二陳湯通過增強自噬改善痰濕型PCOS大鼠子宮葡萄糖轉(zhuǎn)運功能的研究?

叢培瑋， 張麗娜， 趙丹玉， 尚 冰， 吳兆利

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實驗中心， 沈陽 110847； 2. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，沈陽 110847； 3. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)史文獻(xiàn)研究院，沈陽 110847； 4. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，沈陽 110847)

排卵障礙一直被認(rèn)為是多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)患者不孕的原因。隨著促排卵藥物的應(yīng)用，PCOS患者排卵率可達(dá)80%，但因子宮病變導(dǎo)致的最終妊娠率只有40%～50%[1]。胰島素抵抗(insulin resistance，IR)目前被認(rèn)為是PCOS子宮病變重要的病理生理基礎(chǔ)。近年來研究顯示，PCOS子宮病變的發(fā)生率占PCOS患者的35%～49%[2，3]，其中痰濕型PCOS是目前臨床最為多發(fā)的中醫(yī)證型，該證型與IR關(guān)系密切[4]。降低患者子宮IR水平，改善子宮內(nèi)環(huán)境，對提高臨床妊娠率具有重要意義。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，基于“痰濕不孕”理論指導(dǎo)下的二陳湯對改善PCOS大鼠IR水平效果顯著。本部分研究在前期研究基礎(chǔ)上，觀察痰濕型PCOS大鼠體質(zhì)量增長率，動情周期、子宮組織病理形態(tài)、自噬相關(guān)基因7(autophagy related gene，Atg7)、磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)/葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4(glucose transporter protein 4，Glut4)信號通路變化，進一步探討二陳湯改善痰濕型PCOS子宮IR水平的可能機制。本研究已通過遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理委員會審核，批準(zhǔn)號2019YS(DW)-035-01。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級健康雌性Sprague-Dawley大鼠45只，4～5周齡，體質(zhì)量85～105 g，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，許可證號SCXK(遼)-2010-0001。飼養(yǎng)于SPF級獨立通風(fēng)籠，溫度(20±2) ℃，濕度(50±5)%，每日定時添加飼料，換水及灌胃給藥。

1.2 藥物制備

二陳湯組成：半夏12 g，陳皮9 g，茯苓15 g，甘草6 g(按臨床治療PCOS常用劑量)，購于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。藥物經(jīng)高壓濃縮煎藥機煎煮后過濾濃縮，根據(jù)大鼠體表面積換算人體等效劑量2倍的方法換算后[4]，混合濃縮為含量有生藥為0.88 g/mL的水煎劑。二甲雙胍購自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院(規(guī)格0.5 g/片)，蒸餾水配制藥物濃度為0.3 g/mL的水溶液。

1.3 試劑與儀器

Atg7(批號ab52472，Abcam)、PI3K(批號278545，Abcam)、Akt(批號ab8805，Abcam)、Glut4(批號ab216661，Abcam)、gapdh(批號ab9485，Abcam)、促卵泡激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)Elisa試劑盒(批號SBI-R0930)，森貝伽生物科技有限公司；黃體生成素(luteinizing hormone，LH)Elisa試劑盒(批號SBJ-H2047)，森貝伽生物科技有限公司；睪酮(testosterone，T)Elisa試劑盒(批號SBJ-R0994)，森貝伽生物科技有限公司；雌二醇(estradiol，E2)Elisa試劑盒(批號SBJ-R0698)，森貝伽生物科技有限公司；空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)Elisa試劑盒(批號WLB-0690R1)，北京威萊博生物技術(shù)有限公司。

酶標(biāo)儀(Bio-Rad，042BR14173)，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司，Tanon5200)，生物顯微鏡(Leica，DM750)，電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad，Trans-Blot Turbo Transfer Systerm)，血糖儀(拜耳，contour TS)。

1.4 動物分組、造模及給藥

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，選取動情周期規(guī)律SD大鼠42只，隨機分為對照組10只，模型組32只，模型組給予高脂飼料連續(xù)喂養(yǎng)12周，第3周開始每日灌胃來曲唑溶液，連續(xù)9周；對照組給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)12周，第3周開始每日灌胃0.5% CMC-Na溶液，連續(xù)9周。造模結(jié)束后，周期延長的模型組大鼠隨機抽取20只，分為中藥組(10只，含生藥量為0.88 g/mL)和二甲雙胍組(10只，含生藥量為0.3 g/mL)，按1 mL/100 g劑量灌胃給藥，連續(xù)4周。高脂飼料成分包括酪蛋白800kcaL，L-胱氨酸12kcaL，玉米淀粉291kcaL，麥芽糊精400kcaL，蔗糖691kcaL，豆油225kcaL，豬油1598kcaL，復(fù)合維生素40kcaL，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心配送。

