電針“曲池”“陽(yáng)陵泉”、加味芍藥甘草湯及針?biāo)幗Y(jié)合三種方法對(duì)SCA模型大鼠海馬區(qū)BDNF、TrkB影響的比較研究?

郭 斌， 馬逸杰， 楊 舟△， 岳增輝△

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，長(zhǎng)沙 410021；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，銀川 750004)

腦卒中肢體痙攣狀態(tài)是一種以肢體偏癱為表現(xiàn)的運(yùn)動(dòng)功能性障礙狀態(tài),腦卒中發(fā)生后神經(jīng)元大量死亡，從而引起突觸結(jié)構(gòu)的破壞最終發(fā)生一定的神經(jīng)功能損傷[1]，使患者的生活質(zhì)量受到較大影響[2]。腦卒中發(fā)生時(shí)大腦內(nèi)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子廣泛參與腦卒中的發(fā)生過(guò)程，其主要參與受損突觸結(jié)構(gòu)與功能的恢復(fù)，是神經(jīng)損傷、神經(jīng)細(xì)胞凋亡以及神經(jīng)功能恢復(fù)的重要影響因素[3]。

對(duì)腦卒中肢體痙攣狀態(tài)的治療中醫(yī)各家有不同的方法[4]。《百癥賦》中記載：“半身不遂，陽(yáng)陵遠(yuǎn)達(dá)于曲池。”曲池平肝潛陽(yáng)而祛內(nèi)風(fēng)，陽(yáng)陵泉舒筋活絡(luò)抑肝風(fēng)，二者配伍調(diào)達(dá)氣機(jī)，強(qiáng)筋健骨[5]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，電針“曲池”“陽(yáng)陵泉”可以調(diào)節(jié)各組神經(jīng)遞質(zhì)，從而緩解腦卒中肢體痙攣及肌張力緊張的癥狀[6，7]。《傷寒論》芍藥甘草湯以“酸甘化陰”論治，使筋脈得陰津濡潤(rùn),從而解除痙攣，改善肌張力[8]。本團(tuán)隊(duì)通過(guò)臨床觀察得出針灸與中藥配合使用，能更好地緩解腦卒中后偏癱患者肌張力,改善運(yùn)動(dòng)功能,提高日常生活活動(dòng)能力[9]。本研究擬通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察電針、中藥以及針?biāo)幗Y(jié)合3種治療方法，對(duì)CSA大鼠海馬區(qū)BDNF、TrkB的干預(yù)效應(yīng)，分析遴選最適宜該疾病的治療方法。本研究已通過(guò)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物批號(hào)20171103。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)健康成年SD雄性大鼠77只，7周齡，體質(zhì)量(240±30)g，由湖南斯萊克景達(dá)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SCXK(湘)2016-0002。飼養(yǎng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，普通飼料投喂，室溫(25±2)℃，相對(duì)濕度65%～70%，自然光照，自由進(jìn)食飲水。

1.2 藥物

加味芍藥甘草湯組成：白芍30 g，甘草10 g，黃芪30 g，桑枝30 g，伸筋草10 g，山萸肉10 g，枸杞10 g，當(dāng)歸15 g，川芎15 g，地龍10 g，雞血藤15 g，木瓜10 g，水煎劑，湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中藥房，均由王竹鑫主任鑒定，先按比例配方取藥，然后將飲片以蒸餾水浸泡1 h ,繼以武火急煎至沸騰, 再以文火煎煮2 h , 取汁后以四層紗布過(guò)濾；藥渣再加蒸餾水文火煎煮 1 h ,過(guò)濾取汁，2次藥汁合并,將藥物濃縮至含生藥10 mL·kg-1。

