免疫球蛋白G糖基化修飾的質譜分析方法及其應用

賴治臻，周巾煜，李智立

(中國醫學科學院基礎醫學研究所/北京協和醫學院基礎學院，北京 100005)

免疫球蛋白(Ig)是一類與抗原特異性結合，具有免疫功能的糖蛋白。依據重鏈氨基酸序列的不同可分為IgG、IgM、IgA、IgD、IgE五類，其中，IgG是人體血液中含量最高的免疫球蛋白，約占免疫球蛋白總量的75%～80%[1]。當人體受到非己成分入侵或自身細胞衰老、損傷、病變時，IgG不僅可以識別異常細胞，還可以通過抗體依賴細胞介導的細胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)、補體依賴的細胞毒作用(complement-dependent cytotoxicity, CDC)以及抗體依賴細胞介導的吞噬作用 (antibody-dependent cell-mediated phagocytosis, ADCP)等效應功能發揮免疫效應。在過去的幾十年間，國內外學者利用IgG的分子結構特征，監測機體內IgG在疾病發生發展過程中的變化規律，探索其作為自身免疫性疾病和癌癥等疾病的生物標志物的潛力，并設計了基于靶向IgG的治療藥物，為疾病的診療提供了新途徑[1]。

與核酸和蛋白質合成相比，糖鏈合成沒有固定的模板，并且糖鏈具有復雜的分支結構、連接方式和空間構型，這使得糖基化修飾分析成為蛋白質結構表征中最具挑戰性的任務之一。隨著基質輔助激光解吸電離(MALDI)和電噴霧電離(ESI)技術的發展，質譜技術已成為蛋白質糖基化修飾研究中廣泛應用的分析手段。然而，糖蛋白的高動態范圍、糖基化修飾固有的低豐度、與無糖基化修飾肽段的共存等所導致的離子抑制以及糖鏈結構的高度異質性等因素，使得質譜技術表征蛋白糖基化修飾面臨挑戰[2]。2019年，全球76個實驗室采用不同技術方法從完整糖蛋白、糖肽或糖鏈等不同層面對單克隆抗體蛋白NISTmAb的糖基化修飾進行鑒定，發現抗體高豐度聚糖的質譜鑒定結果的重復性較好，而低豐度聚糖鑒定結果的重復性較差[3]。本文將綜述IgG糖鏈、糖肽和完整糖蛋白水平的質譜分析方法，及其在疾病研究和藥物研發中的應用。

1 IgG的結構

1.1 IgG的合成

Ig的多肽鏈由3個常染色體基因編碼，這3個基因簇分別被稱為H-、κ-和λ-基因家族，分別編碼所有亞類的重鏈、κ-輕鏈、λ-輕鏈。人類的H、κ、λ基因家族分別在14號、2號、22號染色體上。每個重鏈由4種不同類型的基因片段編碼，分別為可變區(VH)、多變區(D)、連接區(JH)和恒定區(CH)。Ig分子的輕鏈由VL、JL和CL 3個基因片段編碼，重鏈的可變區域由VH、D、JH段編碼。CH的基因片段決定重鏈的類別，而VH、D和JH區域決定免疫球蛋白分子的抗原識別部分。Ig根據其重鏈類型α、δ、ε、γ、μ可分為IgA、IgD、IgE、IgG和IgM五種類型。VH、D和JH基因片段共同編碼IgG重鏈的可變區，Cγ1、Cγ2、Cγ3和Cγ4基因片段分別編碼IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的恒定區，編碼基因轉錄成mRNA后，在核糖體中分別翻譯成IgG輕鏈和重鏈分子，最后由2條相同的輕鏈(約25 kDa)和2條相同的重鏈(50～70 kDa)經二硫鍵組裝為完整的IgG分子。二硫鍵位于CH1和CH2之間的鉸鏈區，鉸鏈區不僅負責連接2條重鏈，還影響抗原結合片段(Fab)與結晶片段(Fc)間的靈活性。其中，Fab由VL、CL、VH、CH1組成，負責與抗原相結合；Fc由CH2和CH3組成，負責行使效應功能，示于圖1。

