LncRNA-NBAT1通過miR-21調控PTEN增強胃癌細胞對熱療敏感性的研究

張國平，李建鴻，陳小龍，趙利平，康 寧，沛 雲，葉 青，賴淑貞（通訊作者）

（1粵北人民醫院腫瘤內科 廣東 韶關 512026）

（2粵北人民醫院放療科 廣東 韶關 512026）

我國胃癌新發病例和死亡病例在全球分別占比為42.6%和45.0%，因此對于胃癌的預防和治療已迫在眉睫[1]。針對胃癌患者，除了常規的化療手段，近幾年還出現了熱療這一手段，并取得了一定的成效，但是胃癌細胞對于熱療敏感性降低，逐漸使之成為瓶頸。PTEN是現今發現的重要抑癌基因，可有效抑制胃癌細胞增殖，是胃癌的潛在治療靶點，但其上游調控通路尚未明確。長鏈非編碼RNA（LncRNA）是一類長度大于200 nt,并且沒有蛋白編碼功能的RNA[2]。研究發現lncRNA在腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移、物質代謝和血管形成等方面發揮重要作用[3]。LncRNA NBAT1是一個重要的“抑癌基因”，可以與微小RNA-21（miR-21）發生物理作用，然后抑制其表達，同時也可以調控miR-21靶向的下游基因抑制骨肉瘤細胞的增殖。因此，我們探索LncRNA-NBAT1通過miR-21能否調控PTEN增強胃癌細胞對熱療敏感性。

1.實驗方法

1.1 表達miR-21的慢病毒制備

將2.2 μg PCMV-dr8.9dvpr520（上海鈺博生物科技公司）、1.1 μg PCMV-dr8.9dvpr521、1.5 μg PCDH-EF1-MCS-miR21-T2A-His質粒（上海鈺博生物科技公司）加入1 mLPBS中，加入10 μL DNA transfection試劑（上海生工公司），混勻后，室溫靜置10 min，加入293T細胞，4 h后換液，并于24、48、72 h分別收集上清，上清即為病毒液，4 ℃保存備用。

1.2 穩定表達miR-21的MGC-803細胞株建立

將上述制備的病毒液，取10 mL感染MGC-803胃癌細胞（南京模式動物研究所），控制密度約60%，于24 h和48 h后再次感染，72 h后換正常培養液培養。

1.3 Western bolt技術鑒定穩定表達miR-21的MGC-803細胞株

待培養狀態穩定后收取細胞，提取蛋白，通過Western bolt技術檢測His的表達以鑒定穩定表達miR-21的MGC-803細胞株是否構建成功。

1.4 Western bolt技術檢測對照組和實驗組PTEN蛋白以及凋亡指標Caspase3的表達

待穩定表達miR-21的MGC-803細胞株構建成功后，將1 μg的pcDNA3.1-Vector質粒和1 μg的pcDNA3.1-LncRNA-NBAT1質粒瞬時轉染進入穩定表達miR-21的MGC-803細胞株，分別設置為對照組和實驗組，4 h后更換培養液，轉染24 h后，置于42℃，1 h培養，待結束后，收取細胞，提取蛋白，通過Western bolt技術檢測PTEN蛋白以及凋亡指標Caspase3的表達。

1.5 CCK8技術檢測對照組和實驗組細胞增殖情況

以合適密度將穩定表達miR-21的MGC-803細胞株接種至96孔板，共6孔，設置為對照組和實驗組，分別轉染50 ng的pcDNA3.1-Vector質粒和50 ng的pcDNA3.1-LncRNA-NBAT1質粒，4 h后更換培養液，轉染24 h后，置于42℃，1 h培養，轉染48 h后，加入CCK-8試劑，酶標儀檢測450 nm處各組吸光度，用以表示實驗組和對照組細胞增殖情況。

1.6 統計學方法

采用SPSS 16.0軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗；計數資料以率[n（%）]表示，采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2.結果

