藍(lán)芩口服液HPLC指紋圖譜的建立與分析

高 芳

藍(lán)芩口服液的藥物組成有板藍(lán)根、黃芩、梔子、黃柏、胖大海，具有清熱解毒和利咽消腫的功效，因此臨床上主要用于治療急性咽炎、肺胃實(shí)熱證所致的咽痛、咽干、咽部灼熱等病癥[1]。由于藍(lán)芩口服液是自主開(kāi)發(fā)的一款中成藥，目前藍(lán)芩口服液的臨床研究根據(jù)其抗病毒的作用，對(duì)病毒在體內(nèi)和口腔的復(fù)制和繁殖具有有效的阻斷作用，可用于小兒手足口病[2, 3]、腮腺炎[4]、水痘[5]、兒童病毒性心肌炎[6]、皰疹性咽峽炎[7]和上呼吸道感染[8]等疾病；根據(jù)其抗菌消炎的作用，通過(guò)抑制枯草桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等多種細(xì)菌，可治療慢性咽炎[9]、急性扁桃體炎[10]、口腔潰瘍[11]等疾病。隨著藍(lán)芩口服液在臨床上使用的廣泛性增強(qiáng)，對(duì)藍(lán)芩口服液藥品質(zhì)量的監(jiān)控就越重要。目前對(duì)藍(lán)芩口服液的藥理研究較少，基于藍(lán)芩口服液處方中中藥藥材和成分多且繁雜，本研究將基于高效液相色譜法(HPLC)建立藍(lán)芩口服液的指紋圖譜并對(duì)其進(jìn)行分析，為制定藍(lán)芩口服液有效的藥品質(zhì)量控制提供科學(xué)的參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器型號(hào)為2695的Acquity HPLCTM系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó)Waters公司；型號(hào)為KH3200B超聲波清洗器購(gòu)于昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；型號(hào)MS-TS的電子分析天平購(gòu)于上海梅特勒-托利多有限公司。

1.2 試劑鹽酸小檗堿對(duì)照品(批號(hào)：110713-200911)；黃芩苷對(duì)照品(批號(hào)：110715-201016)；黃芩素對(duì)照品(批號(hào)：111595-200905)；腺苷對(duì)照品(批號(hào)：110879-200202)、苯甲酸對(duì)照品(批號(hào)：100419-200301)均購(gòu)于北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司。色譜純甲醇和乙腈購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；色譜純磷酸購(gòu)于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.3 分析藥品藍(lán)芩口服液(規(guī)格：10 ml，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z19991005，生產(chǎn)廠商：揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán))，分別采用不同批次17042021、17050221、17052722、17052821、17041832、17042721、17042521、17050432、17050331、17050232等10個(gè)不同批次。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱：型號(hào)為XBridge BEH HPLC C18，規(guī)格為4.6 mm×250 mm，粒徑5 μm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μl。流動(dòng)相是以乙腈∶0.2%磷酸水溶液作為A∶B流動(dòng)相；梯度洗脫：洗脫時(shí)間為70 min。整個(gè)梯度流動(dòng)洗脫程序中流速控制在1 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm。見(jiàn)表1。

表1 乙腈∶0.2%磷酸水溶液(A∶B)梯度流動(dòng)洗脫程序

2.2 混合對(duì)照品溶液配制分別精密稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品、黃芩素對(duì)照品、腺苷對(duì)照品、苯甲酸對(duì)照品，加入甲醇充分溶解，而黃芩苷對(duì)照品僅用70%甲醇進(jìn)行溶解，最終配制成鹽酸小檗堿對(duì)照品、黃芩苷對(duì)照品、黃芩素對(duì)照品、腺苷對(duì)照品、苯甲酸對(duì)照品濃度分別為4.55 μg/ml、96.00 μg/ml、10.50 μg/ml、7.54 μg/ml、161.00 μg/ml，即得混合對(duì)照品溶液，置于4 ℃冰箱保存。

