耐高溫靈芝菌株的選育*

劉月芹，羅麗媛，劉歡瑞，賀曉龍

（延安大學生命科學學院，陜西 延安 716000）

靈芝（Ganoderma lucidum Karst）是一種主要分布于我國東部和南部的腐生真菌，具有較高的營養、保健和醫療價值[1]。靈芝富含糖類（還原糖和多糖）、三萜類、黃酮類、多肽及生物堿等多種活性成分[2]，具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、補氣安神、止咳平喘、延年益壽的功效，被廣泛應用于人類各種疾病的預防和治療中[3-6]。

根據食用菌對溫度的要求，可分為低溫型（18℃～21℃），中溫型 （22℃～28℃） 和高溫型（28℃～32℃） 3種類型[7]。靈芝屬高溫型菌類，菌絲體最適生長溫度為25℃～30℃[7]。然而，近年我國中南部的大部分省市的夏季溫度普遍在35℃～38℃，人工培養靈芝控溫成本較高且污染較大，導致目前市場上靈芝產品的生產成本高，若能選育出耐高溫的靈芝菌種并投入生產，則可使靈芝這一寶貴資源得到更高效的利用，使靈芝產品的市場前景更加廣闊。

微生物菌種的選育方法包括誘變育種、雜交育種、原生質體融合技術、基因工程育種等[8-12]。在這些菌種選育的方法中，原生質體紫外誘變育種是目前實驗室以及生產單位中最常用的菌種選育方法[13-16]，同時食用菌原生質體制備與再生技術已經相對成熟，為本試驗順利開展奠定了良好的基礎[17-18]。

利用原生質體紫外誘變的方法，對誘變后的靈芝菌株進行培養。通過考察靈芝菌絲體生長狀態和生長速度，經過初篩和復篩選育出能在37℃高溫下生長良好的誘變菌株，對實現靈芝的高溫栽培、高溫發酵生產天然產物和其他耐高溫菌株的選育提供了一定參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

1.1.1 菌株

靈芝菌株（Ganoderma lucidum CGMCC 5.616），購買于中國普通微生物菌種保藏管理中心（菌株的最適培養溫度為28℃），保存于4℃冰箱PDA斜面培養基。

甘露醇、溶壁酶，上海生工生物工程有限公司；葡萄糖、酵母浸粉、麥芽糖，天津科密歐化學試劑有限公司。

1.1.3 儀器設備

VS-1300U超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；DW-86L388超低溫冰箱，青島海爾特種電器有限公司；BPG-9156A恒溫干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；DHP-9902恒溫培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；UV-1200紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；ZQZY-BG組合式光照振蕩培養箱，上海知楚儀器有限公司；5424高速冷凍離心機，德國艾本德股份公司。

1.1.4 培養基

PDA液體培養基：土豆（去皮）200 g，在水中煮至土豆將熟，加入葡萄糖20 g，再加水至總體積1 000 mL，pH自然。

PDA固體培養基：液體培養基配方中加入瓊脂20 g，加水至總體積1 000 mL，pH自然。

由式(4)和(5)計算MPRM電路的動態功耗和靜態功耗，需計算邏輯門gk的信號概率Pr(gk)和Pk,v.為兼顧信號概率計算的時間效率以及準確性，在計算信號概率時，對MPRM電路中不存在相關性的信號采用簡單信號概率計算法，對存在相關性的信號則采用概率表達式法.

麥芽糖酵母膏葡萄糖（maltose yeast extract glucose，MYG） 再生培養基：麥芽糖10 g、葡萄糖4 g、酵母浸粉5 g，溶于0.6 mol·L-1甘露醇溶液中，至總體積1 000 mL，pH為7.2。

MYG固體培養基：MYG液體再生培養基中加入瓊脂20 g，溶于0.6 mol·L-1甘露醇溶液中，至總體積1 000 mL，pH為7.4。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化及液體培養

取保存于4℃冰箱的靈芝菌株，在無菌環境下接種于試管斜面PDA培養基上，28℃恒溫培養箱中培養7 d～10 d，至菌絲密集生長即活化完成。

取活化后的靈芝菌種試管，在無菌環境下將約5 mm2大小的菌種塊，接種于盛有45 mL PDA液體培養基的100 mL三角瓶中，28℃下靜止培養1 d后于260 r·min-1震動培養2 h后，將轉速調節為180 r·min-1，溫度不變，繼續培養5 d后備用。

