三七總皂苷抗大鼠缺血再灌注損傷作用及對心肌自噬水平的影響?

王 飄， 鄭 晴， 胡 婷， 張海銀， 許言午， 包怡敏

(上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 上海 201203)

缺血性心臟病主要包括冠狀動脈疾病和急性心肌梗死等，是中老年人的常見病和多發(fā)病之一，其發(fā)病率也在逐年上升[1]。使缺血心肌及時恢復(fù)血流灌注及氧供應(yīng)是目前最常見的治療方法[2]，但在治療疾病的同時，缺血再灌注(ischemia/reperfution,I/R)可能導(dǎo)致氧自由基增加、鈣超載、細(xì)胞凋亡等，從而造成心肌細(xì)胞死亡，誘導(dǎo)心臟功能異常，即產(chǎn)生心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injurg,MIRI)[3]。由于MIRI的較高致死性和致殘性，因此減輕MIRI對于臨床治療缺血性心臟病具有重要意義。自噬可作為內(nèi)源性調(diào)節(jié)機(jī)制參與到I/R過程中[4，5]。有研究表明，當(dāng)I/R損傷發(fā)生后心肌自噬水平也會增加[6]，但自噬在MIRI中的具體作用目前仍存在爭議。針對MIRI 損傷的治療，中藥因其毒副作用小、能從疾病多環(huán)節(jié)入手等優(yōu)勢而表現(xiàn)出較好的療效，如三七、人參等。三七的功效主要包括強(qiáng)心止血，現(xiàn)代藥理學(xué)表明三七的主要成分三七總皂苷(panax notoginseng saponins,PNS)具有抗炎、抗氧化等藥理作用[7]。現(xiàn)有研究表明，PNS對MIRI有一定的緩解作用，其主要作用途徑包括抗氧化應(yīng)激、抗凋亡等[8，9]，但其能否通過自噬途徑減輕MIRI損傷的研究還較少。本研究通過觀察PNS對自噬的作用，探索PNS對抗I/R損傷保護(hù)心肌可能的作用機(jī)制。本研究方案經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號PZSHUTCM190609017。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠27只，約10周齡，上海市斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(滬)2012-0002。統(tǒng)一飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，飼養(yǎng)環(huán)境相對濕度(55±10)%，溫度(23±2)℃，自由飲水并給予普通飲食，光照周期12 h/12 h明暗交替。

1.2 藥品、試劑與儀器

血栓通注射液組成成分為三七總皂苷(昆明制藥集團(tuán)股份有限公司，批號13HK03)；血清肌鈣蛋白T(cTnT)ELISA檢測試劑盒(武漢華美生物工程有限公司，貨號CSB-E11403r，批號X03033170)；抗體包括SQSTM1/p62(CST，貨號5114 s)、Beclin-1(CST，貨號3495 s)、LC3B/MAP1LC3B(Novus，貨號NB100-2220)。酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司，型號Synergy)；動物呼吸機(jī)(成都儀器廠，型號DHX-300)；多通道生物信號采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠，型號RM6240BD)。

1.3 分組與造模

將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)、模型組(I/R)和三七總皂苷組(I/R+PNS)各9只。采用結(jié)扎冠狀動脈左前降支(LAD)法建立大鼠心肌I/R模型，麻醉后仰臥位固定并行氣管插管，連接呼吸機(jī)維持呼吸(90次/min，呼吸比為1∶2，潮氣量8～10 mL)，在左胸骨第四肋處行胸廓切開術(shù)以暴露心臟，并用5-0縫合線結(jié)扎LAD。缺血40 min后松開縫合線恢復(fù)血流灌注2 h。Sham組大鼠心肌不進(jìn)行LAD結(jié)扎，其余手術(shù)步驟均相同。I/R + PNS組大鼠于造模前30 min腹腔注射PNS(50 mg/kg)[10]，其他大鼠腹腔注射生理鹽水(10 ml/kg)。