1.3 主要試劑與儀器

N-甲基-D-天冬氨酸受體(美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)M3262)；PVDF轉(zhuǎn)GAT-1(美國(guó)millipore公司，貨號(hào)IPVH00010)；化學(xué)發(fā)光試劑(美國(guó)millipore公司，貨號(hào)WBKLS0010)；β-Actin(Bioswamp武漢貝茵萊生物科技有限公司，貨號(hào)PAB36265)；BDNF(英國(guó)abcam公司，ab108319)；TrkB(英國(guó)abcam公司，ab18987)；GoatAnti-RabbitIgG(Bioswamp武漢貝茵萊生物科技有限公司，貨號(hào)PAB160011)；SYBRGreenPCR試劑盒(Bioswamp武漢貝茵萊生物科技有限公司，貨號(hào)KM4101)；PBS 磷酸鹽緩沖液(Bioswamp武漢貝茵萊生物科技有限公司，貨號(hào)PAB180003)。

H7650型透射電鏡(日本日立高新科技公司);SN-2型大鼠腦立體定位儀(日本成茂公司);SDZ-V型電子電針儀(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司);5ul型微量注射器(上海科曉科學(xué)儀器有限公司);CFX-Connect96型熒光定量 PCR 儀(美國(guó)Bio-Rad公司);針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司,0.30×13 mm);miniprotean3cell型電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司);MD1000型正置顯微鏡(徠卡顯微系統(tǒng)有限公司);Tanon-5200型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀(上海天能科技有限公司);Centrifuge5424R型離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司);Nano-300型超微量分光光度計(jì)(杭州奧盛儀器有限公司)。

2 方法

2.1 分組、造模及制備

將大鼠通過(guò)2次隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、假手術(shù)組、電針組、中藥組、和針?biāo)幗M6組各9只。采用改良Zea-longa線栓法+內(nèi)囊注射N(xiāo)MDA受體法制作腦卒中肢體痙攣大鼠模型[10]。麻醉成功后仰臥位備皮、消毒，頸部正中偏右做切口，鈍性分離右側(cè)頸總動(dòng)脈迷走神經(jīng)，向上暴露頸總動(dòng)脈分叉處、頸內(nèi)動(dòng)脈與頸外動(dòng)脈；各自結(jié)扎頸外動(dòng)脈近心端、頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，動(dòng)脈夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈；頸總動(dòng)脈分叉膨大5 mm處做一小切口，栓線經(jīng)切口插入頸內(nèi)動(dòng)脈，松開(kāi)動(dòng)脈夾深度約18～20 mm感到阻力停止插線；完畢后，將頸內(nèi)動(dòng)脈近心端和栓線一起結(jié)扎逐層縫合；大鼠清醒后納入Zea-Longa評(píng)分1～3分的大鼠第2天再行內(nèi)囊注射N(xiāo)MDA受體法[11]。經(jīng)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，NMDA與腦卒中肢體痙攣關(guān)系極為密切，大腦注射N(xiāo)MDA受體的實(shí)驗(yàn)可行性強(qiáng)[12]；反復(fù)摸索濃度后確定為將5 mg NMDA受體溶于5 mL滅菌生理鹽水中，制成濃度為1 mg·mL-1的溶液，37 ℃孵箱中孵育7 d，凝聚狀態(tài)備用[13，14]。繼續(xù)麻醉俯臥固定大鼠腦立體定位儀上備皮、消毒，逐層分離暴露前囟、額骨和右側(cè)頂骨交界骨縫；《大鼠立體定位圖譜》確定內(nèi)囊位置(前囟后1.4 mm，矢狀縫右側(cè)2.4 mm)[15]，在顱板上鉆一直徑約2 mm小孔，將微量注射器垂直插入7 mm，以1 μL/min速度注射N(xiāo)MDA受體，完畢后明膠海棉小心壓迫止血、消毒并縫合。

2次術(shù)后傷口均給予青霉素抗感染；按0.1 mg·kg-1劑量腹腔注射速尿，防止顱內(nèi)水腫；葡萄糖水及飼料喂養(yǎng)，單籠飼養(yǎng)并保持呼吸道通暢。

