硫磺菌子實體活性成分對植物病原真菌抑菌的初步研究*

權(quán) 琳，劉曉鳳，梁 洪，何建清

（1.德陽科貿(mào)職業(yè)學(xué)院，四川 德陽 618000；2.民辦四川天一學(xué)院，四川 德陽 618000；3.西藏農(nóng)牧學(xué)院，西藏 林芝 860000）

硫磺菌[Laetiporμs sμlphμreμs（Fr.）Murrill]，別名硫色干酪菌、硫磺多孔菌，是一種藥食兼用的高等真菌，廣泛分布在西藏、河北、吉林及遼寧等地[1]。陳士瑜等[2]研究表明，硫磺菌子實體被火焚燒后，能夠?qū)ξ谩Ⅱ膀斓炔∠x有驅(qū)逐作用，有望用于天然驅(qū)蟲藥物開發(fā)。據(jù)報道，硫磺菌子實體所產(chǎn)生的齒孔酸（eburicoic acid）能合成甾體藥物，可以調(diào)節(jié)機體，增加抵抗力，子實體所產(chǎn)生的麥角甾醇也可以作為重要的醫(yī)藥化工原料[3]；此外，硫磺菌子實體中還含有甜菜堿（betaine）和胡蘆巴堿（trigonelline）等生物堿[4]。一些生物堿，如鯨蠟基甜菜堿對生物膜有消除作用且對變形鏈球菌有抑制作用[5]。甜菜堿可用于殺滅包括結(jié)核菌在內(nèi)的多種細菌，可作為殺菌消毒洗滌劑使用[6]。通過對硫磺菌子實體中抑菌活性進行研究，以期為其進一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum） 是對小麥生產(chǎn)危害較大的一種真菌性病害，會造成小麥減產(chǎn)10%～20%，嚴重時達80%～90%[7]，引起小麥籽粒腐敗變質(zhì)，嚴重危害人畜健康[8]。馬鈴薯干腐病菌（Fusarium coeruleum） 是一種世界性土傳病害，對全球馬鈴薯產(chǎn)業(yè)造成巨大危害，且防治較困難[9]，據(jù)報道，馬鈴薯病害逐年加重，嚴重影響馬鈴薯的產(chǎn)量和質(zhì)量，其中由鐮刀菌（Fusarium sp.）引起的干腐病更是制約馬鈴薯產(chǎn)業(yè)穩(wěn)步發(fā)展的頭號大敵，常造成6%～25%的減產(chǎn)，嚴重時減產(chǎn)60%以上[10]。目前，普遍使用的傳統(tǒng)化學(xué)合成抗菌藥大多毒性大，殘留高，對環(huán)境、動物和人類身體健康均有諸多不良影響，長期使用會破壞生態(tài)的多樣性以及糧食作物的安全性。隨著環(huán)保意識的增強和研究技術(shù)的發(fā)展，人們開始關(guān)注從天然資源中獲得更安全、更環(huán)保及更高效的抗菌劑。藥用真菌種類豐富，是產(chǎn)生新結(jié)構(gòu)與具有活性天然小分子化合物的重要生物類群，對其進行深入研究，進而發(fā)現(xiàn)更多具有抗感染作用的藥用真菌，探索真菌抗菌作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，作為生物抗菌劑進行研發(fā)和利用，具有重大意義[11]。

1 儀器與材料

1.1 儀器設(shè)備

試驗所用儀器設(shè)備見表1。

表1 儀器設(shè)備信息Tab.1 Information of instrument and equipment

1.2 試劑、培養(yǎng)基與材料

供試菌種：硫磺菌子實體，來自西藏農(nóng)牧學(xué)院真菌實驗室。

供試病原真菌：小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum） 和馬鈴薯干腐病菌（Fusarium coeruleum），來自西藏農(nóng)牧學(xué)院真菌實驗室。

其他試驗試劑見表2。

表2 試劑與材料Tab.2 Reagentsand materials

2 試驗方法

2.1 硫磺菌子實體生物堿類化合物提純制備

精密稱定硫磺菌子實體粉末（甜菜堿含量0.79%）5 g，置于250 mL燒杯中，加入蒸餾水100 mL。在水浴鍋上加熱至100℃，再加入堿性氧化鋁25 g攪拌均勻，過濾。取濾液于蒸發(fā)皿中，置水浴鍋上揮干溶劑。稱取堿性氧化鋁（100目～200目） 50 g填充柱層析，把蒸干后的化合物填充于堿性氧化鋁柱上層，然后用95%乙醇500 mL洗脫，收集洗脫液，于水浴鍋上揮干溶劑[12]，即得硫磺菌子實體提純后的生物堿類化合物（以下簡稱提取物A）。