1.4 大鼠心功能檢測

右頸總動脈插管至左心室，另一端連接生物信號采集處理系統(tǒng)，在造模過程中記錄左心室內(nèi)壓力(LVP)曲線，測量左心室等容收縮期壓力最大變化速率(+dp/dtmax)、左心室等容舒張期壓力最大變化速率(-dp/dtmax)、左心室平均收縮壓(mLVSP)、左心室平均舒張壓(mLVDP)、左心室開始收縮至達(dá)到室內(nèi)壓最大上升速率時間(t-dp/dtmax)的變化，并計算左心室發(fā)展壓(DP，DP=mLVSP-mLVDP)。

1.5 心肌組織形態(tài)學(xué)觀察

再灌注結(jié)束后立即取下心臟，于預(yù)冷的生理鹽水中沖洗后切取左心室前壁心肌。經(jīng)預(yù)冷的4%多聚甲醛固定后流水沖洗12 h，隨后將標(biāo)本進(jìn)行脫水處理，脫水標(biāo)本浸泡于二甲苯中，常規(guī)石蠟包埋切片后進(jìn)行HE染色。染色結(jié)束后用常規(guī)樹脂進(jìn)行封片，并于光學(xué)顯微鏡下觀察心肌病理學(xué)改變。

1.6 血清心肌損傷標(biāo)志物檢測

再灌注結(jié)束后取頸總動脈血，室溫靜置30 min，3000 r/min離心10 min回收血清。根據(jù)說明將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加入微孔板中37 ℃下孵育2 h，隨后依次加入生物素抗體、HRP稀釋液和底物溶液，并根據(jù)要求孵育不同時長，最后添加終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀450 nm波長讀取光密度(OD)值，計算血清中cTnT含量。

1.7 Western blot檢測

剪取缺血再灌注區(qū)域心肌組織適量，勻漿后以4 ℃ 14000 r/min離心20 min，取上清獲得組織總蛋白。采用BCA法檢測蛋白濃度，蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%BSA封閉1 h后加入稀釋的一抗4 ℃孵育過夜，之后使用適宜的二抗室溫孵育1 h，ECL發(fā)光試劑盒顯影蛋白條帶，Image J軟件測定條帶灰度值，目的蛋白相對表達(dá)量用目的蛋白與內(nèi)參(GAPDH)比值表示。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 三七總皂苷對大鼠心功能的影響

血流動力學(xué)能夠靈敏地反映心臟收縮和舒張功能。與Sham組比較，大鼠心肌缺血40 min，再灌注2 h后左心室的+dp/dtmax呈下降趨勢，DP明顯減小，t-dp/dtmax顯著增大(P<0.05)，說明心室收縮功能下降(圖1A、1C、1 D)，-dp/dtmax顯著下降表明心肌舒張功能也降低(圖1B)(P<0.05)。PNS預(yù)處理可以明顯減輕上述指標(biāo)的變化，改善心功能。

注：與Sham組比較：*P<0.05；與I/R組比較：#P<0.05，n=9

2.2 三七總皂苷對大鼠心肌組織形態(tài)的影響

HE染色結(jié)果顯示，Sham組大鼠的心肌組織纖維分布整齊、形態(tài)完整，無纖維結(jié)構(gòu)改變；模型組出現(xiàn)大鼠心肌組織肌纖維紊亂甚至斷裂、肌絲溶解等病理變化；而在PNS組中，由于缺血再灌注所引起心肌組織形態(tài)的損傷情況有明顯改善(圖2)。

圖2 各組大鼠心肌組織形態(tài)HE染色結(jié)果比較(×200)

2.3 三七總皂苷對大鼠血清肌鈣蛋白含量的影響

血清中的肌鈣蛋白含量可以反映心肌細(xì)胞受損情況。與Sham組比較，I/R組血清cTnT含量明顯升高(P<0.05)，提示心肌細(xì)胞損傷嚴(yán)重；而與I/R組比較，PNS組血清cTnT明顯含量下降(圖3)(P<0.05)，表明PNS可以有效改善因I/R所引起的心肌細(xì)胞損傷情況。