1.2.2 原生質體制備與再生

用滅過菌的4層紗布過濾培養好的菌絲，無菌水洗滌2次～3次，用無菌吸水紙吸干菌絲水分，將其置于酶液中（0.24 g溶壁酶溶解于12 mL的0.6 mol·L-1甘露醇溶液中，經0.22 μm細菌過濾膜過濾除菌），輕微震蕩，置于32℃、80 r·min-1的搖床中震蕩酶解3 h。用砂芯漏斗過濾除去酶解液中殘留的菌絲，收集濾液，使用高速冷凍離心機在4℃、4 000 r·min-1條件下離心10 min，棄上清液，沉淀用0.6 mol·L-1甘露醇溶液洗滌2次，在顯微鏡下觀察去壁成功后，得到純化的原生質體[17]。使用血球計數板對純化的原生質體進行計數，稀釋濃度約為1×106個/mL，吸取100 μL涂布于MYG固體再生培養基中黑暗培養12 d后，統計原生質體的再生率[14]。

1.2.3 原生質體紫外誘變

在再生率滿足試驗要求的情況下（>0.5%）[18]，按上述方法制備原生質體，分別取3 mL稀釋的原生質體懸液置于無菌培養皿內，每3個培養皿一組，在黑暗條件下，用功率為10 W的紫外燈距離20 cm分別照射 0、10 s、20 s、30 s、40 s、50 s、60 s、70 s。取100 μL誘變后的原生質體用涂布棒涂布于MYG再生培養基中，黑暗中培養7 d～14 d后，在顯微鏡下觀察再生菌落是否為白色的圓點狀并記錄，統計不同照射時間下的靈芝原生質體致死率[13，19]。5次重復試驗后，取平均值繪制致死曲線。

1.2.4 初篩標準的確立

確立初步篩選的標準：將出發菌株（G.lucidum CGMCC 5.616母種）接種于PDA固體培養皿中，培養3 d后用筆劃出靈芝菌絲的生長范圍，后置于高溫（49℃、50℃、51℃、52℃、53℃） 培養箱中分別培養2 h，每個溫度下設5個平行，共25個培養皿。將熱激后的培養皿轉移到28℃培養箱中繼續培養，每天觀察菌絲在熱激處理后菌絲恢復生長的情況，確定出發菌株的對高溫的臨界溫度，并將該溫度下熱激2 h是否能恢復生長作為耐高溫誘變菌株的初篩標準。

1.2.5 耐高溫誘變菌株篩選

對經紫外誘變后出發菌株的再生菌株用接種鋤截取5 mm2大小帶有白色圓點狀的菌絲塊進行分離純化，然后隨機挑取35個誘變菌株和出發菌株分別接種于平板培養皿中，培養5 d后，分別在初篩確立的臨界溫度培養箱中熱激2 h后，同時重新置于28℃恒溫培養箱中進行恢復培養，黑暗條件下培養13 d后開始觀察，每3天觀察1次，篩選比出發菌株恢復生長快，且與出發菌株對峙培養出現拮抗反應的誘變菌株即為耐高溫誘變菌株[14]。

1.2.6 誘變菌株生長速度試驗

將出發菌株與挑選出的35個誘變菌株分別接種于PDA斜面試管中，每個菌株接種6支試管，28℃恒溫培養，待菌絲長出后劃線開始觀察，每個菌株分別抽取劃線后的6支試管中的3支試管繼續在28℃培養5 d，劃線測量菌絲生長長度，計算菌株在28℃時的生長速度，即恒溫生長速度；將另外3支試管置于37℃（根據試驗目的要選育出能在35℃～38℃高溫下生長良好的耐高溫菌株而自行設置的溫度）培養5 d，劃線測量菌絲長度，計算菌株在高溫下的生長速度，即高溫生長速度；再將高溫下生長的菌株重新置于28℃下培養5 d，劃線測量其生長長度，計算生長速度，即恢復生長速度。菌絲生長速率（V，mm·d-1）的計算公式為：

式中：S為菌絲長度（mm）；D為菌絲生長天數（d）。

1.2.7 數據分析

采用Origin 8.5進行方差分析（P<0.05顯著性差異；P<0.01極顯著性差異）。

2 結果與分析

2.1 原生質體的制備與再生

本試驗原生質體的獲得是在溶壁酶濃度為2%，酶解溫度為32℃，酶解時間3 h的條件下制備，在此條件下，制得的原生質體數量可達到1.36×106個/mL，原生質體的再生率為1.28%，原生質體的數量和質量能夠滿足本試驗所需。

2.2 紫外誘變時間的確定

用紫外線燈將出發菌株的原生質體懸液進行不同時間梯度 （0、10 s、20 s、30 s、40 s、50 s、60 s、70 s）的照射處理，根據原生質體的再生情況制作紫外誘變效應曲線見圖1。

圖1 紫外誘變效應曲線Fig.1 The effect curve of UV mutagenesis

由圖1可以看出，菌株在0～30 s致死率升高較快，照射時間為60 s后致死率達到95%。在進行紫外誘變的過程中，一般認為致死率70%左右時，菌株突變的效果最好[14]。因此，為了獲得較高的正突變率，選擇誘變時間為30 s的誘變菌株進行試驗。