2.2 提取物A對植物病原真菌抑菌活性試驗

參照參考文獻[8]，精密稱定1.26 g硫磺菌子實體提取物A，置于10 mL容量瓶中，加95%乙醇制成含提取物A濃度為1 mg·mL-1的備用溶液。用無菌的超濾膜過濾后，分別吸取適量加入無菌PDA培養(yǎng)基，制成含提取物A濃度分別為100 μg·mL-1和10 μg·mL-1的培養(yǎng)基。甜菜堿培養(yǎng)基（濃度分別為100 μg·mL-1和10 μg·mL-1）也按照上述方法制成，以空白培養(yǎng)基作對照（CK）。將培養(yǎng)基放置在通風(fēng)櫥中24 h，揮發(fā)去除95%乙醇溶劑，每個樣品設(shè)3個重復(fù)。用直徑為6 mm的打孔器打取生長整齊一致的2種病原真菌菌餅（小麥赤霉病菌和馬鈴薯干腐病菌），再將病原真菌菌餅移植到各處理培養(yǎng)基的中心。1個培養(yǎng)皿1個菌餅，使菌絲面向下接觸培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)3 d～5 d。根據(jù)菌落直徑平均值大小，計算出相應(yīng)的抑菌率（E，%），公式為：

式中：a為各處理培養(yǎng)基中菌落直徑（mm）；b為空白對照中菌落直徑（mm）。

2.3 提取物A與廣譜抗菌藥的抑菌作用比較

參照參考文獻[13]，取提取物A，加95%乙醇至溶解，再用無菌的超濾膜過濾，后用無菌PDA培養(yǎng)基制成梯度為 3.20 mg·mL-1、1.60 mg·mL-1、0.80 mg·mL-1、 0.40 mg·mL-1、 0.20 mg·mL-1、 0.10 mg·mL-1及0.05 mg·mL-1的供試培養(yǎng)基。百菌清與多菌靈為農(nóng)藥廣譜性殺菌劑，用無菌水分別稀釋經(jīng)精密稱定的98%多菌靈和75%百菌清，用無菌的超濾膜過濾。后加入無菌的PDA培養(yǎng)基，制成含98%多菌靈培養(yǎng)基濃度梯度為 15 μg·mL-1、10 μg·mL-1、5 μg·mL-1、3 μg·mL-1、1 μg·mL-1的培養(yǎng)基[13]和 75%百菌清培養(yǎng)基濃度梯度為20.00 mg·mL-1、10.00 mg·mL-1、5.00 mg·mL-1、2.50 mg·mL-1、1.25 mg·mL-1的培養(yǎng)基[15]，以空白培養(yǎng)基作對照（CK）。將培養(yǎng)基放置在通風(fēng)櫥中24 h，以揮發(fā)去除95%乙醇溶劑，每個樣品設(shè)3個重復(fù)。用直徑為6 mm的打孔器打取生長整齊一致的2種病原真菌菌餅（小麥赤霉病菌和馬鈴薯干腐病菌），再將病原真菌餅移植到各處理培養(yǎng)基中心。1個培養(yǎng)皿1個病原真菌菌餅，使菌絲面向下接觸培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)3 d～5 d。根據(jù)菌落直徑平均值大小，按照2.2中的公式計算出相應(yīng)的抑菌率（%）。

2.4 提取物A的抑菌作用

取2.2中培養(yǎng)3 d和7 d的供試病原真菌，同時使用純化的小麥赤霉病菌和馬鈴薯干腐病菌作為對照。在經(jīng)過滅菌后的載玻片上滴1滴蒸餾水，用無菌接種環(huán)挑取少量菌絲制成玻片，顯微鏡觀察并拍照。

2.5 數(shù)據(jù)分析與處理

采用Microsoft Excel 2016、SPSS 26軟件進行數(shù)據(jù)分析，Origin 2018軟件進行作圖。

3 結(jié)果與討論

3.1 結(jié)果分析

3.1.1 提取物A對植物病原真菌的抑菌活性

不同濃度提取物A對植物病原真菌表現(xiàn)出不同程度的抑菌作用，抑菌效果見圖1、表3。

表3 不同濃度提取物A和甜菜堿對2種植物病原菌的抑制率Tab.3 Inhibition ratio of different concentrations of extract A and betaine on two plant pathogens