注：與Sham組比較：*P<0.05；與I/R組比較：#P<0.05，n=3

2.4 三七總皂苷對大鼠心肌細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的影響

與Sham組比較，I/R組心肌組織Beclin-1、LC3Ⅱ的蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)，P62蛋白表達(dá)有上升趨勢但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與I/R組比較，PNS組大鼠心肌組織蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ的表達(dá)明顯降低(圖4C，4 D)，P62蛋白表達(dá)明顯升高(圖4B)(P<0.05)，表明PNS對自噬有明顯的抑制作用。

注：與Sham組比較：*P<0.05；與I/R組比較：#P<0.05，n=5～6

3 討論

缺血性心臟病目前是全球死亡率最高的疾病，臨床主要的治療手段包括溶栓治療或經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)等，以期達(dá)到恢復(fù)血流灌注的目的[11]。然而心肌組織發(fā)生缺血后，恢復(fù)血流灌注時可能會發(fā)生組織損傷進(jìn)行性加重的過程，即缺血再灌注損傷(MIRI)[3]。

MIRI具體表現(xiàn)主要包括心功能下降、心肌組織結(jié)構(gòu)破壞、心肌內(nèi)肌鈣蛋白釋放等。心功能下降主要包括心肌收縮和舒張能力減弱，一般可用血流動力學(xué)指標(biāo)反映心功能的變化[12]。+dp/dtmax和-dp/dtmax為衡量心臟收縮和舒張功能的經(jīng)典指標(biāo)，當(dāng)心肌收縮功能或舒張功能障礙時其值降低[13]。本實驗結(jié)果同樣顯示，當(dāng)發(fā)生I/R時，+dp/dtmax和-dp/dtmax值明顯降低；而經(jīng)過PNS預(yù)處理后+dp/dtmax和-dp/dtmax下降趨勢有明顯改善，說明PNS可以改善因缺血所導(dǎo)致的心臟收縮及舒張功能障礙。除+dp/dtmax外，左心室發(fā)展壓(DP)和t-dp/dtmax也可以反映心室收縮功能，當(dāng)心肌收縮功能障礙時DP值降低，t-dp/dtmax值升高。本研究結(jié)果也顯示，I/R過程中DP呈明顯下降趨勢，t-dp/dtmax值明顯升高；而用PNS預(yù)處理后DP值有明顯的上升，t-dp/dtmax值有明顯的下降，同樣說明PNS預(yù)處理后心室收縮功能障礙得到改善。因此，進(jìn)行PNS預(yù)處理可以有效減輕因I/R所導(dǎo)致的心肌收縮和舒張功能障礙，從而達(dá)到保護(hù)心功能的目的。

除血流動力學(xué)指標(biāo)外，心肌組織病理學(xué)觀察及血清中肌鈣蛋白含量檢測也可以判斷心肌損傷情況。當(dāng)出現(xiàn)心肌損傷時，會發(fā)生心肌纖維排列紊亂、肌纖維斷裂、溶解、壞死等現(xiàn)象[14]。本研究中，HE光鏡染色結(jié)果顯示，I/R組有明顯的心肌纖維排列紊亂、橫紋消失、心肌萎縮、肌纖維斷裂溶解、心肌間質(zhì)水腫等現(xiàn)象，說明此時心肌損傷明顯；PNS預(yù)處理的大鼠心肌肌纖維排列較整齊，與I/R組比較病理變化不明顯，說明PNS能有效改善I/R所引起的心肌損傷。心肌肌鈣蛋白T(cTnT)主要存在于心肌組織中，對心肌損傷具有高度的特異性和敏感性。當(dāng)心肌細(xì)胞受損時，由于細(xì)胞結(jié)構(gòu)和膜通透性被破壞，cTnT發(fā)生降解并釋放到血清中，其血清中含量越多表明心肌損傷越嚴(yán)重[15]。本研究中，ELISA結(jié)果顯示，與Sham組比較，I/R組血清cTnT含量明顯升高，提示再灌注后心肌損傷較嚴(yán)重；PNS預(yù)處理明顯降低血清中cTnT的含量，說明PNS可以有效改善心肌損傷的情況。