2.1 穩定表達miR-21的MGC-803細胞株成功建立

通過Western bolt技術對野生型MGC-803以及經過慢病毒感染的miR-21的MGC-803細胞株的His蛋白進行檢測。結果發現，野生型MGC-803的His表達量為（0.002±0.001），經過慢病毒感染的miR-21的MGC-803細胞株的His表達量為（5.328±0.103），差異有統計學意義（P＜0.05）,如表1。因此穩定表達miR-21的MGC-803細胞株成功建立，如圖1。

表1 穩定表達miR-21的MGC-803細胞株成功建立（±s）

表1 穩定表達miR-21的MGC-803細胞株成功建立（±s）

組別 相對表達量野生型MGC-803-His 0.002±0.001穩定表達miR-21的MGC-803-His 5.328±0.103 t 32.87 P 0.000

圖1 穩定表達miR-21的MGC-803細胞株成功建立

2.2 PTEN蛋白以及凋亡指標Caspase3的表達

待熱療42℃，1 h結束后，收取細胞，提取蛋白，通過Western bolt技術對對照組和實驗組的PTEN蛋白以及凋亡指標Caspase3蛋白檢測。結果發現，經過熱療后，實驗組、對照組的PTEN蛋白表達量分別為（5.520±0.124）、（3.208±0.260），差異有統計學意義（P＜0.05）。經過熱療后，實驗組Caspase3蛋白表達量（5.034±0.306）高于對照組的（2.045±0.024），差異有統計學意義（P＜0.05），如表2。因此，經過熱療處理，PTEN蛋白及Caspase3蛋白表達上調。如圖2。

表2 PTEN蛋白以及凋亡指標Caspase3的表達（±s）

組別 PTEN相對表達量 Caspase3相對表達量實驗組 5.520±0.124 5.034±0.306對照組 3.208±0.260 2.045±0.024 t 7.78 9.34 P 0.009 0.005

2.3 細胞增殖情況

待熱療42℃，1 h結束后分析細胞增殖情況。結果發現，實驗組較對照組整體吸光度較低，說明細胞增殖減慢，如表3。

表3 細胞增殖情況

3.討論

熱療手段對胃癌的治療有著很大的前景。LncRNA NBAT1通過各種通路對多種類型癌癥都有一定的抑制作用，包括乳腺癌，膀胱癌，胃癌等，因此我們認為它有可能通過多種的通路可以增強胃癌細胞對熱療的敏感性。而miR21可以通過調控多種下游靶基因影響腫瘤的發生發展[4]。PTEN作為一個傳統的抑癌基因，可以通過PI3K/AKT通路，調控包括結直腸癌，乳腺癌，胃癌等多種癌癥的發生發展；現今研究發現，miR21/PTEN通路可以影響大腸癌的發生發展，抑制大腸癌細胞進一步增殖[5]。

因此我們預測，在熱療基礎上，LncRNA NBAT1能夠通過miR21調控PTEN增強胃癌細胞的敏感性。結果發現，轉染pcDNA3.1-LncRNA-NBAT1質粒的穩定表達miR-21的MGC-803細胞株較轉染pcDNA3.1-Vector的穩定表達miR-21的MGC-803細胞株的PTEN蛋白表達上調，抑制腫瘤細胞進展；凋亡指標Caspase3上調，促進細胞凋亡；細胞吸光度降低，細胞增殖速度減慢。這說明miR21/PTEN通路對于胃癌細胞的增殖及對熱療的敏感性有著一定的調控作用，并且該通路的上游靶點LncRNANBAT1對于該通路調控胃癌細胞的增殖及對熱療的敏感性也有著一定的影響機制。

綜上所述，LncRNA-NBAT1可以通過miR-21上調PTEN表達，減緩胃癌細胞增殖，增強其對熱療的敏感性，抑制胃癌的發生發展。這一發現，可以對臨床上治療胃癌提供一個新的思路，為熱療手段治療胃癌的創新和瓶頸的突破奠定了一定的基礎。但是該實驗也存在一定的局限性，比如沒有選用多個熱療環境處理細胞，來比較該細胞株對不同熱療條件的敏感性，這還有待后續改進。