藍芩口服液HPLC指紋圖譜的建立與分析

高 芳

藍芩口服液的藥物組成有板藍根、黃芩、梔子、黃柏、胖大海，具有清熱解毒和利咽消腫的功效，因此臨床上主要用于治療急性咽炎、肺胃實熱證所致的咽痛、咽干、咽部灼熱等病癥[1]。由于藍芩口服液是自主開發(fā)的一款中成藥，目前藍芩口服液的臨床研究根據(jù)其抗病毒的作用，對病毒在體內(nèi)和口腔的復制和繁殖具有有效的阻斷作用，可用于小兒手足口病[2, 3]、腮腺炎[4]、水痘[5]、兒童病毒性心肌炎[6]、皰疹性咽峽炎[7]和上呼吸道感染[8]等疾病；根據(jù)其抗菌消炎的作用，通過抑制枯草桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等多種細菌，可治療慢性咽炎[9]、急性扁桃體炎[10]、口腔潰瘍[11]等疾病。隨著藍芩口服液在臨床上使用的廣泛性增強，對藍芩口服液藥品質(zhì)量的監(jiān)控就越重要。目前對藍芩口服液的藥理研究較少，基于藍芩口服液處方中中藥藥材和成分多且繁雜，本研究將基于高效液相色譜法(HPLC)建立藍芩口服液的指紋圖譜并對其進行分析，為制定藍芩口服液有效的藥品質(zhì)量控制提供科學的參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器型號為2695的Acquity HPLCTM系統(tǒng)購于美國Waters公司；型號為KH3200B超聲波清洗器購于昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；型號MS-TS的電子分析天平購于上海梅特勒-托利多有限公司。

1.2 試劑鹽酸小檗堿對照品(批號：110713-200911)；黃芩苷對照品(批號：110715-201016)；黃芩素對照品(批號：111595-200905)；腺苷對照品(批號：110879-200202)、苯甲酸對照品(批號：100419-200301)均購于北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司。色譜純甲醇和乙腈購于美國Sigma公司；色譜純磷酸購于天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.3 分析藥品藍芩口服液(規(guī)格：10 ml，批準文號：國藥準字Z19991005，生產(chǎn)廠商：揚子江藥業(yè)集團)，分別采用不同批次17042021、17050221、17052722、17052821、17041832、17042721、17042521、17050432、17050331、17050232等10個不同批次。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱：型號為XBridge BEH HPLC C18，規(guī)格為4.6 mm×250 mm，粒徑5 μm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μl。流動相是以乙腈∶0.2%磷酸水溶液作為A∶B流動相；梯度洗脫：洗脫時間為70 min。整個梯度流動洗脫程序中流速控制在1 ml/min；檢測波長：230 nm。見表1。

表1 乙腈∶0.2%磷酸水溶液(A∶B)梯度流動洗脫程序

2.2 混合對照品溶液配制分別精密稱取鹽酸小檗堿對照品、黃芩素對照品、腺苷對照品、苯甲酸對照品，加入甲醇充分溶解，而黃芩苷對照品僅用70%甲醇進行溶解，最終配制成鹽酸小檗堿對照品、黃芩苷對照品、黃芩素對照品、腺苷對照品、苯甲酸對照品濃度分別為4.55 μg/ml、96.00 μg/ml、10.50 μg/ml、7.54 μg/ml、161.00 μg/ml，即得混合對照品溶液，置于4 ℃冰箱保存。

2.3 供試品溶液配制采用移液器精密取200 μl藍芩口服液于5 ml容量瓶中，加入甲醇進行定容(以容量瓶刻度為宜)，封口搖動充分混合均勻，用0.45 μm的有機過濾膜過濾即為藍芩口服液供試品溶液。

2.4 專屬性實驗根據(jù)2.2和2.3配制的混合對照品溶液、供試品溶液，同時在此基礎(chǔ)上配制陰性對照進行專屬性測驗，以板藍根為例，結(jié)果表明采用HPLC研究藍芩口服液供試品溶液具有良好的專屬性。見圖1。

圖1 專屬性實驗

2.5 線性關(guān)系考察根據(jù)HPLC指紋圖中對照品保留時間和紫外光譜，對5種指標性成分進行回歸方程分析。結(jié)果顯示藍芩口服液中的鹽酸小檗堿對照品、黃芩苷對照品、黃芩素對照品、腺苷對照品、苯甲酸對照品均具有良好的線性關(guān)系，見表2。

表2 藍芩口服液中各主要成分對照品的線性關(guān)系考察結(jié)果

2.6 精密度實驗在精密實驗中將取同一批次藍芩口服液供試品溶液連續(xù)進樣6次，考察HPLC指紋圖譜色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD，結(jié)果顯示鹽酸小檗堿對照品、黃芩苷對照品、黃芩素對照品、腺苷對照品、苯甲酸對照品的HPLC指紋圖譜色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值均小于3%，即說明精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性實驗在穩(wěn)定性實驗中，取同一份藍芩口服液供試品溶液于4 ℃冰箱中靜置，時間依次為0、2、4、6、8、10、12、24 h，計算HPLC指紋圖譜色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD，結(jié)果顯示鹽酸小檗堿對照品、黃芩苷對照品、黃芩素對照品、腺苷對照品、苯甲酸對照品的HPLC指紋圖譜色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值均<3%，即說明藍芩口服液供試品溶液在靜置24 h內(nèi)均能保持良好的穩(wěn)定性。