2 標(biāo)本與檢測

2.1 動情周期檢測

通過觀察陰道脫落細(xì)胞涂片鑒定各組大鼠的發(fā)情周期。采用50 μL移液器吸取生理鹽水，在大鼠陰道內(nèi)來回抽吸3～5次。將吸出的生理鹽水滴到干凈的載玻片上，蘇木素染色后置于光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄，每天固定同一時間進行操作。

2.2 子宮病理組織HE染色

造模結(jié)束各組大鼠24 h禁食水后，于冰上取子宮組織，4%多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋，4 μm厚切片，常規(guī)脫蠟水化后，蘇木素染色15 min，1%鹽酸酒精分化，伊紅染色、脫水、透明后中性樹膠封片，鏡下觀察。

2.3 血清激素水平和HOMA-IR指數(shù)測定

造模結(jié)束各組大鼠24 h禁食水后，2%戊巴比妥鈉(0.2 mL/100 g)腹腔注射麻醉后，腹主動脈采血5～8 mL，3500 r/min 離心10 min取上清。Elisa法檢測FSH、LH、T、E2、FINS水平。尾尖靜脈取血，拜耳血糖儀測定空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)水平，計算HOMA-IR = FPG(mmol/L)× FINS(mIU/ L)/22.5。

2.4 Western Blot法檢測子宮組織Atg7、PI3K、Akt、Glut4含量的表達(dá)

蛋白裂解液提取總蛋白，Bradford試劑盒蛋白定量。每孔上樣量為50 μg，SDS-PAGE電泳，半干轉(zhuǎn)膜，TBST封閉1 h，加入兔抗大鼠Atg7(1∶1000)、PI3K(1∶1000)、Akt(1∶1000)、Glut4(1∶1000)一抗，4 ℃封閉過夜，TBST洗膜3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶2000)，1 h后TBST洗膜3次，加入增強型ECL發(fā)光液反應(yīng)5 min，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光，拍照，ImageJ軟件數(shù)據(jù)分析每條泳道的光密度值。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 動情周期觀察

圖1示，光鏡下觀察各組大鼠涂片，對照組可見動情周期規(guī)率，每只平均4～5 d；模型組表現(xiàn)為動情間期延長，周期不規(guī)律。經(jīng)中藥組和二甲雙胍組治療后的涂片示，動情周期逐漸改善。各時期細(xì)胞特征為，動情前期主要分布有核上皮細(xì)胞，動情期分布大量角化細(xì)胞，動情后期可見有核上皮細(xì)胞、無核角化細(xì)胞及白細(xì)胞，動情間期則分布大量的白細(xì)胞。

注：紅色箭頭標(biāo)示有核上皮細(xì)胞，黃色箭頭標(biāo)示無核角化細(xì)胞，綠色箭頭標(biāo)示白細(xì)胞

3.2 各組大鼠子宮組織病理形態(tài)學(xué)觀察

圖2示，對照組大鼠子宮形態(tài)基本正常，內(nèi)膜腺體數(shù)目較多，腺腔大而多褶。模型組大鼠子宮內(nèi)膜腺體數(shù)目明顯減少，腺體多為單個分散排列，腺腔小而直。中藥組和二甲雙胍組子宮內(nèi)膜腺體數(shù)目增多，腺腔形態(tài)有所恢復(fù)，部分可見到皺褶和分支。

注：A(對照組)；B(模型組)；C(中藥組)；D(二甲雙胍組)

3.3 二陳湯對血清激素水平和HOMA-IR指數(shù)的影響

圖3示，與對照組比較，模型組大鼠血清LH、FSH、T水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，E2水平有所減低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，中藥組和二甲雙胍組血清中LH、FSH、T水平明顯降低(P<0.05)，E2水平有所升高(P>0.05)。與對照組比較，模型組HOMA-IR升高顯著(P<0.05)，與模型組比較，中藥組和二甲雙胍組HOMA-IR降低顯著(P<0.05)。

注：與對照組比較：aP<0.05；與模型組比較：bP<0.05；control(對照組)；model(模型組)；CTM(中藥組)；metformin(二甲雙胍組)

3.4 二陳湯對子宮組織Atg7、PI3K、Akt及Glut4蛋白的影響

圖4示，與對照組比較，模型組大鼠子宮Atg7、PI3K、Akt、Glut4蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，中藥組和二甲雙胍組大鼠子宮Atg7、PI3K、Akt、Glut4蛋白表達(dá)水平有不同程度的改善(P<0.05)。

注：與對照組比較：aP<0.05；與模型組比較：bP<0.05；control(對照組)；model(模型組)；CTM(中藥組)；metformin(二甲雙胍組)