圖1 提取物A對2種植物病原菌的抑制效果Fig.1 Inhibition effect of extract A on two plant pathogens

如圖1、表3所示，提取物A和甜菜堿對小麥赤霉病菌和馬鈴薯干腐病菌均有一定的抑制效果。當(dāng)提取物A濃度為100 μg·mL-1時，其對小麥赤霉病菌和馬鈴薯干腐病菌的抑制率分別是47.27%和43.48%；甜菜堿濃度為100 μg·mL-1時，其對小麥赤霉病菌和馬鈴薯干腐病菌的抑制率分別是34.66%和29.54%。隨著濃度的下降，抑菌率也下降，濃度與抑菌率呈正相關(guān)性，由抑菌率可知，提取物A的抑菌效果較甜菜堿好。

3.1.2 提取物A與廣譜抗菌藥的抑菌比較

7種濃度的提取物A對小麥赤霉病菌及馬鈴薯干腐病菌的抑制作用情況見圖2、表4。

圖2 提取物A不同濃度對小麥赤霉病菌和馬鈴薯干腐病菌的抑制情況Fig.2 Inhibition effect of different concentrations of extract A on Fusarium gramineaanum and Fusarium coeruleum

表4 不同濃度提取物A對小麥赤霉病菌和馬鈴薯干腐病菌的抑制作用Tab.4 The inhibitory effect of carbendazim on Fusarium gramineaanum and Fusarium coeruleum

如圖2、表4所示，與空白培養(yǎng)基CK相比，提取物A對病原真菌的抑制作用具有顯著性差異（P<0.05）。各濃度下提取物A均具有抑制小麥赤霉病菌的作用，其中濃度為1.6 mg·mL-1時對小麥赤霉病菌的抑制效果最佳，其抑菌率為88.42%。提取物A濃度為1.6 mg·mL-1時抑菌率大于濃度為3.2 mg·mL-1時抑菌率，而濃度小于1.6 mg·mL-1時，其抑菌率呈量效關(guān)系，證明1.6 mg·mL-1為其最大的抑菌濃度。各濃度提取物A均具有抑制馬鈴薯干腐病菌的作用，其中A濃度為3.2 mg·mL-1時對馬鈴薯干腐病菌抑制效果最佳，其抑菌率為86.46%，與其他濃度及CK的處理具有顯著性差異（P<0.05），與濃度為1.6 mg·mL-1的處理無顯著性差異 （P＞0.05）。

綜上所述，小麥赤霉病菌和馬鈴薯干腐病菌對提取物A比較敏感，與CK相比抑菌效果明顯。提取物 A 為 0.8 mg·mL-1、1.6 mg·mL-1及 3.2 mg·mL-1對小麥赤霉病菌的抑菌效果較理想，其抑菌率分別是88.16%、88.42%及88.35%。但當(dāng)提取物A濃度為 1.6 mg·mL-1與 3.2 mg·mL-1時，2 種濃度處理下的抑菌率無顯著性差異（P＞0.05）。試驗結(jié)果表明，硫磺菌子實體對供試的小麥赤霉病菌最大抑菌率為88.42%。提取物 A 濃度為 0.8 mg·mL-1、1.6 mg·mL-1及3.2 mg·mL-1對馬鈴薯干腐病菌的抑菌效果較理想，其抑菌率分別是86.23%、86.35%及86.46%。但提取物A為1.6 mg·mL-1與3.2 mg·mL-1時，對馬鈴薯干腐病的抑菌率無明顯增加，且2種濃度處理下的抑菌率無顯著性差異（P＞0.05）。試驗結(jié)果表明，硫磺菌子實體對供試的馬鈴薯干腐病最大抑菌率為86.46%。從抑菌率表明，2種植物病原菌對提取物A表現(xiàn)出不同的敏感性，進而表現(xiàn)出不同的抑菌效果：小麥赤霉病菌>馬鈴薯干腐病菌。

