益腎健脾方對去卵巢骨質疏松癥大鼠Wnt/β-catenin信號通路的調節研究?

呂文學， 蔡余力

(山東中醫藥大學附屬醫院骨關節科， 濟南 250014)

絕經后骨質疏松癥是以全身骨密度降低、骨微結構破壞、易并發骨折為主要臨床特征的女性常見骨代謝疾病之一[1]。近年來研究表明[2，3]，Wnt/β-catenin信號通路與骨組織細胞生命活動周期密切相關。同時，Wnt/β-catenin信號通路及其相關蛋白的表達異常與絕經后骨質疏松癥的發病機制相關。中醫理論認為，骨質疏松是由于腎精虧虛導致骨髓生化乏源、骨骼失養所致[4]。益腎健脾方是由補骨脂等中藥組成的用于治療絕經后骨質疏松癥中藥方劑，目前已在臨床中用于骨質疏松的治療且療效明顯。然而益腎健脾方治療絕經后骨質疏松癥的作用機制尚不甚明確。本文通過研究益腎健脾方對去卵巢大鼠骨質疏松癥及腎組織Wnt/β-catenin信號通路的調節作用，旨在從分子生物學角度闡述益腎健脾方對骨質疏松癥的作用機制。本研究已通過實驗動物倫理委員會審查,批準號2020-12號。

1 材料與方法

1.1 動物

健康清潔級(SPF)雌性SD大鼠，6月齡，體質量(240±20)g，購自山東省實驗動物中心，實驗動物生產許可證號SYXK(魯) 2019 0007。動物飼養條件為溫度24 ℃，濕度45%，正常光照，自由飲食，動物飼料為SPF級實驗大鼠維持飼料，飼養于實驗動物房。

1.2 藥品與試劑

益腎健脾方組成：熟地黃20 g，淫羊霍12 g，黨參15 g，川牛膝18 g，云苓15 g，白術15 g，山藥18 g，牡蠣30 g，杜仲12 g，補骨脂12 g，骨碎補21 g，龍骨30 g，丹皮12 g，甘草6 g，由山東中醫藥大學附屬醫院藥劑科制劑中心統一制備；Wnt3a(貨號AF8352)、β-catenin(貨號AF0066)、GAPDH抗體(貨號AF1186)、RIPA蛋白裂解液(貨號P0013E)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(貨號P0012)、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(貨號A0208)，購自上海碧云天公司；ALP(貨號201808151)、OPG檢測試劑盒(貨號201810052)，購自南京建成生物工程公司；TrACP(貨號HY-10289)、BMP-7檢測試劑盒(貨號HY-10149)，購自北京華英生物技術研究所；RNA提取試劑盒(貨號Z3100)，美國Promega公司；ECL顯色液(貨號32209)，賽默飛世爾科技有限公司；改良番紅O-固綠軟骨染色液(貨號G1371)，北京索萊寶公司；PCR引物，購自上海生工生物工程股份有限公司。

1.3 儀器

MB-530酶標儀(濟南好來寶醫療器材有限公司)；STM7-BSW顯微鏡(奧林巴斯銷售服務有限公司)；DYCZ-25 D雙垂直電泳儀及DYCZ-40 G轉印電泳儀(北京六一儀器有限公司)；Gel Doc XR凝膠成像儀(伯樂生命醫學產品有限公司)；FC5718230V離心機(奧豪斯國際貿易有限公司)。

1.4 去卵巢骨質疏松癥大鼠模型的建立及給藥

除15只大鼠作為對照組外，其余45只大鼠參照文獻方法[5]建立骨質疏松大鼠模型。根據大鼠體質量，按照40 mg/kg腹腔注射給予戊巴比妥鈉溶液麻醉，取俯臥位固定于手術臺上，剃毛器在背部兩側剃毛備皮，碘伏消毒，由脊柱旁1～2 cm、肋下1 cm處打開腹腔，找到埋于白色脂肪中的卵巢拉出并結扎，行卵巢切除術后還回腹腔并縫合肌肉和皮膚，同法摘除另一側卵巢。對照組大鼠不去除卵巢，僅去除卵巢周圍少量脂肪組織。術后3個月測定大鼠骨密度，以造模組大鼠股骨骨密度顯著低于對照組視為造模成功。造模完成后的大鼠按照隨機數字表法隨機分為模型組、益腎健脾方組、阿侖膦酸鈉組各15只。益腎健脾方組大鼠根據體質量按照0.875 ml/100 g灌胃給予益腎健脾方(按照成人臨床使用劑量的6.3倍折算)，阿侖膦酸鈉組灌胃給予1 mg/kg的阿侖膦酸鈉，對照組和模型組給予生理鹽水，每日1次，連續12周。

1.5 指標檢測

1.5.1 大鼠血清TrACP、ALP、BMP-7、OPG水平檢測 大鼠眼眶后靜脈叢取血后靜置，離心取上清液，并按照檢測試劑盒說明書檢測大鼠血清TrACP、ALP、BMP-7、OPG水平。