2.3 供試品溶液配制采用移液器精密取200 μl藍(lán)芩口服液于5 ml容量瓶中，加入甲醇進(jìn)行定容(以容量瓶刻度為宜)，封口搖動(dòng)充分混合均勻，用0.45 μm的有機(jī)過(guò)濾膜過(guò)濾即為藍(lán)芩口服液供試品溶液。

2.4 專屬性實(shí)驗(yàn)根據(jù)2.2和2.3配制的混合對(duì)照品溶液、供試品溶液，同時(shí)在此基礎(chǔ)上配制陰性對(duì)照進(jìn)行專屬性測(cè)驗(yàn)，以板藍(lán)根為例，結(jié)果表明采用HPLC研究藍(lán)芩口服液供試品溶液具有良好的專屬性。見(jiàn)圖1。

圖1 專屬性實(shí)驗(yàn)

2.5 線性關(guān)系考察根據(jù)HPLC指紋圖中對(duì)照品保留時(shí)間和紫外光譜，對(duì)5種指標(biāo)性成分進(jìn)行回歸方程分析。結(jié)果顯示藍(lán)芩口服液中的鹽酸小檗堿對(duì)照品、黃芩苷對(duì)照品、黃芩素對(duì)照品、腺苷對(duì)照品、苯甲酸對(duì)照品均具有良好的線性關(guān)系，見(jiàn)表2。

表2 藍(lán)芩口服液中各主要成分對(duì)照品的線性關(guān)系考察結(jié)果

2.6 精密度實(shí)驗(yàn)在精密實(shí)驗(yàn)中將取同一批次藍(lán)芩口服液供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，考察HPLC指紋圖譜色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD，結(jié)果顯示鹽酸小檗堿對(duì)照品、黃芩苷對(duì)照品、黃芩素對(duì)照品、腺苷對(duì)照品、苯甲酸對(duì)照品的HPLC指紋圖譜色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值均小于3%，即說(shuō)明精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)在穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中，取同一份藍(lán)芩口服液供試品溶液于4 ℃冰箱中靜置，時(shí)間依次為0、2、4、6、8、10、12、24 h，計(jì)算HPLC指紋圖譜色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD，結(jié)果顯示鹽酸小檗堿對(duì)照品、黃芩苷對(duì)照品、黃芩素對(duì)照品、腺苷對(duì)照品、苯甲酸對(duì)照品的HPLC指紋圖譜色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值均<3%，即說(shuō)明藍(lán)芩口服液供試品溶液在靜置24 h內(nèi)均能保持良好的穩(wěn)定性。

2.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一批藍(lán)芩口服液供試品溶液共6份，在相同的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算HPLC指紋圖譜色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD，結(jié)果表明，6份同一批號(hào)的藍(lán)芩口服液供試品溶液HPLC指紋圖譜色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值均<2.0%，表明本研究HPLC指紋圖譜法具有良好的重復(fù)性。

2.9 回收率實(shí)驗(yàn)精密稱取已知含量的藍(lán)芩口服液供試品溶液各5 ml，每一份均加入等量的對(duì)照品溶液，混合均勻后，對(duì)混合液和各個(gè)對(duì)照品溶液分別逐級(jí)稀釋，共檢測(cè)3次，檢測(cè)藍(lán)芩口服液供試品溶液的平均回收率，結(jié)果鹽酸小檗堿對(duì)照品、黃芩苷對(duì)照品、黃芩素對(duì)照品、腺苷對(duì)照品、苯甲酸對(duì)照品平均回收率分別為(100.24±1.05)%、(99.44±0.86)%、(100.53±1.00)%、(100.34±0.92)%、(99.88±0.58)%，鹽酸小檗堿對(duì)照品、黃芩苷對(duì)照品、黃芩素對(duì)照品、腺苷對(duì)照品、苯甲酸對(duì)照品的RSD分別為1.35%、1.22%、2.02%、0.93%、1.17%，說(shuō)明方法的準(zhǔn)確度良好。見(jiàn)表3。

