姜黃中1個新的降碳沒藥烷型倍半萜

舒洪珍， 譙明鳴， 熊 亮， 彭 成， 劉 菲*， 郭 力*

(1.成都中醫藥大學藥學院，教育部中藥材標準化重點實驗室，四川 成都 611137；2.西南特色藥材創新藥物成分研究所，四川 成都 611137)

姜科植物姜黃CurcumalongaL.，是著名的川產道地藥材，能活血行氣、通經止痛[1]，在中醫臨床上廣泛用于婦科、傷科、痹癥，療效顯著，是歷代醫家治療血瘀證的常用中藥。姜黃除了治療婦科疾病(如痛經、月經不調)外，還用于動脈粥樣硬化、心力衰竭、心肌肥厚等心血管疾病[2-3]，其化學成分主要分為姜黃素類和萜類，其中萜類又以倍半萜類成分為代表，目前從中分離得到的該類成分達20多種，主要包括吉馬烷型、愈創木烷型、長松針烷型、桉烷型、沒藥烷型、蒈烷型、欖香烷型、蒼耳烷型，其中沒藥烷型倍半萜數量最多[4-6]。課題組前期采用現代色譜分離純化技術從姜黃中分離獲得了一系列沒藥烷型倍半萜以及新穎骨架倍半萜類化合物，發現倍半萜類化合物舒張血管活性顯著[7-8]。在此基礎上，本實驗利用多種分離純化手段對姜黃中倍半萜類成分進行研究，并通過離體大鼠胸主動脈模型對所得化合物進行活性評價，以期獲得更多的新穎活性成分，豐富姜黃的化學成分庫，為新藥的開發利用提供來源。

1 材料

1.1 儀器與試劑 旋光測定儀(安東帕MCP 200旋光儀)；紅外光譜儀，Agilent 1220、Agilent 1100高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；Bruker-600核磁共振波譜儀(德國Bruker公司)；Waters Synapt G2高分辨質譜儀(美國Waters 公司)；圓二色譜儀(英國Chirascan-plus公司)；Gradient Former B-687中壓液相色譜儀(瑞士Buchi公司)；旋轉蒸發儀(亞榮生化儀器有限公司)；BP221S電子天平(德國Sartorius公司)；離體組織器官恒溫灌流系統 (澳大利亞PL3508B6/C-V Panlab 8 Chamber Organ Bath System)；可調式移液器 (美國Thermo Fisher Scinentific公司)；Zorbax SB-C18色譜柱 (250 mm× 9.4 mm, 5 μm，美國Agilent公司)；薄層色譜硅膠GF254(青島海洋化工廠)；柱色譜硅膠(200～300目，青島海洋化工廠)；Sephadex LH-20(瑞典Amershan Pharmacia公司)。甲醇(色譜級，美國Tedia公司)；乙醇(色譜級，美國Fisher公司)；其他所用試劑均為分析純(成都市科隆化學品有限公司)。

1.2 動物 清潔級SD大鼠，雌雄不限，體質量(200 ± 20)g，由成都中醫藥大學實驗動物研究中心提供，動物生產許可證號SCXK (川) 2013-24，檢疫后用，飼養溫度21～27 ℃，相對濕度(50±5)%, 晝夜光照及通風環境自然調節。

1.3 樣品 姜黃購于四川新荷花中藥飲片有限公司，經成都中醫藥大學藥用植物研究室李敏教授鑒定為姜黃CurcumalongaL.的干燥根莖，標本(CL-20160803)保存于成都中醫藥大學西南特色藥材創新藥物成分研究所。

2 方法

2.1 提取與分離 姜黃(50 kg)加95%乙醇浸泡過夜，加熱回流提取3次，每次8倍量溶劑，第1次3 h，第2次2 h，第3次1.5 h，合并提取液，50 ℃減壓濃縮得半固體流浸膏7 kg。將浸膏混懸于水中，依次以石油醚、乙酸乙酯反復萃取，將萃取液于50 ℃減壓濃縮，得石油醚部位2 kg、乙酸乙酯部位3 kg。乙酸乙酯部位經硅膠柱，用石油醚-乙酸乙酯(1∶0、7∶3、4∶6、0∶1)洗脫，洗脫液經薄層色譜檢測，合并組成相似組分，減壓濃縮至稠浸膏，并依次編號為A～F，浸膏B(500 g)經硅膠柱，用二氯甲烷-乙酸乙酯(100∶1～0∶1)梯度洗脫，經薄層色譜法檢視，合并相似洗脫餾分并減壓濃縮，得16個餾分，依次編號為Fr.1～Fr.16。Fr.6餾分進一步經中壓液相分離，以甲醇-水(30%～100%)梯度洗脫，得到12個餾分(Fr.6-1～Fr.6-12)，Fr.6-1經制備薄層色譜石油醚-乙酸乙酯(10∶1)分離得到Fr.6-1-1、Fr.6-1-2，Fr.6-1-1經反相半制備液相色譜(81%甲醇-19%水)純化得化合物1(2.9 mg)。

