野菊花提取物對慢性支氣管炎大鼠肺組織病理的影響及對TGF-β1/Smad3通路的調控機制

李向峰， 陳文霞

(1.河南中醫藥大學，河南 鄭州 450046；2.河南中醫藥大學第一附屬醫院，河南 鄭州 450000)

慢性支氣管炎是呼吸系統常見的慢性非特異性炎癥反應疾病，多發生在氣管、支氣管黏膜及周圍組織，常見癥狀有咳嗽、咳痰、喘息等，每年持續發病至少3個月，病程至少2年，可嚴重影響患者的生活[1]。據統計[2]，我國慢性支氣管炎的發病率高達15%，且隨著人們社會生活壓力的增大和人口老齡化趨勢的不斷加重而逐年增長，危害甚重。目前臨床上常采用抗炎、止咳、化痰等手段治療慢性支氣管炎，但易反復發作。野菊花具有抗菌消炎、清熱去火、消腫止痛、清肝明目等功效，既往研究表明野菊花提取物——綠原酸對肺炎克雷伯菌生物膜有體外抑制作用[3]，推測可治療支氣管炎。轉化生長因子-β1(TGF-β1)/信號傳導蛋白Smad3通路在多種炎癥反應相關疾病的發生和發展中均積極參與，TGF-β1、Smad3 信使核糖核酸(mRNA)及蛋白激活可介導促炎癥因子的合成與分泌，增加炎癥反應性組織損傷[4-6]。但是野菊花提取物是否能夠通過調控上述信號通路發揮保護慢性支氣管炎大鼠肺組織的作用仍需深入探討。鑒于此，本研究特選取60只SD成年雄性大鼠設計動物實驗，旨在探討上述問題，挖掘野菊花提取物在慢性支氣管炎治療中的臨床價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 60只SD成年健康雄性大鼠，無特定病原體(SPF)級，7～9周齡，體質量(210±20)g，均購自南方醫科大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號SCXK(粵)2018-0007。

1.1.2 試劑及儀器 大前門牌香煙(上海煙卷公司，批號20190115)。野菊花提取物(江西桂豐科技有限公司，綠原酸純度≥98%，批號180321)；N-乙酰半胱氨酸(北京華邁科生物技術有限責任公司，批號180214A)；生理鹽水(上海生工生物工程技術有限公司，批號180622)；TGF-β1、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)水平酶聯免疫法(ELISA)檢測試劑盒(華美生物工程公司，批號180501C、180413A、180322B)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(北京諾博萊德科技有限公司，批號181020A)；甲醛(北京華騰天海環保科技有限公司，批號180706)；Trizol試劑盒(美國Invitrogen公司，批號AH1801053)；TGF-β1、Smad3、β-actin引物序列，由上海鉑尚生物工程有限公司合成；二甲喹啉酸(BCA)試劑盒(凱基生物科技發展有限公司，批號1810170)；細胞裂解液(上海生物工程技術公司，批號1804051)；兔抗鼠TGF-β1、Smad3 單克隆抗體(一抗，1∶1 000)、山羊抗兔TGF-β1、Smad3 多克隆抗體(二抗，以辣根過氧化物酶標記，1∶5 000)(美國Santa Cruz 公司，批號201806A、201805B、201810C、201811A)；12%十二烷基硫磺胺-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)[購自梯希愛(上海)化成工業發展有限公司，批號1807085]。

