生物膜構建密閉環境下大鼠新鮮創面愈合的實驗研究

尹成國，王業本，高廣輝，郝作斌，王大釗，王文德

（濟南市第三人民醫院 手外科，山東 濟南 250132）

皮膚再生技術是近年來醫學研究的熱點。國內外文獻報道[1-4]，保持環境濕潤可加速創面愈合速度，減少瘢痕形成；良好的敷料能維持創面內環境穩定，避免因頻繁更換敷料破壞再生上皮，影響創面愈合。本研究通過制備SD大鼠全層皮膚缺損模型，采用同體自身對照，比較創面在3 M透明敷貼構建的濕潤環境下與凡士林紗布形成的干燥環境下愈合特點，為臨床工作提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、材料與主要儀器

實驗動物：雄性SD大鼠40只，8～10周齡，體重210～250 g，購自山東大學實驗動物中心。動物生產許可證號：SCXK（魯）20130009，使用許可證號：SCXK（魯）20130001。動物自由飲食，飼養于標準動物房內。適應性喂養10 d后進行實驗。

使用材料：3 M透明敷貼（生物膜），由美國3 M公司生產；凡士林紗布，由華西衛材公司生產。

主要儀器：流式細胞計數儀 (Beckman Colter公司，美國)、熒光顯微鏡(Nikon，日本)。

1.2 動物分組與建模

建模：選取健康成年雄性SD大鼠40只，采用同體自身對照，水合氯醛腹腔內注射麻醉，按3 mL/kg的劑量給藥。使用電動剃刀剃毛備皮（大鼠背部），面積約7.0 cm×5.0 cm。常規消毒并鋪無菌單，選擇背中部脊柱兩側各旁開0.5 cm處制備直徑2.0 cm創面，深達皮下深筋膜層，壓迫止血（圖1）。

圖1 大鼠模型制作，脊柱兩側各制作直徑約2.0 cm全層皮膚缺損創面

模型建立后，右側創面應用3 M透明敷貼（觀察組）覆蓋并固定，左側創面以凡士林油紗覆蓋(對照組)并固定，清潔紗布包扎，次日開始每日換藥1次，每次換藥應用生理鹽水沖洗創面，創面覆蓋物不予清理，酒精消毒創面周圍皮膚。

術后第3、7、14天隨機選取10只大鼠，換藥時觀察創面大體情況，留取標本行HE染色，剩余10只大鼠每日換藥至創面完全上皮化（21d）。

1.3 創面大體觀察

創面愈合率：術后第7、14天換藥，創面表面用無菌透明薄膜覆蓋，根據印記記錄面積，再用計算機圖像分析儀測定其面積。計算創面愈合率=(原始創面面積-未愈合創面面積)／原始創面面積×100%。

記錄術后第3、7、14天創面組織水腫及出血情況，有無分泌物、創面與敷料有無粘連、創面有無結痂及創周有無紅腫；記錄大鼠創面最終愈合（創面完全上皮化）時間、愈合時皮膚色澤、彈性及瘢痕程度。

1.4 標本采集與檢測

標本采集：術后第7、14天換藥時分別于每只大鼠兩個創面中央取材，制做石蠟切片，HE染色。

標本檢測：觀察兩個時間節點大鼠兩組創面的病理組織愈合情況，根據改良病理組織學愈合標準給各組大鼠創面愈合情況評分[5]。

1.5 統計學方法

所有數據均采用SPSS 21.0軟件統計分析，計量資料采用平均值±標準差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 創面大體觀察

術后第3、7天換藥時觀察組創面無新鮮滲血，表面覆蓋凝膠樣物，與透明敷貼無粘連；對照組出現凡士林紗布與創面粘連、部分形成血痂，更換凡士林紗布時創面有新鮮滲血。術后第3天，各組未見明顯新鮮肉芽組織。術后第7天，觀察組創面濕潤，沒有感染跡象；對照組部分創面出現少量分泌物；觀察組創面肉芽組織及邊緣再生上皮均優于對照組。術后第14天，觀察組創面大部分上皮化；對照組創面縮小，上皮生長較觀察組慢。創面最終愈合時觀察組再生皮膚色澤、質地、平整度優于對照組。

2.2 測算創面面積及最終愈合時間

術后第7、14天觀察組愈合率高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。創面完全上皮化的最終時間觀察組明顯短于對照組，觀察組和對照組平均愈合時間為（16.70±1.60）d和 (18.50±1.36)d(P ＜0.05，表 1）

表1 兩組創面不同時間點愈合率及最終愈合時間比較（±s）

表1 兩組創面不同時間點愈合率及最終愈合時間比較（±s）

組別 創面愈合率（%） 愈合時間（d）第3天 第7天 第14天觀察組 4.50±0.69 31.61±3.20 85.34±2.38 16.70±1.60對照組 3.27±0.55 24.24±1.5475.15±1.59 18.50±1.36 t值 7.648 11.358 19.476-0.469 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.3 病理組織學觀察