1.2 IgG亞類

IgG重鏈恒定區的差異主要表現在鉸鏈區氨基酸數目、二硫鍵數目和氨基酸序列的不同，可分為IgG1、IgG2、IgG3和IgG4四個亞類[4]，示于圖2，從而導致IgG與protein A、protein G、補體分子(C1q)、Fcγ受體(FcγR)等蛋白的結合能力不同，列于表1。IgG亞類在人體免疫系統中分別承擔不同的功能。抗體對某些抗原反應的刺激可導致某些IgG亞類的選擇性增加[5-6]。IgG1鉸鏈區域包含15個氨基酸殘基和2個鏈間二硫鍵，其Fab片段可繞其對稱軸旋轉，IgG2鉸鏈區有12個氨基酸殘基和4個鏈間二硫鍵[7]，IgG3鉸鏈區包含62個氨基酸殘基(21個脯氨酸和11個半胱氨酸)和11個鏈間二硫鍵，形成了1個多脯氨酸雙螺旋結構[7]，IgG4鉸鏈區包含12個氨基酸殘基和2個鏈間二硫鍵，其鉸鏈區柔性順序為IgG3>IgG1>IgG4>IgG2[8]。

表1 IgG結構及生物學特性Table 1 Structures and biological characteristics of IgG

注：輕鏈：2號和3號染色體分別編碼κ和λ輕鏈，經轉錄和翻譯過程，產生不同的輕鏈；重鏈：14號染色體上VH、D、JH基因片段共同編碼IgG重鏈的可變區(VH)；Cγ1、Cγ2、Cγ3和 Cγ4基因片段經轉錄和翻譯過程，分別產生IgG1、IgG2、IgG3和IgG4分子；此外，分別編碼IgM、IgD、IgA1、IgE和IgA2的基因片段Cμ、Cδ、Cα1、Cε和Cα2也位于14號染色體上圖1 IgG重鏈和輕鏈的合成過程Fig.1 Synthesis process of IgG heavy chain and light chain

2 IgG糖基化修飾

蛋白質糖基化修飾可改變效應蛋白的溶解度、半衰期以及與受體的相互作用等，從而影響其生理特性[9-11]。根據糖鏈與蛋白連接方式的不同，糖基化修飾主要分為N-連接和O-連接兩種：大多數IgG分子僅在重鏈CH2區的Asn297位點連接N-糖鏈，約10%～20%的IgG分子在Fab區有N-糖基化修飾；少數IgG分子有O-糖基化修飾。N-糖鏈結構一般分為高甘露糖型、雜合型和復雜型3種類型。N-糖鏈均有1個共同的五糖(GlcNAc2Man3)核心結構[12]。IgGN-糖鏈多為雙天線復雜型，常帶有核心巖藻糖殘基(Fuc)、平分型N-乙酰葡糖胺殘基(GlcNAc)、末端半乳糖殘基(Gal)或末端唾液酸殘基(Neu5Gc)修飾。

3 IgG糖基化修飾的質譜分析方法

由于蛋白糖基化修飾具有高度的異質性，且豐度較低，一般在質譜鑒定前需要進行樣本的前處理。目前，對IgG糖基化修飾的分析主要從糖鏈、糖肽和完整糖蛋白3個不同視角解析糖基化修飾狀態和類型。

3.1 IgG的分離純化方法

為滿足基礎或臨床研究的需要，基于蛋白質相互作用原理的protein A和protein G親和純化方法已逐漸取代了硫酸銨沉淀法[14]，并成為目前從血液中分離IgG的常用方法。聚丙烯酰胺凝膠電泳也常用于IgG的分離，但存在回收蛋白較難、分離效率較低等問題。

注：IgG根據氨基酸序列不同可分為IgG1、IgG2、IgG3和IgG4；IgG糖基化修飾N-連接的三種糖鏈類型：除由2個N-乙酰葡萄糖胺和3個甘露糖組成的五糖核心外，因單糖的種類和連接方式的不同N-糖鏈可分為高甘露糖型、復雜型和雜合型；O-連接的8種核心型糖鏈：O-糖鏈通過N-乙酰半乳糖胺與肽鏈相連，按N-乙酰半乳糖胺3位或6位上β連接的半乳糖、β連接的N-乙酰葡萄糖胺和α連接的N-乙酰半乳糖胺可分為8種核心型圖2 IgG亞類結構及糖基化修飾的異同Fig.2 Similarities and differences of glycosylation of IgG subclass structures

