利用RNA-seq技術分析有機磷農藥作用下雄性小鼠睪丸組織差異表達基因

包玉龍，董 超，劉嘉琦，周好樂

（內蒙古醫科大學，內蒙古 呼和浩特 010010）

有機磷農藥可防止植物產生病蟲害，確保農作物高產、穩產，在農業生產中發揮著重要作用。但農藥也可通過食物、環境暴露及職業接觸等途徑進入人體，導致急性或慢性中毒[1-3]。雖然國內外有關有機磷農藥中毒機制的研究很多，但是對有機磷農藥中毒發生在基因水平的改變的研究甚少。已有的有機磷農藥對雄性動物生殖影響的研究主要集中在生殖毒性作用方面，這些毒性作用主要表現為精液質量下降、增加精子畸形率、降低精子活率和數量等[4-21]。

該試驗利用轉錄組測序技術（RNA-seq）分析有機磷農藥作用下雄性小鼠睪丸組織差異表達基因，為探索有機磷農藥引起雄性小鼠生殖毒性的分子機制打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 有機磷農藥的篩選。選擇最常用的并已表現出毒性作用的有機磷農藥DDV。

1.1.2 動物分組。選擇40只昆明種雄性小鼠，隨機分為對照組和低劑量染毒組、中劑量染毒組、高劑量染毒組。低、中、高劑量染毒組染毒劑量依次為5.0 mg/kg/d、10.0 mg/kg/d和20.0 mg/kg/d。染毒60 d后，以脫頸臼法處死小鼠，采集睪丸組織。

1.1.3 試驗方法。使用天根Total RNA提取試劑盒提取各組小鼠睪丸組織Total RNA，具體操作按照試劑盒說明書進行。利用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢查；NanoPhotometerspectrophotometer檢測RNA純度(OD260/280 及 OD260/230 比值)；Qubit2.0 Fluorometer：RNA濃度精確定量；利用真核生物大部分mRNA都帶有polyA尾的結構特征，通過Oligo(dT)磁珠富集帶有polyA尾的mRNA進行文庫構建，開展Illumina HiSeq轉錄組測序分析。

2 試驗結果

2.1 Total RNA的提取與鑒定

對提取的總RNA進行瓊脂糖凝膠電泳的結果如圖1。結果顯示，每組提取出了18S和28SRNA。NanoPhotometer spectrophotometer檢測RNA純度(OD260/280及 OD260/230比值)。Qubit2.0 Fluorometer：RNA濃度精確定量結果如表1所示，均達到建立文庫標準。

圖1 各組DDV染毒小鼠睪丸Total RNA瓊脂糖凝膠電泳圖

表1 各組樣品的濃度及純度

2.2 高通量測序及數據分析

illunina高通量測序儀下機的數據通過測序錯誤率檢查、GC含量分布檢查及原始數據過濾，獲得后續分析使用clean reads的數據匯總如下：

對照組和三個染毒組的轉錄組測序數據的解讀分析結果顯示，低劑量染毒組有46個差異表達基因，其中表達上調的有29個基因，表達下調的有17個基因（見圖2）；中劑量染毒組有117個差異表達基因，其中表達上調的有36個基因，表達下調的有81個基因（見圖 3）；高劑量染毒組有 117個差異表達基因，其中表達上調的有36個基因，表達下調的有81個基因；3種劑量染毒組共有的差異表達基因有7個，并且這7個基因的表達量都下調 （見圖4）。共有的7個基因分別為：Gm14332、Gm6768、Ibs p、4930568A12R ik、Spin2g、RP23-328F4.6和Gm18849（見圖 5）。

圖2 低劑量染毒組與對照組間的差異表達基因維恩圖

圖3 中劑量染毒組與對照組間的差異表達基因維恩圖

圖4 高劑量染毒組與對照組間的差異表達基因維恩圖

圖5 三個染毒組與對照組相比較共有的差異表達基因

3 討論與小結

目前，關于有機磷農藥對雄性動物生殖影響的研究主要集中在生殖毒性作用方面。例如，葉勁松等人[7]用馬拉硫磷染毒雄性小鼠，證明一定劑量的馬拉硫磷可增高小鼠精子的畸形率。黃斌等人[15]證明，甲基對硫磷能夠阻滯大鼠生精細胞的細胞周期進程，誘導生精細胞凋亡。于燕等[16]用敵敵畏、樂果和馬拉硫磷混配后染毒雄性小鼠，結果顯示，睪丸及附睪發生明顯的病理學變化，各染毒組小鼠的精子活動率顯著降低，精子數量顯著減少，精子畸形率顯著增高。何軍山[17]、周好樂[18,19]等的研究均證明敵敵畏和敵百蟲可增加小鼠精子的畸形率，具有明顯的生殖毒性效應，但就有機磷農藥對雄性動物產生生殖毒性效應的分子機制仍不十分清楚。該試驗利用轉錄組測序技術 （RNA-seq）分析了有機磷農藥作用下雄性小鼠睪丸組織差異表達基因，以期為探索有機磷農藥引起雄性小鼠生殖毒性的分子機制打下基礎。

轉錄組是指在特定條件下細胞或組織中所有的mRNA的集合。轉錄組學能夠從整體水平上揭示特定生物學過程及疾病發生中的基因表達變化，從而了解其分子機制。RNA-Seq測序技術是指解讀細胞或組織內mRNA、miRNA序列，對RNA的表達量進行定量、發現新的轉錄本的一種技術。RNA-seq測序技術已經成為基因表達分析最為敏感的工具之一。

本試驗結果顯示，低劑量染毒組有46個差異表達基因，其中表達上調的有29個基因，表達下調的有17個基因；中劑量染毒組有117個差異表達基因，其中表達上調的有36個基因，表達下調的有81個基因；高劑量染毒組有117個差異表達基因，其中表達上調的有36個基因，表達下調的有81個基因；3種劑量染毒組共有的差異表達基因有7個，并且這7個基因的表達量都下調。共有的7個基因分別為：Gm14332、Gm6768、Ibsp、4930568A12Rik、Spin2g、RP23-328F4.6和 Gm18849。