2.2 各組大鼠處理方法

2.2.1 電針組 以解剖學(xué)知識(shí)為基礎(chǔ)，根據(jù)郭義[16]主編的《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》“動(dòng)物針灸穴位圖譜”進(jìn)行穴位定位。曲池：橈骨近端關(guān)節(jié)外側(cè)前方的凹陷中，直刺3 mm。陽(yáng)陵泉：距足三里(大鼠膝關(guān)節(jié)下側(cè)腓骨小頭下約3 mm)上外側(cè)5 mm，直刺3 mm。大鼠仰臥位束縛常規(guī)消毒，常規(guī)針刺捻轉(zhuǎn)角度90～180°，頻率60～90次/min，持續(xù)1 min，選用SDZ-V電針治療儀密波，100 Hz，電流強(qiáng)度1～3 mA。因?yàn)樽渲泻髢蓚?cè)肢體的肌張力及神經(jīng)損傷情況不同，且取穴原理為上下同施[17]，故未采用主調(diào)節(jié)全身功能性疾病的穴位局部刺激[18]及水平兩側(cè)穴位連接電極[19]，而是正極接在肢體一側(cè)的陽(yáng)陵泉穴毫針針柄，負(fù)極接同側(cè)曲池針柄形成剌激回路[20]，以大鼠肢體輕微抖動(dòng)為度，每日1次，每次30 min，連續(xù)5 d。

2.2.2 中藥組 先按比例配方取藥，然后將飲片以蒸餾水浸泡1 h ,將藥物濃縮至含生藥10 g·ml-1。將制備好的加味芍藥甘草湯水煎劑溫?zé)幔瑒┝堪凑粘扇肆繐Q算成動(dòng)物劑量，灌胃容積為10 mL·kg-1體質(zhì)量，每日1次，連續(xù)5 d。

2.2.3 針?biāo)幗M 先行中藥灌胃，每天1次；30 min后再行電針治療，每次30 min，每日1次，連續(xù)5 d。

2.2.4 其他組 造模時(shí)，假手術(shù)組只做分離，不結(jié)扎不插線。各組術(shù)后青霉素80萬(wàn)U/d肌肉注射，共4 d。治療時(shí)，除空白組外均同電針組一樣束縛30 min，均同藥物組等量生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)5 d。

2.3 動(dòng)物行為學(xué)檢測(cè)

表1示，5 d治療后依據(jù)Zea-longa[21]神經(jīng)功能評(píng)分表進(jìn)行評(píng)分，將大鼠置于干凈的空鼠籠中任由其自由運(yùn)動(dòng)，每只觀察1 min并進(jìn)行相應(yīng)的視頻記錄。

表1 Zea-longa神經(jīng)功能評(píng)分比較

2.4 取材方法

行為學(xué)評(píng)分后各組大鼠禁食不禁水18 h，水合氯醛(10%，3 mL·kg-1)腹腔注射進(jìn)行麻醉后，麻醉斷頭冰盤(pán)上取患側(cè)海馬區(qū)，取一部分切成體積為1 mm3左右大小的米粒狀，置于2% 戊二醛混合固定液固定供電鏡檢測(cè)；其余部分置于凍存管內(nèi)放液氮中迅速降溫1 d，隨后放入-80 ℃冰箱儲(chǔ)存供PCR和WB檢測(cè)。

2.5 電鏡觀察各組大鼠海馬區(qū)突觸超微結(jié)構(gòu)變化

脫水、滲透、包埋后制成70 nm的超薄切，行醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色，H7650透射電鏡觀察并采集照片。

2.6 RT-PCR檢測(cè)大腦海馬區(qū)BDNF、TrkBmRNA的表達(dá)

采用Trizol 提取組織樣本中總RNA，使用PCR儀將1ug總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。表2示，各樣品目的基因和內(nèi)參基因引物序列。PCR反應(yīng)條件: 95 ℃2 min，95 ℃45 s，53 ℃45 s，72 ℃ 30 s，40 循環(huán),數(shù)據(jù)采用儀器自帶qbase plus軟件分析熒光CT值，按照 2-△△ct相對(duì)定量計(jì)算公式，計(jì)算出各樣品的目的mRNA相對(duì)定量結(jié)果。

表2 引物設(shè)計(jì)