Allegra X-15R型臺式離心機(美國Beckman Coulter公司)；DSX100型光學顯微鏡(日本Olympus公司)；9700型聚合酶鏈反應(PCR)擴增儀(美國ABI公司)；CFX96型轉膜儀(美國Bio-Rad公司)；GP200型電泳儀(托摩根生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組、建模及給藥 60只大鼠隨機分為正常組、模型組、陽性組及野菊花提取物低、中、高濃度組，每組10只。除正常組外，其余5組均采用改良煙熏法建立慢性支氣管炎模型，具體參照文獻[7]報道的方法制作煙熏箱罩(550 mm×330 mm×390 mm)，頂部對角留2個通氣孔(20 mm×30 mm)，將煙熏箱罩放置于鋼絲籠中，在鋼絲籠正下方放置香煙，點燃后將大鼠放置于煙熏箱罩中，香煙燃盡后迅速點燃另1支，每次共點燃8支，煙熏3次，持續70 d。參照《慢性支氣管炎小鼠模型構建方法的改良與評價》[8]，驗證模型是否成功。取低、中、高濃度組中建模成功的大鼠，分別予以0.7、1.4、2.8 g/kg野菊花提取物(給藥前采用TLC法鑒定[9])灌胃，每天1次，取正常組和建模成功的模型組大鼠，予以等量生理鹽水灌胃，每天1次；取建模成功的陽性組大鼠，予以50 mg/kgN-乙酰半胱氨酸灌胃，每天1次。各組均干預3周。

1.2.2 ELISA檢測大鼠血清TGF-β1、TNF-α、IL-6水平 于干預前后取大鼠股動脈血，制備抗凝血，3 500 r/min離心10 min，取上清液，嚴格按照ELISA檢測試劑盒的說明書操作。將大鼠處死后，立即取右側新鮮肺組織，保存備用。

1.2.3 HE染色觀察大鼠肺組織病理變化 取大鼠右側新鮮肺組織1 cm×1 cm×1 cm，固定于4%甲醛中，石蠟包埋后切片，HE染色，中性樹膠封片，光鏡下觀察肺組織病理變化。

1.2.4 四級評分法評價大鼠病理變化 包括支氣管黏膜病變、支氣管壁病變、基底部炎性細胞浸潤、血管瘀血狀況、肺泡間隔病變，分別以0、1、2、3分表示無、輕度、中度、重度，評分越高，肺組織病理變化程度越嚴重。

1.2.5 逆轉錄實時PCR(RT-qPCR)檢測大鼠肺組織TGF-β1、Smad3 mRNA表達 將大鼠肺組織勻漿，采用Trizol試劑盒提取總RNA后逆轉錄。參照基因庫信息設計TGF-β1、Smad3、β-actin引物序列，其中TGF-β1正向5′-CTCGCTCGATAGCT AGATCTAGATATATAGCTAG-3′，反向5′-TCGCTCG AATAGATCAAAGCTAGCTTGTGTCG-3′，長度241 bp；Smad3正向5′-TCGCTAGATTGCGCGCG AGAGAGAGAGCTAA-3′，反向5′-TCGATAGATC AGTTTGTCGACCGATGATCGA-3′，長度213 bp；β-actin正向5′-TCGCTAGATAGACAAGAGGGCTA GCTATGA-3′，反向5′-TCCGCTAGCTAGTATAGC TAGATAATAATCT-3′，長度200 bp。常規配置反應體系，總量25 μL，PCR反應條件為94 ℃ 30 s，35個循環，54 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，60 ℃ 90 s，最后72 ℃ 5 min，室溫條件下將擴增產物自然冷卻，電泳，測得目的基因相對表達量，即2-△△CT。

1.2.6 蛋白質免疫印跡(Western blot)法檢測TGF-β1、Smad3蛋白表達 常規取大鼠肺組織勻漿，細胞裂解后以BCA試劑盒定量總蛋白，常規加入上樣緩沖液，以12% SDS-PAGE進行電泳，取轉膜儀轉膜，以脫脂奶粉室溫封閉，2 h后向其中加入一抗，室溫孵育，次日洗膜，加入二抗，室溫下孵育，2 h后顯影成像，采用Plus軟件掃描，測得目的蛋白的相對表達量，即目標蛋白灰度值/β-actin灰度值。