第7天：兩組創面組織均無水腫，對照組仍可見少量出血；第14天：兩組均無出血及水腫，創面邊緣新生上皮明顯。根據創面表皮結構、真皮-表皮鄰接、膠原束、表皮再生及粒細胞浸潤情況，觀察組在第7天及14天時創面組織病理學評分均明顯高于對照組（表2）。創面完全上皮化時病理切片顯示：觀察組愈合好，鱗狀上皮完全修復，并且皮膚表面平整；對照組表皮愈合不良，鱗狀上皮高低不平（圖2）。

表2 兩組不同時間點創面組織病理學評分比較（±s）

表2 兩組不同時間點創面組織病理學評分比較（±s）

組別 第7天 第14天觀察組 11.42±1.60 19.41±1.17對照組 9.33±1.57 15.87±1.52 t值 5.106 10.140 P值 ＜0.05 ＜0.05

圖2 第7、14天生物膜組創面肉芽組織均生長旺盛，有豐富的毛細血管存在，周圍可見成纖維細胞和膠原纖維，創面周圍表皮細胞開始向傷口方向延伸蔓延。第21天兩組創面完全上皮化，其病理切片示：觀察組愈合好，鱗狀上皮完全修復，并且皮膚表面平整；對照組表皮愈合不良，鱗狀上皮高低不平（HE×100）

3 討論

創面愈合病理變化與皮膚屏障的損害密切相關，因此使用覆蓋物及時封閉創面成為創傷后治療的重要環節。傳統凡士林紗布等纖維性敷料可使傷口干燥，具備物理隔離功能；但創面滲出液容易結痂，創面與敷料粘連，換藥時形成新的創傷，不利于皮膚再生[6]。Winter通過動物實驗發現聚氨酯薄膜敷料密閉包扎可使創面愈合較快些，提出“濕潤傷口愈合”觀念，指出濕性環境可以促進上皮細胞的爬行，減少瘢痕形成[7-8]。1972年，Rovee等[9]研究發現，上皮細胞無法順利通過干燥結痂的細胞層，而是通過痂皮下的濕潤床緩慢游移，延緩上皮細胞愈合的時間；未結痂的潤濕傷口，其上皮細胞移行速度明顯快于結痂創面。2000年8月美國食品與藥品管理局(FDA)在新頒布的創面醫療用品（外用藥和敷料）的行業指南中特別強調，保持創面的濕潤環境是標準的處理方法[10]。良好的生物敷料能夠促進傷口愈合，主要體現在保持愈合環境濕潤、低氧或無氧微酸環境、酶學清創功能、疼痛減輕四方面[6]。3 M透明敷貼是一種生物半透膜，可以觀察傷口滲液情況，且撕除時不傷皮膚。對傷口提供保護環境，避免細菌、異物的侵入以及外界溫差變化或壓力所造成影響。其構建密閉環境有清創作用，幫助傷口滲液的酶分解壞死組織，保持傷口濕潤的微環境。

創面修復過程涉及新生血管及肉芽組織、再上皮化及膠原的產生等與諸多生長因子介導和參與密切相關[11]。李丹等[12]通過實驗驗證了人創面分泌液對表皮干細胞具有趨化作用，并通過表皮干細胞表達趨化因子介導完成對表皮干細胞的趨化效應。3 M透明敷貼構建的密閉環境能夠使滲出液保留于創面周圍，加速上皮再生；創面表面形成凝膠樣物，考慮其內富含富血小板血漿(PRP)，含有高濃度的血小板、白細胞和纖維蛋白，血小板激活后能釋放出多種生長因子，可促進細胞的增殖分化，促進軟組織修復。

前期臨床研究發現[13]，3 M透明敷貼治療無骨質外露指端軟組織缺損，中期肉芽組織可完全填充缺損，后期肉芽組織逐漸消退、平整，最終愈合皮膚無明顯瘢痕，可恢復大部分皮紋。干燥環境下創傷修復后期，肉芽組織逐漸向瘢痕組織演變，毛細血管、炎細胞逐漸減少，成纖維細胞逐漸成熟，轉變為肌成纖維細胞[14]。炎癥反應則是創面修復的始動環節，但過度的炎癥反應亦使創面持續惡化、壞死，最終導致組織修復不良[15]。成纖維細胞是創面愈合的主要功能細胞，創面形成后，成纖維細胞進入局部增殖、分化、合成和分泌膠原蛋白；若傷口內存有血腫、壞死組織、異物或細菌時，成纖維細胞的移行和新生血管的形成都將延遲[16]。因此要促進創面愈合，就必須為成纖維細胞發揮其活性功能和作用創造一個良好的環境。動物實驗研究表明[17]，創面在相對密閉、濕潤環境下能夠誘發釋放多種生長因子參與創面修復、調節創面肉芽組織中成纖維細胞及新生血管的分布，從而加速創面愈合，減少瘢痕形成。本研究結果顯示在創面愈合過程中肉芽組織生長速度觀察組明顯高于對照組，進一步證實3M透明敷貼構建密閉環境能促進血管生成，促進創面愈合。

本研究表明，3M透明敷貼構建密閉環境能有效保護創面凝膠樣物，并能誘發釋放多種生長因子參與創面修復，明顯縮短大鼠新鮮創面愈合時間，減少瘢痕形成，為臨床應用于指端或小面積皮膚缺損提供理論支持。而具體作用機制有待進一步研究和探討。