2.7 WB檢測(cè)大腦海馬區(qū)BDNF、TrkB蛋白的表達(dá)

提取25 μg 蛋白進(jìn)行 10% SDS-PAGE，并將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(PVDF) 上，5%脫脂牛奶封閉 1 h，分別加入稀釋的一抗(BDNF 1∶2000；Trkb 1∶2000；β-actin 1∶2000)后 4 ℃ 孵育過(guò)夜，洗滌后滴加稀釋的二抗(1 ∶ 10000) 室溫孵育30 min，洗滌后 ECL 化學(xué)發(fā)光液孵育1 min，使用全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)拍照，利用Tanon-4100 GIS3.0軟件獲取相關(guān)條帶灰度值。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果

行為學(xué)測(cè)試結(jié)果表明，與空白組比較，模型組神經(jīng)功能評(píng)分增高(P<0.01)，提示模型構(gòu)建成功；與模型組比較，各治療組評(píng)分均有明顯下降(P<0.05)。

表3 6組大鼠神經(jīng)損傷情況比較{M(Q)}

3.2 電鏡觀察各組大鼠海馬區(qū)突觸超微結(jié)構(gòu)變化

圖1示，電鏡下觀察與空白組比較，模型組突觸數(shù)量減少明顯，囊泡數(shù)量減少，突觸后細(xì)胞終末胞質(zhì)變性溶解顯著，突觸后致密帶密度下降，前后膜發(fā)生融合，間隙界限模糊;與模型組比較，各治療組的突觸數(shù)量明顯增多且相對(duì)密集，囊泡數(shù)量增多，新生的凹形突觸增加，突觸后致密物增厚，間隙規(guī)則緊致，說(shuō)明各治療組均可對(duì)神經(jīng)突觸結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的修復(fù)重塑作用。而3組治療組中，針?biāo)幗M突觸結(jié)構(gòu)改善最佳。

注：A.突觸小體；B.突觸前膜；C.突觸后膜；D.突觸間隙.E.突觸小泡

3.3 各組大鼠大腦海馬區(qū)BDNF、TrkBmRNA表達(dá)比較

表4示，模型組與空白組比較，BDNF、TrkB mRNA的表達(dá)均降低(P<0.01)；而電針組、中藥組及針?biāo)幗M與模型組比較，BDNF、TrkB mRNA的表達(dá)均升高(P<0.05)，針?biāo)幗M升高最明顯(P<0.01)。

表4 各組大鼠大腦海馬區(qū)內(nèi)BDNF、TrkBmRNA表達(dá)比較

3.4 各組大鼠大腦海馬區(qū)內(nèi)BDNF、TrkB蛋白表達(dá)影響

圖2表5示，模型組與空白組比較，BDNF、TrkB蛋白表達(dá)均降低(P<0.01)；而模型組與電針組、中藥組及針?biāo)幗M比較，BDNF、TrkB蛋白的表達(dá)均有升高(P<0.05)，針?biāo)幗M升高最明顯(P<0.01)。

表5 各組大鼠大腦海馬區(qū)內(nèi)BDNF、TrkB蛋白表達(dá)的影響

圖2 各組大鼠大腦海馬區(qū)內(nèi)BDNF、TrkB蛋白表達(dá)條帶

4 討論

BDNF是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)廣泛分布的一種促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)活性的堿性蛋白質(zhì)，主要作用于神經(jīng)元的存活、分化、生長(zhǎng)和發(fā)育，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育具有重要意義。TrkB是BDNF信號(hào)傳導(dǎo)通路上高度親和的配體，TrkB是激活下游信號(hào)傳導(dǎo)通路的必要因子，發(fā)生某些應(yīng)激情況時(shí)，二者根據(jù)應(yīng)激類(lèi)型、時(shí)間及大腦部位的不同而發(fā)生不同改變，這種改變可引起神經(jīng)元的凋亡以及參與多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，而二者結(jié)合強(qiáng)度的增高又可以發(fā)揮神經(jīng)元的修復(fù)及再生作用[22]。