3.2 糖鏈的分析

3.2.1糖鏈釋放方法 糖鏈釋放可采用生物酶解和化學水解的方法。N-糖苷酶F(PNGase F)[15]、N-糖苷酶A(PNGase A)[16]、糖苷內切酶H(Endo H)[17]和糖苷內切酶S(Endo S)[18]是常用的從蛋白質氨基酸鏈上酶解糖鏈的糖苷酶。PNGase F可用于糖肽或完整蛋白上連接的糖鏈釋放[15]；Endo H僅可酶解高甘露糖型寡糖鏈[19]。肼解法[20]、高碘酸氧化-β消除法[21]、三氟乙酸法[22]、三氟甲磺酸法[23]等是常用的化學水解法，其中肼解法可實現對肽段上N-糖鏈和O-糖鏈的同時釋放[24-25]。

3.2.2糖鏈衍生方法 為提高檢測糖鏈的靈敏度，通常利用熒光標記試劑(如2-氨基苯甲酰胺(2-AB)[26]、2-氨基苯甲酸(2-AA)[27]和2-氨基吡啶(PA)[28])衍生，隨后采用液相色譜分離，紫外光譜分析。研究發現，HPLC-MS分析2-AA標記的糖鏈靈敏度高于2-AB標記[29]。利用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生糖鏈結合離子遷移質譜，可實現對糖鏈異構體的分離[30]。利用8-氨基芘-1，3，6-三磺酸(APTS)標記結合離子對輔助萃取(IPAE)與親水作用色譜(HILIC)，可實現對糖鏈的分離純化[31]。

3.2.3糖鏈純化方法 純化標記糖鏈的主要策略有固相萃取(SPE)[29]、凝膠色譜[32-34]和熒光標記法[35]。固相萃取利用分析物在固定相中的吸附能力不同純化糖鏈，常用的固定相有反相(RP)填料、多孔石墨化碳(PGC)、HILIC和高效陰離子交換色譜(HPACE) 填料等，各分離方法的特點列于表2。利用HILIC-SPE可富集糖樣本[36]，PGC-LC-ESI MS聯用技術可同時對糖蛋白中的N-糖鏈和O-糖鏈混合物進行分離鑒定[37-38]。隨著質譜技術的不斷發展，已開發出不同策略的IgG糖鏈純化方法[39-41]。

表2 常用的糖鏈分離純化方法Table 2 Typical methods for glycan chain separation and purification

3.2.4糖鏈的質譜分析 糖鏈質譜分析常用的離子化技術為MALDI和ESI，二者均為軟電離技術，具有很強的互補性，并兼具高通量、高分辨率、高靈敏度等特點，但由于離子化可能引起唾液酸殘基等不穩定糖苷鍵的斷裂，分析前需要對糖鏈進行(全)甲基化衍生或對唾液酸殘基進行衍生保護[49]。其中，MALDI是一種快速、簡單的糖鏈離子化方法，對鹽等干擾物的耐受力強，因電離產生的離子多為單電荷而便于解析；ESI-MS與液相色譜聯用可實現對復雜糖鏈混合物的在線分離。此外，結合各種離子碎裂技術可利用串聯質譜對糖鏈結構進行鑒定。

3.3 糖肽水平的質譜分析

3.3.1IgG糖肽的制備 糖鏈水平的分析不能提供其連接位點的信息，而在IgG糖肽水平上的分析不僅可獲得糖型信息，還可獲得糖基化修飾位點的信息[50]。用胰蛋白酶[51]、谷氨酸蛋白酶(Glu-C)[52]、賴氨酰肽鏈內切酶(Lys-C)[53-54]和木瓜蛋白酶[55-56]、胃蛋白酶[57]、鏈球菌IgG降解酶(IdeS)[58-59]和鏈霉蛋白酶[60]等可獲得特異性或非特性的IgG糖肽。