2 結果

2.1 各組大鼠血清TGF-β1、TNF-α、IL-6水平 模型組，陽性組和低、中、高濃度組分別有2、1、1、1、0只大鼠未建模成功，成功率為90.00%(45/50)；模型組和低濃度組各有1只大鼠死亡，均剔除本研究。干預后，正常組大鼠血清TGF-β1、TNF-α、IL-6水平均無明顯變化(P>0.05)，模型組上述指標均升高(P<0.01)，其余4組均降低(P<0.05)。干預前，模型組血清TGF-β1、TNF-α、IL-6水平均高于正常組(P<0.01)；干預后，陽性組和野菊花提取物組水平均低于模型組(P<0.01)，而且后一組呈劑量依賴性，見表1。

表1 各組大鼠血清TGF-β1、TNF-α、IL-6水平比較

2.2 大鼠肺組織病理變化 正常組大鼠支氣管黏膜細胞排列緊密，結構均勻，細胞飽滿，支氣管壁結構正常，未見炎性細胞浸潤，肺泡間隔基本正常(圖1A)；模型組大鼠支氣管黏膜有大量細胞變性、壞死、脫落，支氣管壁出現嚴重的炎性充血、水腫表現，有大量炎性細胞浸潤，肺泡間隔嚴重不均(圖1B)；陽性組支氣管黏膜有部分細胞變性、壞死、脫落，支氣管壁有明顯的炎性充血、水腫表現，有部分炎性細胞浸潤，部分肺泡間隔增寬(圖1C)；低濃度組支氣管黏膜有明顯細胞變性、壞死、脫落表現，支氣管壁有顯著炎性充血、水腫癥狀，有大部分炎性細胞浸潤，大量肺泡間隔增寬(圖1D)；中濃度組支氣管黏膜有少部分細胞變性、壞死、脫落表現，支氣管壁有炎性充血、水腫癥狀，有部分炎性細胞浸潤，少部分肺泡間隔增寬(圖1E)；高濃度組支氣管黏膜有輕微細胞變性、壞死、脫落表現，支氣管壁輕微炎性充血、水腫，極少部分炎性細胞浸潤，極少部分肺泡間隔輕微增寬(圖1F)。

注：A～F分別為正常組、模型組、陽性組、低濃度組、中濃度組、高濃度組。圖1 大鼠肺組織病理變化觀察(HE染色，×200)Fig.1 Pathological changes of rat lung tissues (HE staining, ×200)

2.3 大鼠肺組織病理評分比較 各組大鼠支氣管黏膜病變、支氣管壁病變、基底部炎性細胞浸潤、血管瘀血狀況、肺泡間隔病變評分比較，差異均有統計學意義(P<0.01)，由高到低依次為模型組、低濃度組、陽性組、中濃度組、高濃度組、正常組，組間兩兩比較，差異也均有統計學意義(P<0.01)，見表2。

表2 各組大鼠肺組織病理評分比較(分，

2.4 大鼠肺組織TGF-β1、Smad3 mRNA表達 各組大鼠肺組織TGF-β1、Smad3 mRNA表達比較，差異均有統計學意義(P<0.01)，由高到低依次為模型組、低濃度組、陽性組、中濃度組、高濃度組、正常組，組間兩兩比較，差異也均有統計學意義(P<0.01)，見表3。

表3 各組大鼠肺組織TGF-β1、Smad3 mRNA表達比較

2.5 大鼠肺組織TGF-β1、Smad3蛋白表達 各組大鼠肺組織TGF-β1、Smad3 蛋白表達比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，由高到低依次為模型組、低濃度組、陽性組、中濃度組、高濃度組、正常組，組間兩兩比較，差異也均有統計學意義(P<0.01)，見表4、圖2。

表4 各組大鼠肺組織TGF-β1、Smad3蛋白表達比較

圖2 各組大鼠肺組織TGF-β1、Smad3蛋白表達Fig.2 TGF-β1, Smad3 protein expressions in rat lung tissues in various groups

3 討論

有報道指出[10]，慢性支氣管炎患者血清TGF-β1、TNF-α、IL-6水平異常升高，且與疾病嚴重程度緊密相關。TGF-β1屬于細胞生長和分化調節因子，可參與氣道慢性炎癥和氣道重塑，引起氣管壁炎性細胞浸潤，促進疾病的進展。TNF-α和IL-6均是此類患者臨床常用的炎癥反應程度評估指標，在炎癥反應性疾病中呈增高趨勢，導致局部組織炎癥性損傷[11]。因此在慢性支氣管炎患者治療期間需積極控制其炎癥反應，但如何更有效地減輕肺組織炎性損傷仍需進一步研究。