表3 加樣回收率結(jié)果

2.10 樣品檢測(cè)結(jié)果

2.10.1 藍(lán)芩口服液指紋圖譜的建立根據(jù)國(guó)家藥典委員會(huì)頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”，導(dǎo)入10批藍(lán)芩口服液色譜圖，“時(shí)間窗”寬度為0.1 min，研究采用樣品5生成對(duì)照譜，指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)經(jīng)過(guò)多點(diǎn)矯正和數(shù)據(jù)匹配生成色譜指紋圖譜，并對(duì)指紋圖譜進(jìn)行共有模式分析，提示所檢測(cè)10批藍(lán)芩口服液質(zhì)量穩(wěn)定。見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 10批藍(lán)芩口服液HPLC指紋圖譜

圖3 藍(lán)芩口服液共有模式指紋圖譜

2.10.2 藍(lán)芩口服液成分的含量分析取10個(gè)不同批次的藍(lán)芩口服液進(jìn)行成分含量分析，不同批次的藍(lán)芩口服液成分含量有一定的差異。見(jiàn)表4。

表4 藍(lán)芩口服液成分的含量分析

3 討論

3.1 色譜柱的選擇XBridge BEH色譜柱是具有獨(dú)特選擇性的色譜柱，能夠?yàn)镠PLC分離平臺(tái)提供操作穩(wěn)定性和方法可擴(kuò)展性。該色譜柱可消除吸附劑選擇帶來(lái)的影響，在HPLC研究中可靈活選用各種流動(dòng)相、溫度和pH條件進(jìn)行分析；常規(guī)HPLC操作方法即可有效分離最具挑戰(zhàn)性的樣品混合物。并且XBridge BEH色譜柱能去除流動(dòng)相液體中可能存在的顆粒污染物和化學(xué)污染物，從而在不影響色譜性能的前提下改善分析柱性能。若是在多種固定相選擇中亦能夠?qū)崿F(xiàn)針對(duì)各種化合物的選擇性和保留性，同時(shí)不犧牲性能屬性(例如堿性化合物的優(yōu)異峰形、低柱流失、出色的批間重現(xiàn)性和高柱效等)。本研究中發(fā)現(xiàn)XBridge BEH色譜柱可通過(guò)減小峰寬和增大峰高來(lái)改善系統(tǒng)性能，從而最大限度提升分析物靈敏度，且能夠在分離度和樣品通量之間實(shí)現(xiàn)完美平衡，并將現(xiàn)有HPLC方法的效率提升4倍[12]。

3.2 藍(lán)芩口服液藥理分析近年來(lái)，隨著現(xiàn)代藥理研究的深入，藍(lán)芩口服液在臨床運(yùn)用范圍得到不斷擴(kuò)展，本研究成分分析主要有5種成分鹽酸小檗堿、黃芩苷、黃芩素、腺苷、苯甲酸。鹽酸小檗堿為黃柏中的主要成分，對(duì)枯草桿菌、卡他球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白喉?xiàng)U菌、腦膜炎雙球菌、肺炎球菌、溶血性鏈球菌等多種革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌均有較強(qiáng)的抑制作用[13]；有研究顯示黃柏可收縮血管，通過(guò)降低毛細(xì)血管通透性和減少單核細(xì)胞滲出和巨噬細(xì)胞生成，進(jìn)而減少炎性滲出和抑制慢性炎癥肉芽腫的形成，有效緩解急性炎癥的腫脹度[14]。黃芩苷、黃芩素均是黃芩的主要成分之一，黃芩苷通過(guò)抑制體內(nèi)和口腔中病毒的復(fù)制和繁殖，從而阻斷病毒起到有效的抗病毒作用[15]；而黃芩素則抑制促炎因子的分泌起到良好的消炎作用[16]。藍(lán)芩口服液中的腺苷可抑制炎癥早期的水腫和滲出，苯甲酸可抑制炎癥晚期的組織增生和肉芽組織的形成[1]。