BDNF參與突觸的可塑性。神經(jīng)元的生理活動(dòng)過(guò)程中，BDNF廣泛轉(zhuǎn)錄合成并運(yùn)輸儲(chǔ)存至樹(shù)突中，增加了樹(shù)突的分支，擴(kuò)大了樹(shù)突面積并使樹(shù)突間產(chǎn)生各種聯(lián)系，最終增加樹(shù)突形態(tài)的多效性，影響突觸的可塑性。BDNF與TrkB結(jié)合促進(jìn)神經(jīng)元胞體和樹(shù)突中BDNF合成后運(yùn)送至突觸前膜，并影響突觸后膜上相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)的數(shù)量及分布[23]。腦卒中恢復(fù)過(guò)程中，BDNF能夠維持損傷后的神經(jīng)元樹(shù)突結(jié)構(gòu)形態(tài)的正常[24]，而對(duì)于新生且未成熟的神經(jīng)系統(tǒng)，BDNF可以通過(guò)突觸前后的作用機(jī)制調(diào)節(jié)突觸數(shù)量、突觸功能以及樹(shù)突形態(tài)，從而調(diào)節(jié)突觸可塑性[25](見(jiàn)圖3)。

圖3 BDNF參與腦可塑性比較

課題組在前期研究中論證了SCA的神經(jīng)功能損傷與γ-氨基丁酸(GABA)在大腦中的表達(dá)有關(guān)[26]，作為大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，其減少可以引起肌張力增強(qiáng)，發(fā)生腦卒中肢體痙攣狀態(tài)[27]。而各類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)數(shù)量及分布在突觸后膜受BDNF影響，當(dāng)BDNF表達(dá)異常時(shí)，突觸遞質(zhì)發(fā)生變化，從而引起各類(lèi)神經(jīng)元功能的紊亂[28]。腦卒中肢體痙攣狀態(tài)下BDNF數(shù)量減少，隨之與TrkB的結(jié)合減少，使得突觸可塑性受到一定影響，最終導(dǎo)致GABA的釋放減少，突觸抑制性降低，神經(jīng)的興奮性增強(qiáng)而引起肢體痙攣，所以BDNF的表達(dá)與SCA密切相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)通行為學(xué)觀察、電鏡觀察、Western Blot、RT-PCR方法，對(duì)腦卒中肢體痙攣大鼠海馬區(qū)突觸結(jié)構(gòu)以及BDNF、TrkB的mRNA與蛋白表達(dá)進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示，各種治療均可改善腦卒中肢體痙攣的神經(jīng)突觸受損情況，而大腦海馬區(qū)是神經(jīng)損傷最嚴(yán)重的區(qū)域之一，海馬區(qū)中神經(jīng)突觸的重塑是恢復(fù)神經(jīng)功能的關(guān)鍵因素，針?biāo)幗Y(jié)合的方法可以更好地促進(jìn)海馬區(qū)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的產(chǎn)生，使得損傷的神經(jīng)元恢復(fù)再生，進(jìn)而改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損的運(yùn)動(dòng)功能，緩解腦卒中痙攣狀態(tài)。

針?biāo)幗Y(jié)合是在中醫(yī)學(xué)和/或現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論指導(dǎo)下，根據(jù)針灸、藥物作用特點(diǎn)和各自特長(zhǎng)，針對(duì)同一病證形成實(shí)施針灸與藥物同時(shí)進(jìn)行治療疾病的臨床方案的科學(xué)過(guò)程[29]。此過(guò)程不是二者作用的簡(jiǎn)單疊加,而是相互補(bǔ)充、相互協(xié)同的關(guān)系。既往研究報(bào)道，中醫(yī)復(fù)方[30]、單味中藥[31]以及針灸[32-33]均能改善SCA損傷的神經(jīng)功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，針?biāo)幗Y(jié)合療效優(yōu)于單純針灸或單純中藥治療，治療機(jī)制與其調(diào)節(jié)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子與突觸可塑性有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)還存在一些不足，如針?biāo)幗Y(jié)合的時(shí)間、量效問(wèn)題及臨床運(yùn)用規(guī)律等，課題組下一步將圍繞這些問(wèn)題進(jìn)行研究。