本研究顯示，干預后陽性組和野菊花提取物組血清TGF-β1、TNF-α、IL-6水平下降，而模型組上述指標均升高，且低濃度組均高于陽性組，陽性組均高于中濃度組和高濃度組，中濃度組均高于高濃度組，可知隨著慢性支氣管炎病情的發展，血清TGF-β1、TNF-α、IL-6水平可升高，而給予N-乙酰半胱氨酸和野菊花提取物治療均可控制慢性支氣管炎的血清TGF-β1、TNF-α、IL-6水平，且高濃度野菊花提取物的作用更佳。此外，各組肺組織病理變化觀察結果顯示，正常組大鼠支氣管黏膜、支氣管壁結構、肺泡間隔表現均正常，模型組均可見嚴重的細胞變性、壞死、脫落表現，且有大量炎性細胞浸潤，肺泡間隔嚴重不均，陽性組和野菊花提取物組均好轉，各項評分比較結果與病理學檢查結果均一致，證實研究藥物可減輕慢性支氣管炎大鼠的肺組織病理損傷，發揮對支氣管黏膜、氣管壁等局部結構組織的保護作用。野菊花性涼，辛，味苦，有清熱解毒的功效。慢性支氣管炎的主要中醫病因為外邪入侵、內火上亢，故清熱解毒乃對癥治療[12]。相關研究證實[13-14]，野菊花中的有效成分綠原酸不僅具有抗炎、抗氧化應激反應的作用，還可減輕肺損傷，保護肺組織功能，與本研究結果相符。因此野菊花提取物在慢性支氣管炎患者的臨床治療方面顯示出良好的開發價值。

此外，本研究還顯示，干預后陽性組和野菊花提取物組肺組織TGF-β1、Smad3 mRNA及蛋白表達均低于模型組，均高于正常組，而模型組肺組織TGF-β1、Smad3 mRNA及蛋白表達均高于正常組，提示慢性支氣管炎大鼠肺組織TGF-β1、Smad3 mRNA及蛋白表達可異常升高，而給予N-乙酰半胱氨酸和野菊花提取物可下調其表達，且野菊花提取物的濃度越高，對肺組織TGF-β1、Smad3 mRNA及蛋白表達的抑制作用越強烈。TGF-β1可通過細胞內外信號轉導通路加重慢性支氣管炎肺組織炎性細胞浸潤和局部組織損傷，還可推動肺纖維化的形成和發展，促進促炎癥因子分泌，誘導細胞合成大量的細胞外基質，并抑制其降解[15-16]。Smad3是TGF-β信號通路的拮抗劑，可調控細胞外基質的積聚，還可調節促炎癥因子分泌，與TGF-β1形成信號通路[17]。有研究顯示[18]，在慢性支氣管炎大鼠模型中，TGF-β1、Smad3基因及蛋白均高表達，可促進TNF-α、IL-6水平增長，而兩者均可加重肺組織炎性細胞浸潤和炎癥反應損傷，且TNF-α、IL-6水平較高，給予小承氣湯干預能通過調控該信號通路，減輕病理損傷。因而推測野菊花提取物也可調控上述通路治療慢性支氣管炎。

綜上所述，在慢性支氣管炎大鼠中給予野菊花提取物灌胃可減輕炎癥反應，控制肺組織病理改變，且中濃度和高濃度的野菊花提取物作用效果優于N-乙酰半胱氨酸對照物，顯示出良好的開發前景，推測該藥物是通過調控TGF-β1/Smad3 信號通路，抑制TGF-β1、Smad3 mRNA及蛋白表達實現肺組織保護作用的。但關于該藥物是否對慢性支氣管炎有其它治療機制仍需進一步研究，可作為后續的探討方向。