2.3 初步篩選標準的確立

以出發菌株為試驗材料進行耐熱性試驗，結果顯示經過52℃高溫刺激2 h后，出發菌株的菌絲無法恢復生長；經過51℃高溫刺激后，出發菌株的菌絲萎縮明顯，13 d后恢復生長，菌絲生長稀疏，速度緩慢。由此確定出發菌株的恢復生長的臨界溫度為51℃。將51℃熱激2 h后恢復生長所篩選出的菌株為耐高溫誘變菌株。

2.4 耐高溫菌株的獲得

高溫會導致菌絲生長緩慢，甚至停止生長或死亡[20]。通過對誘變菌株進行51℃熱激2 h耐高溫復篩試驗后，最終獲得耐高溫誘變菌株10株，根據初篩標準確立時的試驗結果，從第13天開始測量菌絲生長長度和觀察菌絲長勢。其菌絲恢復生長情況見表1。

由表1可知，經過誘變后，60%菌株的生長情況比出發菌株好，40%誘變菌株的菌絲生長速度低于出發菌株。其中生長較好的10株耐高溫菌株為Y1、Y3、Y4、Y8、Y11、Y17、Y20、Y28、Y30 和Y35。Y1菌株在修復生長的第13天、第16天和第19天，其生長速度比出發菌種分別提高了33.56%、32.91%和31.77%，差異顯著（P<0.05）。Y30菌株第19天的生長速度與出發菌種相比差異不顯著，但第13天、第16天的生長速度比出發菌株分別提高了41.09%，30.74%且差異顯著（P<0.05）。從結果可以看出，通過原生質體紫外誘變的方法可有效篩選出耐高溫靈芝誘變菌株。

表1 高溫熱激后菌絲修復生長情況Tab.1 The mycelial recovery growth after high temperature heat shock

2.5 誘變菌株菌絲生長速度

為進一步驗證初篩的10株耐高溫誘變菌株的耐溫情況，將各誘變菌株在28℃、37℃及經歷37℃高溫脅迫后重新置于28℃下的生長速度分別記為恒溫生長速度、高溫生長速度和恢復生長速度，其統計結果見表2。

表2 誘變菌株菌絲生長速度試驗Tab.2 The test of mycelium growth rate of mutagenic strains

如表2所示，28℃恒溫生長條件下，出發菌株和誘變菌株的生長速度并無差異。但37℃高溫下，誘變菌株的生長速度均高于出發菌株。尤其菌株Y1和Y30，其生長速度比出發菌株分別提高了64.02%、60.83%，差異顯著（P<0.05）。28℃下菌株Y1、Y30、Y8和Y35的修復生長速度比出發菌株分別提高了42.72%、38.26%、38.02%和34.74%，且差異顯著（P<0.05）。其他誘變菌株的恢復生長速度雖然與出發菌株相比并無差異，但均高于出發菌株。這表示高溫對靈芝菌絲的生長速度有明顯的抑制作用，但耐高溫誘變菌株確實有較強且穩定的耐高溫能力。

3 討論與結論

利用耐高溫菌株可以實現菌株的高溫發酵，該方式可以減少污染，縮短生產周期，提高次生代謝產物的產量，節能降耗，大幅度降低菌種生產成本。目前，大型真菌的大部分研究均為利用紫外誘變的方法以獲得目的菌株[21-22]。通過紫外誘變選育耐高溫菌株是一種簡便可行的方法，紫外誘變原生質體成功的關鍵是紫外照射條件的選擇，由于紫外照射下原生質體突變的方向不確定，試驗中需要對耐高溫菌株進行篩選。為了獲得更有使用價值和利于生產的菌株，采用紫外照射致死率在70%～80%時的照射條件，在本試驗中經過多次反復處理，選擇了照射時間30 s，致死率為72%的照射條件。在食用菌誘變菌株的篩選中，由于育種目的不同，誘變菌株的篩選方法也不盡相同。如以提高產物為目的篩選菌株，主要依靠產物的物理和化學性質，如通過觀察瓊脂培養基上的抑菌圈、透明圈及水解圈等；以對環境高耐受性為目的篩選菌株，可以利用相應的選擇培養基[14，23-24]。本試驗通過建立耐高溫菌株51℃下熱激2 h的初篩標準，共獲得耐高溫靈芝菌株10株，并通過進一步的高溫試驗，驗證了這10株耐高溫菌株在37℃下有較好的生長活性，其中菌株Y1和Y30的耐高溫性能尤為顯著。試驗篩選出的耐高溫靈芝誘變菌株不僅為靈芝的基礎研究及其他耐高溫菌株的選育提供了一定的參考價值，還為實現靈芝的高溫栽培、高溫發酵生產天然產物提供了技術支持和理論依據。