4 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為痰是病理性的產(chǎn)物。元·朱丹溪最早提出痰濕不孕[5]：“肥盛婦人，稟質(zhì)甚厚，恣于酒食之人，經(jīng)水不調(diào)，不能成胎，謂之軀脂滿溢，閉塞子宮，宜行濕燥痰。”脾虛津液失布，聚而生痰，痰阻胞宮可致女子不孕。因此，脾虛痰濕、壅塞胞宮是PCOS子宮病變的關(guān)鍵病機。中醫(yī)臨床發(fā)現(xiàn)，PCOS患者多為痰濕型體質(zhì)[6]。張錦聰[7]等通過調(diào)查發(fā)現(xiàn)，182名PCOS患者的中醫(yī)證候要素中痰濕型位居病性類證候要素的首位。

現(xiàn)代中醫(yī)認(rèn)為，長期脾虛痰濕可誘發(fā)糖脂分解產(chǎn)能方式的轉(zhuǎn)變，是機體IR發(fā)生的重要原因[6]。長期以來，IR被認(rèn)為是PCOS重要的病理生理基礎(chǔ)。隨著研究深入，學(xué)者們普遍認(rèn)為PCOS患者存在子宮局部IR現(xiàn)象，同時全身IR也會影響子宮功能，PCOS-IR患者子宮內(nèi)膜病變所致流產(chǎn)更是逐年攀升[7]。二陳湯出自《太平惠民和劑局方》，具有健脾益氣、燥濕化痰的功效。半夏為君，陳皮為臣，達(dá)燥濕化痰；佐以茯苓健脾利濕，使以甘草調(diào)和諸藥。課題組前期運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對二陳湯分析發(fā)現(xiàn)，二陳湯主要成分代謝物涉及的相關(guān)信號通路與糖脂代謝關(guān)系密切[8]。本研究在“痰濕不孕”理論指導(dǎo)下，探討二陳湯對痰濕型PCOS大鼠的保護作用。前期研究發(fā)現(xiàn)，該方藥主要成分能有效改善PCOS大鼠血脂水平和顆粒細(xì)胞IR水平[9]。在此基礎(chǔ)上，本實驗進一步探討二陳湯防治PCOS子宮IR的可能作用機制。

本次研究發(fā)現(xiàn)，藥物治療后子宮內(nèi)膜腺體數(shù)目、腺腔形態(tài)均有所恢復(fù)，部分可見到皺褶和分支。藥物治療后血清中LH、FSH、T水平明顯降低，E2水平有所升高，HOMA-IR降低顯著，提示二陳湯在改善PCOS子宮功能及IR水平有一定作用。

PI3K/Akt通路與PCOS中生殖內(nèi)分泌水平密切相關(guān)[10，11]。各種細(xì)胞因子和信號傳導(dǎo)復(fù)合物(如胰島素)可激活下游PI3K，介導(dǎo)Akt活化，促進Glut4從胞漿向胞膜轉(zhuǎn)位。胚胎種植過程中，子宮需要攝取大量葡萄糖以維持子宮所需的能量。當(dāng)子宮組織葡萄糖攝取能力受損，會引發(fā)一系列如子宮內(nèi)膜細(xì)胞與胚胎黏附能力降低[12，13]、內(nèi)膜容受性降低和內(nèi)膜癌變等病理改變[14，15]。本研究中子宮組織PI3K、Akt、Glut4蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組大鼠子宮PI3K、Akt、Glut4蛋白表達(dá)顯著降低；與模型組比較，經(jīng)過中藥或二甲雙胍治療后的大鼠子宮PI3K、Akt、Glut4蛋白表達(dá)有不同程度的改善。

另一方面，大量研究證實IR狀態(tài)下組織的自噬功能會出現(xiàn)異常。Chan等[16]在高脂飲食誘導(dǎo)的糖尿病小鼠和基因缺陷肥胖小鼠中，均發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞內(nèi)多種自噬相關(guān)基因的表達(dá)降低，自噬功能嚴(yán)重受損。自噬過程涉及到30多種自噬相關(guān)基因，Atg7在自噬通路中起核心作用[17，18]。特異性敲除Atg7小鼠的肝臟發(fā)現(xiàn)，Akt活性降低，IR嚴(yán)重。Atg7表達(dá)恢復(fù)，Akt活性增強，IR得到緩解[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組大鼠子宮Atg7蛋白表達(dá)顯著降低；與模型組比較，經(jīng)過中藥或二甲雙胍治療后的大鼠子宮內(nèi)Atg7蛋白表達(dá)有顯著增高。

目前認(rèn)為自噬失調(diào)會影響PCOS子宮功能，PI3K/Akt/Glut4通路在PCOS中發(fā)揮作用，但二者之間的聯(lián)系尚無報道。本研究認(rèn)為，二陳湯能夠顯著抑制PCOS的IR水平，其機制可能是通過提高子宮內(nèi)膜的自噬能力，進而增強PI3K/Akt/Glut4信號通路實現(xiàn)，但其詳細(xì)的調(diào)控機制課題組將在體外研究中進一步探究。