5種不同濃度的多菌靈對小麥赤霉病菌和馬鈴薯干腐病菌的抑制作用情況見圖3、表5。

如圖3所示，5種不同濃度的多菌靈對小麥赤霉病菌和馬鈴薯干腐病菌的抑制作用情況不同，與未接多菌靈的空白培養(yǎng)基CK的抑菌率相比具有顯著性差異（P<0.05）。不同濃度的多菌靈對小麥赤霉病菌均有抑菌作用，其中在多菌靈濃度為15 μg·mL-1、10 μg·mL-1及 5 μg·mL-1處理下對小麥赤霉病菌的抑制率較好，抑菌率均為100%。并且與3 μg·mL-1、1 μg·mL-1及 CK的處理相比較具有顯著性差異（P<0.05）。如表5所示，不同濃度的多菌靈對馬鈴薯干腐病菌均有抑菌作用，其中在濃度為15 μg·mL-1處理下對馬鈴薯干腐病菌抑制率最佳，抑菌率為100%，與其他濃度及CK相比具有顯著性差異（P<0.05）。

圖3 不同濃度的多菌靈對小麥赤霉病菌和馬鈴薯干腐病菌的抑菌效果Fig.3 The inhibitory effect of carbendazim on Fusarium gramineaanum and Fusarium coeruleum

表5 多菌靈對小麥赤霉病菌和馬鈴薯干腐病菌的抑制作用Tab.5 The inhibitory effect of carbendazim on Fusarium gramineaanum and Fusarium coeruleum

綜上所述，采用98%多菌靈作為抑菌對照試驗組，2種植物病原菌中，多菌靈對小麥赤霉病菌表現(xiàn)出明顯的抑制作用的濃度為5 μg·mL-1，對馬鈴薯干腐病菌的抑制作用的濃度為15 μg·mL-1。多菌靈為15 μg·mL-1，對2種植物病原真菌的抑菌率相同；濃度小于15 μg·mL-1時，其抑菌率大小為小麥赤霉病菌>馬鈴薯干腐病菌，抑菌作用和質(zhì)量濃度變化呈正相關(guān)性，隨著藥物濃度減小，抑制效果明顯減小。

5種不同濃度的百菌清對小麥赤霉病菌和馬鈴薯干腐病菌的抑制作用見圖4、表6。

圖4 不同濃度的百菌清對小麥赤霉病菌和馬鈴薯干腐病菌的抑菌效果Fig.4 The antimicrobial antimicrobial acivity of different concentrations of chlorothalonil on Fusarium gramineaanum and Fusarium coeruleum

如圖4所示，5種不同濃度的百菌清對小麥赤霉病菌和馬鈴薯干腐病菌的抑制作用與空白培養(yǎng)基CK相比具有顯著性差異（P<0.05）。如表6所示，不同濃度的百菌清對小麥赤霉病菌均有抑菌作用，其中百菌清濃度為20 mg·mL-1的處理對小麥赤霉病菌的抑制率最佳，抑菌率為100%，且與其他濃度相比具有顯著性差異（P<0.05）。如表6所示，不同濃度的百菌清對馬鈴薯干腐病菌均有抑菌作用，其中在百菌清濃度為20 mg·mL-1處理下對馬鈴薯干腐病菌抑制率最佳，抑菌率為100%，且與其他濃度及CK相比具有顯著性差異（P<0.05）。綜上所述，百菌清對馬鈴薯干腐病菌和小麥赤霉病菌現(xiàn)出明顯抑制作用的MIC值為20 μg·mL-1，對小麥赤霉病菌的抑制作用減弱。其抑菌率，馬鈴薯干腐病菌>小麥赤霉病菌，抑菌作用和質(zhì)量濃度變呈正相關(guān)性，隨著藥物濃度減小，抑制效果明顯減小。

3.1.3 3種藥物對同種植物病原菌的抑制能力

廣譜抗菌藥和硫磺菌提取物對2種植物病原菌的抑制效果見圖5、圖6。

圖5 各處理對小麥赤霉病菌的抑制效果Tab.5 The inhibitory effect of different treatments on Fusarium gramineaanum

圖6 各處理對馬鈴薯干腐病菌的抑制效果Fig.6 The inhibitory effect of different treatments on Fusarium coeruleum

如圖5、圖6所示，提取物A與其他2種藥物對2種供試菌種都有明顯的抑菌效果。對于小麥赤霉病菌，多菌靈的抑菌能力強于提取物A和百菌清；而對于馬鈴薯干腐病菌，百菌清抑菌能力強于多菌靈與提取物A的抑菌能力。