3 結構鑒定

為了進一步確定化合物1結構，進行了2D-NMR實驗。1H-1H COSY譜顯示，H-5與H2-6相關，H2-2與H2-3相關,見圖1。在HMBC譜中，H3-11和C-3、C-4、C-5相關，H2-2和C-1、C-3、C-4、C-6相關，確證C-1至C-6形成4位甲基取代的六元環；1H-1H COSY譜顯示，H3-10/H-7/H2-8相關，見圖1。在HMBC譜中，H3-10和C-1、C-7、C-8相關，H2-8和C-1、C-7、C-9、C-10相關，結合不飽和度判斷，確證C-1、7、8、9位形成7位甲基取代的五元內酯環。比對文獻[9]發現，化合物1與文獻中的4,8-dimethyl-1-oxaspiro[4.5]dec-7-en-2-one平面結構相同，但文獻中為合成的異構體混合物，而且未對其絕對構型進行確定。

進一步通過NOSEY譜確定其相對構型，發現信號H2-2和H3-10相關，表明兩者位于同側，而與H2-6位于異側。進而通過計算ECD對化合物1進行絕對構型確證，使用IEFPCM模型在甲醇中針對(1R,7S)-1和(1S,7R)-1在CAM-B3LYP/DGDZVP水平計算得到的ECD譜見圖2，可知(1R,7S)-1的ECD譜與實驗ECD譜非常吻合。因此，將1的絕對構型確定為1R,7S，命名為(1R,7S)-4,7-二甲基-12-氧雜螺[4.5]癸烷-4-烯-9-酮，具體數據見表1。

表1 化合物1的1H-NMR(600 MHz, 丙酮-d6)和13C-NMR數據(150 MHz, 丙酮-d6)

圖1 化合物1的主要HMBC和1H-1H COSY相關Fig.1 Key HMBC and1H-1H COSY correlations of compound 1

圖2 化合物1的實驗和計算ECD譜Fig.2 Experimental and calculated ECD spectra of compound 1

4 舒張血管活性評價

4.1 溶液制備

4.1.1 K-H液(Kreb’-Henseleit solution) 取NaCl 13.87 g、KCl 0.7 g、KH2PO40.32 g、MgSO40.28 g、NaHCO34.2 g、Glucose 3.64 g、EDTA 0.018 g、CaCl20.56 g，加超純水至2 000 mL，即得(pH=7.4)，現配現用。

4.1.2 樣品溶液 精密稱取化合物1適量，加二甲基亞砜配制成50 μmol/mL，即得。

4.2 大鼠胸主動脈血管環制備 取出大鼠胸主動脈，剪成3～5 mm的血管環，采用離體組織灌流模型和PowerLab數據分析系統采集記錄離體血管環張力的變化。浴槽內含有K-H液，溫度恒定在37 ℃，持續通95%O2+5% CO2混合氣體，待血管環平衡60 min后，用KCl (60 mmol/L) 連續刺激血管環至少2～3次。每次刺激后，K-H液連續沖洗3次，每次5 min，恢復到基礎狀態后穩定30 min。當連續相同刺激所引起的血管收縮幅度小于10%時，往浴槽內加入KCl (60 mmol/L) 預收縮胸主動脈環，血管收縮張力達到坪值時，累積加入5個濃度 (0.25、0.75、2.5、7.5、25 μmol/mL) 的化合物1，觀察濃度與舒張效應曲線，比較不同濃度化合物對KCl (60 mmol/L) 預收縮血管環的舒張作用。

4.3 結果 從現代醫學角度而言，大多數心血管疾病患者都存在微循環障礙、血流動力學異常等現象，臨床治療以擴張血管，加強血液循環與促進血液流通為主。現代藥理研究表明，姜黃具有改善血液流變學、抗凝血、舒張血管等作用[10-11]；課題組前期發現，姜黃中倍半萜具有舒張血管作用。因此，本實驗研究化合物1對KCl預收縮的胸主動脈環舒張作用，發現它并無顯著活性。

5 討論

本實驗采用多種分離手段從姜黃中獲得一個新的降碳沒藥烷型倍半萜，并通過計算ECD確定其絕對構型，此化合物在姜黃中首次被報道。姜黃中含有較多沒藥烷型倍半萜，但是在支鏈上降碳的沒藥烷型倍半萜較為少見，除了課題組前期報道的一對降碳沒藥烷型倍半萜對映異構體外，未有其他報道。除此之外，在其他植物中分離得到的降碳沒藥烷型倍半萜也很少見[12-13]。另外，化合物1在降碳后C-9與C-1形成一個五元不飽和內酯環，是一種比較特殊的環合方式。在姜黃中發現較多的環合方式通常在C-8或者C-9與C-2之間通過醚鍵連接[7,14]。盡管課題組前期發現姜黃中沒藥烷型倍半萜以及新穎骨架倍半萜均有較好的舒張血管活性，但是本實驗研究結果表明此化合物對KCl預收縮的胸主動脈環無舒張作用。因此猜測沒藥烷型倍半萜在經過降碳后，其舒張血管活性也會受影響。

姜黃作為一種藥食同源的植物，被廣泛關注。但目前對姜黃的研究無論在化學成分還是在藥理活性方面都集中在姜黃素類成分，對其另外一大類成分—倍半萜類成分研究較少。本研究成果豐富了對姜黃倍半萜類成分的認識，補充了姜黃的化學成分庫，可為今后其倍半萜成分的研究提供參考。