1.5.2 大鼠股骨骨密度測定 參照文獻方法[6]使用DPX-ALPHA LUNARTM1，通過雙能X射線吸收測定法(DEXA)，在Hi-res、small animal模式下檢測大鼠左側股骨骨密度。

1.5.3 大鼠股骨生物力學測定 參照文獻方法[7]，大鼠處死后取右側股骨進行三點彎曲試驗，加載速度為2 mm/min，測定最大載荷和彈性載荷。

1.5.4 各組大鼠股骨組織病理學檢查 大鼠處死后，分離左側股骨并放入4%中性甲醛中固定48 h，脫鈣液脫鈣處理，每周更換1次脫鈣液，共脫鈣5周并進行常規石蠟包埋，于正中矢狀面進行4 μm連續切片。然后分別進行常規蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色及番紅-固綠染色法染色，在顯微鏡下進行組織病理學觀察。

1.5.5 大鼠腎組織Wnt3a、β-catenin mRNA水平測定 大鼠斷頭處死后迅速分離腎組織，使用試劑盒提取腎組織總RNA并逆轉錄成cDNA，實時定量PCR法檢測腎組織Wnt3a、β-catenin及GAPDH mRNA水平。表1示，以GAPDH為內參，采用2-△△Ct法計算各檢測基因的相對表達量。

表1 各基因引物序列

1.5.6 Western blot檢測大鼠腎組織中Wnt3a、β-catenin蛋白水平 取大鼠部分腎組織，玻璃勻漿器中加入RIPA蛋白裂解液勻漿，離心4 ℃，12000 r/min,10 min后取上清液，測定蛋白濃度，取50 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳分離、轉膜，室溫下封閉液封閉1 h，經Wnt3a、β-catenin及GAPDH抗體(均以1∶1000比例稀釋)孵育后，4 ℃過夜，次日PBST充分洗膜后，加入1∶2000稀釋后的辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG，25 ℃恒溫孵育1 h，再次使用PBST清洗3次，顯色液顯色，利用凝膠成像系統成像后，使用軟件ImageJ 1.8.0進行灰度值檢測。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠股骨骨密度

表2示，與對照組比較，模型組股骨密度降低(P<0.05)；與模型組比較，益腎健脾方組及阿侖膦酸鈉組大鼠股骨骨密度均顯著升高(P<0.05)。

表2 各組大鼠股骨骨密度比較

2.2 各組大鼠血清TrACP、ALP、BMP-7、OPG水平

表3示，與對照組比較，模型組血清TrACP、ALP水平升高(P<0.05)，血清BMP-7、OPG水平均顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，益腎健脾方組及阿侖膦酸鈉組大鼠血清TrACP、ALP水平顯著降低(P<0.05)，血清BMP-7、OPG水平均顯著升高(P<0.05)。

表3 各組大鼠血清TrACP、ALP、BMP-7、OPG水平比較

2.3 各組大鼠股骨骨生物力學比較

表4示，與對照組比較，模型組大鼠股骨最大載荷及彈性載荷均顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，益腎健脾方組及阿侖膦酸鈉組大鼠最大載荷及彈性載荷均顯著升高(P<0.05)。

表4 各組大鼠股骨骨生物力學比較

2.4 大鼠股骨病理學檢查

圖1、2示，對照組大鼠股骨結構完整，骨小梁清晰，未見明顯病理學變化；與對照組比較，模型組大鼠股骨結構明顯損壞，骨小梁被破壞且稀疏，厚度變薄，股骨頭部位脂滴明顯增多，相互鏈接斷裂且骨髓腔變大出現不同程度破裂形狀大小不均勻；與模型組比較，益腎健脾方組及阿侖膦酸鈉組大鼠股骨病理學變化明顯改善，骨小梁增粗且排列較整齊，骨組織結構明顯恢復，脂滴明顯減少，可見明顯新骨形成。

注：A.對照組；B.模型組；C.益腎健脾方組；D.阿侖膦酸鈉組

注：A.對照組；B.模型組；C.益腎健脾方組；D.阿侖膦酸鈉組

2.5 各組大鼠腎組織Wnt3a、β-catenin mRNA水平

表5示，與對照組比較，模型組腎組織Wnt3a、β-catenin mRNA水平降低 (P<0.05)；與模型組比較，益腎健脾方組及阿侖膦酸鈉組大鼠腎組織Wnt3a、β-catenin mRNA水平均明顯升高(P<0.05)。

表5 各組大鼠腎組織Wnt3a、β-catenin mRNA水平比較

2.6 各組大鼠腎組織Wnt3a、β-catenin水平比較

圖3示，與對照組比較，模型組大鼠腎組織Wnt3a、β-catenin水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，益腎健脾方組及阿侖膦酸鈉組大鼠腎組織Wnt3a、β-catenin水平顯著升高(P<0.05)。