3.1.4 顯微觀察提取物A的抑菌作用

試驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過處理的供試品小麥赤霉病菌在培養(yǎng)3 d后菌絲變細萎縮、產(chǎn)生畸形及顏色變淺等現(xiàn)象，而小麥赤霉病菌CK則未有此類現(xiàn)象發(fā)生；經(jīng)過處理的供試品馬鈴薯干腐病菌在培養(yǎng)3 d后菌絲體出現(xiàn)菌落生長畸形和菌絲生長量變少，菌絲形態(tài)和結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，而馬鈴薯干腐病菌CK則未有此類現(xiàn)象發(fā)生。顯微觀察培養(yǎng)7 d后，提取物A對2種植物病原菌的抑制作用，結(jié)果見圖7。

圖7 培養(yǎng)7 d后提取物A對小麥赤霉病菌和馬鈴薯干腐病的抑菌作用的顯微鏡觀察圖Fig.7 Microscopic observation of the antimicrobial activity of extract A on Fusarium gramineaanum and Fusarium coeruleum cultured for 7 days

如圖7所示，經(jīng)過處理的供試品小麥赤霉病菌在培養(yǎng)7 d后分生孢子出現(xiàn)明顯的膨大及畸形，導(dǎo)致芽管腫脹和扭曲菌等現(xiàn)象，而小麥赤霉病菌CK則未有此類現(xiàn)象發(fā)生；經(jīng)過處理的供試品馬鈴薯干腐病菌在培養(yǎng)7 d后孢子萌發(fā)量減少，菌絲出現(xiàn)變小、變短或斷裂及畸形等現(xiàn)象，而病原菌CK則未有此類現(xiàn)象發(fā)生。

3.2 討論

近年來，用生物抗菌劑以替代或部分替代化學(xué)殺菌劑的研究越來越受到重視，王娟等[16]研究表明，硫磺菌菌絲體發(fā)酵液的乙酸乙酯萃取物濃度為50 mg·mL-1，對小麥赤霉、辣椒疫霉及黃瓜炭疽病菌均顯示出較強的抑菌效果，對甘薯黑斑、煙草赤星、蘋果腐爛及小麥腐病菌具有較強的抑菌效果。本試驗結(jié)果表明，小麥赤霉病菌和馬鈴薯干腐病菌對提取物A比較敏感，當(dāng)提取物A濃度為0.8 mg·mL-1、1.6 mg·mL-1及 3.2 mg·mL-1時對小麥赤霉病菌的抑菌率分別是88.16%、88.42%及88.35%；硫磺菌子實體對供試的馬鈴薯干腐病最大抑菌率為86.46%。表明2種植物病原菌對硫磺菌子實體粗提取物表現(xiàn)出不同的敏感性，進而表現(xiàn)出不同的抑菌效果，即對小麥赤霉病菌的抑菌效果優(yōu)于對馬鈴薯干腐病菌的抑菌效果。研究結(jié)果表明以甜菜堿為代表的生物堿類成分為硫磺菌子實體活性物質(zhì)之一，為其生物抗菌劑的開發(fā)提供了參考。

人們長期使用多菌靈類及百菌清類殺菌劑，導(dǎo)致我國多數(shù)地區(qū)的小麥赤霉病菌對此類殺菌劑已經(jīng)逐漸產(chǎn)生抗藥性[17-18]，最主要原因是此類殺菌劑與病原菌的親和性正在逐漸下降[9]。再者，多菌靈有低毒，殘留高，對人類皮膚和眼睛有刺激，口服中毒會出現(xiàn)頭昏、惡心及嘔吐等現(xiàn)象[19]；百菌清對生態(tài)環(huán)境破壞嚴重，殘留高，更會對人體造成致癌的風(fēng)險，WHO在2017年10月27日發(fā)布的《致癌物清單》中，百菌清名列2B類致癌物。現(xiàn)代農(nóng)業(yè)上迫切需要一種具有高效、長效、廣譜、穩(wěn)定、無毒及對生態(tài)環(huán)境無污染的生物抗菌劑，本研究結(jié)果表明，提取物A對小麥赤霉病菌和馬鈴薯干腐病菌均有明顯的抑制效果。雖然對小麥赤霉病菌及馬鈴薯干腐病菌的抑制能力低于多菌靈和百菌清，但其來自于天然成分，可以避免長期使用多菌靈和百菌清引起的弊端，值得進一步開發(fā)研究。

研究結(jié)果表明提取物A對2種植物病原真菌的抑菌作用優(yōu)于甜菜堿，說明以甜菜堿為代表的生物堿類成分為硫磺菌子實體活性物質(zhì)之一，下一步應(yīng)對其他的活性成分進一步研究。