照品(自制，純度≥98%，批號20181103)、pinocembrin-7-O-[3″-O-galloyl-4″,6″-(S)-hexahydroxydiphenoyl]-β-D-glucose對照品(自制，純度≥98%，批號20181103)。甲酸(色譜純，德國Merck公司)；水(超純水，Milli-Q超純水凈化儀制備)；乙醇、甲醇(分析純，上海泰坦科技有限公司)；乙腈(色譜純，美國Thermo Fisher Scientific公司)。趕黃草信息見表1，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學孫連娜副教授鑒定為虎耳草科扯根菜屬植物扯根菜PenthorumchinensePursh的干燥地上部分，保存于上海中醫(yī)藥大學中藥資源與生物技術研究中心。

表1 樣品信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm × 250 mm, 5 μm)；流動相0.5%甲酸水(A)- 乙腈(B)，梯度洗脫(0～10 min，28%～30%B; 10～20 min，30%～36%B; 20～22 min, 36%～39%B; 22～30 min, 39%～40%B; 30～35 min, 40%～90%B; 35～37 min, 90%～28%B; 37～40 min, 28%B)；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長280 nm；進樣量10 μL。

2.2 對照品貯備液制備 取各對照品粉末適量，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加80%甲醇制備成喬松素-7-O-β-D-葡萄糖苷、pinocembrin-7-O-[4″,6″-(S)-hexahydroxydiphenoyl]-β-D-glucose、pinocembrin-7-O-[3″-O-galloyl-4″,6″-(S)-hexahydro-xydiphenoyl]-β-D-glucose、thonningianin A質(zhì)量濃度分別為0.302 0、 0.600 8、 0.598 4、 0.499 2 mg/mL的溶液，即得。

2.3 供試品溶液制備 取藥材適量，粉碎，過3號篩，取約1.0 g，精密稱定，置于250 mL圓底燒瓶中，精密加入80%甲醇100 mL，密塞，稱定質(zhì)量，回流提取1 h，放涼，用80%甲醇補足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 專屬性考察 在“2.1”項色譜條件下，上述溶液及空白溶液的色譜圖見圖1。由此可知，供試品溶液中4種成分色譜峰保留時間與對照品溶液一致，空白溶液于相同保留時間處無干擾，表明該方法專屬性良好。

1.喬松素-7-O-β-D-葡萄糖苷 2.pinocembrin-7-O-[4″,6″-(S)-hexahydroxydiphenoyl]-β-D-glucose 3.pinocembrin-7-O-[3″-O-galloyl-4″,6″-(S)-hexahydroxydiphenoyl]-β-D-glucose 4.thonningianin A1.pinocembrin-7-O-β-D-glu coside 2.pinocembrin-7-O-[4″,6″-(S)-hexahydroxydiphenoyl]-β-D-glucose 3.pinocembrin-7-O-[3″-O-galloyl-4″,6″-(S)-hexahydroxydiphenoyl]-β-D-glucose 4.thonningianin A圖1 各成分HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.5 線性關系考察 精密移取對照品貯備液適量，逐級稀釋，依次制得6個質(zhì)量濃度，在“2.1”項色譜條件下進樣。以待測成分質(zhì)量濃度為橫坐標 (X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，結果見表2，表明各成分在各自范圍內(nèi)線性關系良好。

表2 各成分線性關系

2.6 精密度試驗 精密吸取對照品溶液10 μL，在“2.1”項色譜條件下進樣6次，測得喬松素-7-O-β-D-葡萄糖苷、pinocembrin-7-O-[4″,6″-(S)-hexahydroxydiphenoyl]-β-D-glucose、pinocemb-rin-7-O-[3″-O-galloyl-4″,6″-(S)-hexahydroxydi-phenoyl]-β-D-glucose、thonningianin A峰面積RSD分別為0.17%、1.15%、0.18%、0.12%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取藥材(S13)，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，于0、4、8、12、24 h在“2.1”項色譜條件下進樣，測得喬松素-7-O-β-D-葡萄糖苷、pinocembrin-7-O-[4″,6″-(S)-hexahydroxydiphenoyl]-β-D-glucose、pinocembrin-7-O-[3″-O-galloyl-4″,6″-(S)-hexahydroxydiphen-oyl]-β-D-glucose、thonningianin A峰面積RSD分別為1.21%、2.04%、0.81%、0.68%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復性試驗 取藥材(S13)，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，平行6份，在“2.1”項色譜條件下進樣，測得喬松素-7-O-β-D-葡萄糖苷、pinocembrin-7-O-[4″,6″-(S)-hexahydroxydi-phenoyl]-β-D-glucose、pinocembrin-7-O-[3″-O-galloyl-4″,6″-(S)-hexahydroxydiphenoyl]-β-D-glucose、thonningianin A峰面積RSD分別為1.32%、1.02%、0.90%、0.48%，表明該方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗 取藥材(S13)1.0 g，精密稱定，按100%水平加入對照品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，平行6份，在“2.1”項色譜條件下進樣，計算回收率。結果，喬松素-7-O-β-D-葡萄糖苷、pinocembrin-7-O-[4″,6″-(S)-hexahydroxy-diphenoyl]-β-D-glucose、pinocembrin-7-O-[3″-O-galloyl-4″,6″-(S)-hexahydroxydi-phenoyl]-β-D-glucose、thonningianin A平均加樣回收率分別為101.30%、102.04%、100.90%、101.55%，RSD分別為2.54%、0.88%、0.82%、1.43%。

2.10 樣品含量測定 取13批藥材適量，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣，計算含量，結果見表3。

表3 各成分含量測定結果(mg/g，n=3)

3 討論

取“2.2”項下對照品溶液，稍作稀釋，在“2.1”項色譜條件下進行全波長(200～400 nm)掃描，結果顯示280 nm處各待測成分均有較好吸收，而且基線平穩(wěn)，故以其作為檢測波長。對不同公司提供的Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)、Waters Atlantis? T3(4.6 mm×250 mm, 5 μm)、Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，在不同流動相組合(甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.2%甲酸水、乙腈-0.5%甲酸水)下的洗脫效果進行比較，最終選擇分離效果好、重復性佳的Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱、乙腈-0.5%甲酸。對3種常見的提取方法(超聲、回流、冷浸)進行考察，比較各待測成分峰面積，發(fā)現(xiàn)回流法提取效果最佳，提取完全，故確定其為供試品溶液提取方法。采用不同體積分數(shù)甲醇為提取溶劑，比較各待測成分峰面積，發(fā)現(xiàn)80%甲醇提取最為完全，故選擇其為供試品溶液提取溶劑。比較不同回流提取次數(shù)下各成分峰面積，綜合提取效果、考慮耗時、溶劑消耗，選擇提取次數(shù)為1次，隨后考察不同提取時間下各成分峰面積，最終選擇60 min。

4 結論

本實驗建立了HPLC法測定趕黃草中4種成分的含量，發(fā)現(xiàn)在不同產(chǎn)地、批次藥材中均存在一定差異，其中喬松素-7-O-β-D-葡萄糖苷含量相對穩(wěn)定，其他3種波動較大，該結果可為趕黃草的質(zhì)量評價提供參考。