2.8 重復性實驗取同一批藍芩口服液供試品溶液共6份，在相同的色譜條件進行測定，計算HPLC指紋圖譜色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD，結(jié)果表明，6份同一批號的藍芩口服液供試品溶液HPLC指紋圖譜色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值均<2.0%，表明本研究HPLC指紋圖譜法具有良好的重復性。

2.9 回收率實驗精密稱取已知含量的藍芩口服液供試品溶液各5 ml，每一份均加入等量的對照品溶液，混合均勻后，對混合液和各個對照品溶液分別逐級稀釋，共檢測3次，檢測藍芩口服液供試品溶液的平均回收率，結(jié)果鹽酸小檗堿對照品、黃芩苷對照品、黃芩素對照品、腺苷對照品、苯甲酸對照品平均回收率分別為(100.24±1.05)%、(99.44±0.86)%、(100.53±1.00)%、(100.34±0.92)%、(99.88±0.58)%，鹽酸小檗堿對照品、黃芩苷對照品、黃芩素對照品、腺苷對照品、苯甲酸對照品的RSD分別為1.35%、1.22%、2.02%、0.93%、1.17%，說明方法的準確度良好。見表3。

表3 加樣回收率結(jié)果

2.10 樣品檢測結(jié)果

2.10.1 藍芩口服液指紋圖譜的建立根據(jù)國家藥典委員會頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”，導入10批藍芩口服液色譜圖，“時間窗”寬度為0.1 min，研究采用樣品5生成對照譜，指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)經(jīng)過多點矯正和數(shù)據(jù)匹配生成色譜指紋圖譜，并對指紋圖譜進行共有模式分析，提示所檢測10批藍芩口服液質(zhì)量穩(wěn)定。見圖2、圖3。

圖2 10批藍芩口服液HPLC指紋圖譜

圖3 藍芩口服液共有模式指紋圖譜

2.10.2 藍芩口服液成分的含量分析取10個不同批次的藍芩口服液進行成分含量分析，不同批次的藍芩口服液成分含量有一定的差異。見表4。

表4 藍芩口服液成分的含量分析

3 討論

3.1 色譜柱的選擇XBridge BEH色譜柱是具有獨特選擇性的色譜柱，能夠為HPLC分離平臺提供操作穩(wěn)定性和方法可擴展性。該色譜柱可消除吸附劑選擇帶來的影響，在HPLC研究中可靈活選用各種流動相、溫度和pH條件進行分析；常規(guī)HPLC操作方法即可有效分離最具挑戰(zhàn)性的樣品混合物。并且XBridge BEH色譜柱能去除流動相液體中可能存在的顆粒污染物和化學污染物，從而在不影響色譜性能的前提下改善分析柱性能。若是在多種固定相選擇中亦能夠?qū)崿F(xiàn)針對各種化合物的選擇性和保留性，同時不犧牲性能屬性(例如堿性化合物的優(yōu)異峰形、低柱流失、出色的批間重現(xiàn)性和高柱效等)。本研究中發(fā)現(xiàn)XBridge BEH色譜柱可通過減小峰寬和增大峰高來改善系統(tǒng)性能，從而最大限度提升分析物靈敏度，且能夠在分離度和樣品通量之間實現(xiàn)完美平衡，并將現(xiàn)有HPLC方法的效率提升4倍[12]。

3.2 藍芩口服液藥理分析近年來，隨著現(xiàn)代藥理研究的深入，藍芩口服液在臨床運用范圍得到不斷擴展，本研究成分分析主要有5種成分鹽酸小檗堿、黃芩苷、黃芩素、腺苷、苯甲酸。鹽酸小檗堿為黃柏中的主要成分，對枯草桿菌、卡他球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白喉桿菌、腦膜炎雙球菌、肺炎球菌、溶血性鏈球菌等多種革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均有較強的抑制作用[13]；有研究顯示黃柏可收縮血管，通過降低毛細血管通透性和減少單核細胞滲出和巨噬細胞生成，進而減少炎性滲出和抑制慢性炎癥肉芽腫的形成，有效緩解急性炎癥的腫脹度[14]。黃芩苷、黃芩素均是黃芩的主要成分之一，黃芩苷通過抑制體內(nèi)和口腔中病毒的復制和繁殖，從而阻斷病毒起到有效的抗病毒作用[15]；而黃芩素則抑制促炎因子的分泌起到良好的消炎作用[16]。藍芩口服液中的腺苷可抑制炎癥早期的水腫和滲出，苯甲酸可抑制炎癥晚期的組織增生和肉芽組織的形成[1]。