注：與對照組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

3 討論

骨質疏松癥是以骨量減少、骨微觀結構退化為特征的臨床常見疾病，由骨質疏松導致的骨脆性增加使得患者的骨折發生風險增加。絕經后骨質疏松癥是女性骨質疏松癥的常見病因之一。女性在絕經后，由于雌激素水平降低，導致內分泌系統紊亂而引起骨代謝平衡被打破，骨重建速度下降，同時骨脆性增加[8]。目前，對于絕經后骨質疏松癥臨床常用雌激素、降鈣素﹑二膦酸鹽﹑鈣劑及維生素等藥物治療，然而這些藥物存在臨床效果不理想、不良反應多，甚至可能增加患者罹患乳腺癌、子宮內膜癌等腫瘤疾病的風險[9]。

傳統中醫學理論認為，骨質疏松實為腎虛所致。腎為先天之本，藏精主骨生髓，可解釋為腎精充足時則骨髓能夠受到滋養而強健有力，若腎精虧虛則骨骼得不到滋養。由此可見，骨髓的生長發育、強勁衰弱與腎精盛衰密切相關。早在多部中醫學古典著作中已有大量關于骨質疏松癥的記載[10-14]，如《素問·痿論篇》[15，16]記載：“內伐則熱舍于腎，腎者水臟也，今水不勝火，則骨枯而髓虛，故足不任身，發為骨痿。”隨著年齡的增長，老年女性精血不能互相轉化，故腎虧脾虛是原發性骨質疏松的基本病理。

Wnt/β-catenin信號通路是與細胞生長發育等生理活動重要的信號通路之一。近年來研究表明[17]，Wnt/β-catenin信號通路與骨質疏松、腫瘤、神經損傷等疾病的發生密切相關。有研究證實[18]，Wnt/β-catenin信號通路異常會導致骨髓間充質干細胞分化和增殖能力降低，促進骨細胞凋亡，進而誘導骨質疏松癥的發生；姚琦等[19]研究表明，獨活可以通過激活Wnt/β-catenin信號通路，發揮對去卵巢導致的骨質疏松大鼠的治療作用；劉湘琳等[20]研究表明，調節Wnt/β-catenin信號通路及相關蛋白的表達，能夠增加去勢誘導的骨質疏松癥大鼠的股骨骨密度,提高椎體最大負荷和彈性模量等生物力學性能。

益腎健脾方是由骨碎補、補骨脂等中藥組成的中藥成方制劑，在前期絕經后骨質疏松癥患者的臨床應用中已取得顯著療效。方中補骨脂、骨碎補為君藥可補腎壯陽、健脾補胃；臣以淫羊藿、熟地、山藥、煅龍骨、川牛膝、牡蠣、杜仲補腎滋陰益精，補益肝腎；配以云苓、黨參、白術、丹皮歸脾腎經，健脾益氣，利水消腫，加強活血化瘀之力共為佐藥；甘草性平，調和諸藥，諸藥配伍共奏補腎壯骨、活血通絡之功。

本實驗通過采用雙側卵巢摘除法建立骨質疏松大鼠模型，研究益腎健脾方對去卵巢大鼠骨質疏松癥的作用及對腎組織Wnt/β-catenin信號通路的調節作用。骨密度及最大載荷、彈性載荷等骨生物力學指標是反映骨硬度及脆度的直接指標，骨密度及骨生物力學指標的下降提示骨折風險的升高；血清TrACP、ALP、BMP-7、OPG水平是反映骨代謝的指標，TrACP是骨吸收和破骨細胞活性的良好標志物，ALP是成骨細胞功能及分化的評價指標，BMP-7是骨形成最早的信號分子，由骨骼及腎臟產生，能夠促進骨髓間充質細胞分化為成骨及軟骨細胞，OPG水平升高是骨形成增加而骨吸收減少的重要標志[21，22]。本研究結果表明，與模型組比較，益腎健脾方組及阿侖膦酸鈉組大鼠股骨骨密度、最大載荷、彈性載荷、血清BMP-7、OPG水平顯著升高，血清TrACP、ALP水平顯著降低，大鼠股骨組織病理學明顯改善。同時，益腎健脾方組大鼠腎組織Wnt3a、β-catenin mRNA水平、Wnt3a、β-catenin蛋白水平較模型組顯著升高，提示益腎健脾方對去卵巢骨質疏松癥大鼠的保護作用，可能是通過調節腎組織Wnt/β-catenin信號通路，進而發揮其骨保護及修復作用。

綜上所述，益腎健脾方能夠提高去卵巢骨質疏松大鼠的骨密度，升高血清BMP-7、OPG水平，降低TrACP、ALP水平，改善大鼠股骨組織病理學變化，其機制可能與調節大鼠腎組織Wnt/β-catenin信號通路有關。