自噬是將功能失調(diào)或受損的細(xì)胞質(zhì)成分靶向溶酶體進(jìn)行降解和再循環(huán)，從而維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的一個過程[16]。當(dāng)心肌缺血再灌注發(fā)生后，受損的心肌中自噬水平會發(fā)生改變。目前研究表明，抑制過度自噬可以起到保護(hù)心肌抗缺血再灌注損傷的作用[17]，也有部分研究認(rèn)為促進(jìn)自噬發(fā)生也可以起到相同作用[18]。而本實驗研究結(jié)果顯示，通過抑制過度自噬可以起到抗心肌缺血再灌注損傷的作用。正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)自噬處于基礎(chǔ)水平；而當(dāng)I/R發(fā)生后，為應(yīng)對氧化應(yīng)激等反應(yīng)，使得自噬不斷增強(qiáng)，過度自噬則導(dǎo)致心肌細(xì)胞大量死亡，從而引起MIRI[19]。Beclin-1是細(xì)胞自噬起始階段的關(guān)鍵因子，可反映細(xì)胞自噬水平的高低[20]，自噬被抑制時Beclin-1表達(dá)被抑制。LC3是存在于自噬體的蛋白且對自噬體的形成起到重要作用，LC3主要以非脂質(zhì)形式存在于細(xì)胞中，即LC3Ⅰ；當(dāng)自噬發(fā)生時，LC3Ⅰ 脂化形成LC3Ⅱ[21，22]。因此，LC3Ⅱ也被用作反映自噬水平的標(biāo)記物，當(dāng)自噬增強(qiáng)時，LC3Ⅱ 表達(dá)也隨之上調(diào)。本研究中，I/R組的Beclin-1、LC3Ⅱ 蛋白表達(dá)明顯升高，說明此時自噬水平明顯上升；而PNS預(yù)處理有效改善了這種升高趨勢，使得Beclin-1、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)含量明顯降低，表明PNS對自噬有一定的抑制作用。為進(jìn)一步說明PNS對自噬的下游環(huán)節(jié)是否具有調(diào)節(jié)作用，本實驗又對自噬相關(guān)蛋白P62進(jìn)行了檢測。P62是自噬受體同時也是自噬選擇性底物[23]，可以直接與LC3結(jié)合形成自噬體[24]，最終被運送至溶酶體系統(tǒng)形成自噬溶酶體并降解；而當(dāng)自噬體與溶酶體結(jié)合受阻時，則會導(dǎo)致P62與泛素化產(chǎn)物結(jié)合，導(dǎo)致其表達(dá)水平升高。有研究表明，當(dāng)自噬被抑制時，P62蛋白表達(dá)水平升高[25]。本研究結(jié)果同樣顯示，I/R過程中P62表達(dá)沒有明顯的升高趨勢，說明此時自噬體與溶酶體結(jié)合正常，自噬處于正常發(fā)生狀態(tài)；而PNS預(yù)處理則使得P62表達(dá)明顯升高，說明自噬體與溶酶體結(jié)合受阻，自噬處于被抑制狀態(tài)。綜合以上結(jié)果可以看出，PNS可以上調(diào)心肌組織中P62蛋白的表達(dá)，同時下調(diào)Beclin-1、LC3Ⅱ的蛋白表達(dá)量，說明PNS可以通過抑制自噬起始環(huán)節(jié)及下游自噬體與溶酶體的結(jié)合，達(dá)到抑制自噬過度發(fā)生的目的，從而保護(hù)心肌抗缺血再灌注損傷。

綜上所述，PNS可以有效改善心肌缺血再灌注損傷大鼠的心功能，減輕心肌組織病理損傷，其作用機(jī)制可能與抑制過度自噬有關(guān)，最終達(dá)到保護(hù)心臟抗心肌缺血再灌注損傷的目的。