3.3.2糖肽的富集 凝集素親和法：凝集素是一類糖結合蛋白，能專一地識別某一特殊結構的單糖或聚糖中特定的糖基序列，并與之發生非共價且可逆的結合[61]。一種凝集素僅能富集某一特殊結構的糖鏈，很難實現對不同種類糖鏈結構的同時分析[62]。化學反應法：糖鏈具有特殊的多羥基、醛基等結構，可與化學材料分子的特殊官能團發生反應，形成較穩定的共價或非共價加合產物，從而實現對糖肽的分離富集，如硼酸化學反應法[63]和酰肼化學反應法[64]等。前者在堿性環境下，硼酸與糖殘基的順式1,2-二羥基之間可形成穩定、可逆的硼酸酯共價鍵，將糖肽結合到固相載體上；而在酸性環境下，酯鍵可發生水解反應釋放糖肽，從而實現糖肽與非糖肽的分離。后者基于氧化后糖鏈中生成的醛基，與酰肼形成共價鍵實現糖肽的富集分離，其缺點是易破壞糖鏈結構。親水/疏水相互作用法：基于親水或疏水相互作用開發的多種糖肽富集材料已廣泛用于糖肽的分離富集，如C18[65]、二氧化鈦(TiO2)[66-67]、g-C3N4[68]、功能化磁性納米材料[69-71]和天然固相萃取材料(棉花固相萃取柱[72]、楊絮和木棉[73]等)。其中，HILIC的原理主要是糖肽中糖鏈結構的親水基團(如羥基和羧基等)與上述材料中的官能團形成較穩定的氫鍵，然后在酸或堿環境下破壞氫鍵獲得糖肽。目前，基于HILIC原理開發的磁性納米材料在糖肽富集策略中不僅具有較強的糖肽富集選擇性，而且具有通量高、操作簡便、經濟環保等優點[2,74]，受到研究者的青睞。

3.3.3糖肽的質譜分析 在質譜分析過程中，糖肽因結構復雜、分子質量大、離子化效率低、殘留多肽干擾而較糖鏈分析更加困難。目前報道的糖肽分析方法主要有一級質譜(full scan mass spectrometry, MS1)和串聯質譜(trandem mass spectrometry, MS2)。MS1水平的糖肽分析：糖肽在MS1水平的直接鑒定依賴于高分辨質譜儀采集糖肽精確分子質量的同位素分布數據。在多肽中，其主要組成元素為C、H、N 等(同位素間均只有1 u差異)。然而，糖肽中含有較多的氧元素，自然界中16O與18O之間存在2 u差異。因此，其特征性的同位素峰型在理論上可以用于糖肽的識別和鑒定，但對質譜儀的性能要求較高。MS2水平的糖肽分析：糖肽的鑒定一般通過串聯質譜結合數據庫搜索進行確定。常見的串聯質譜碎裂方式有碰撞誘導解離(collision induced dissociation, CID)、高能碰撞解離(higher energy collisional dissociation, HCD)、電子轉移解離(electron transfer dissociation, ETD)、電子捕獲解離(electron capture dissociation, ECD)，以及組合型EThcD(electron-transfer/higher-energy collision dissociation)和 CID+HCD等。CID碎裂技術能量較高，糖肽裂解作用于肽鏈上的聚糖，產生一系列與聚糖裂解有關的碎片離子[75]。然而，因糖肽的分子質量較大，CID-MS2圖譜無法檢測到氧鎓離子信號，不利于糖肽MS2譜圖的解析。ECD和ETD可選擇性地裂解肽段主鏈，通過產生的肽碎片離子和由連接的聚糖產生的質量位移確定肽序列和N-糖鏈連接的位點[76]。隨著質譜儀的發展，特別是質譜的碎裂技術，將糖肽分析的主要瓶頸轉移到高通量、高可信度的譜圖解析所需的軟件解決方案上[77]。

3.4 完整蛋白水平的分析

在完整蛋白水平分析IgG糖基化修飾的優勢在于能夠最大程度地簡化樣本制備過程，同時，這種分析策略可以獲得整個IgG分子上的糖基化修飾信息，可用于研究2條重鏈上不對稱的糖型分布[78]。完整蛋白水平上糖型分析的手段之一是凝集素。根據凝集素能夠與不同糖型特異性結合的性質，通過與熒光標記、酶聯反應或質譜技術聯用，可以實現完整蛋白糖基化修飾的定性和定量分析[78-79]。為解決IgG蛋白分子在進行質譜檢測時由于分子質量過大而導致的分析困難，多數研究采用木瓜蛋白酶[55-56]、胃蛋白酶[57]、無花果蛋白酶[80]或鏈球菌IgG降解酶(IdeS)[58-59]等將IgG酶解為Fab和Fc相關片段，示于圖3，或者采用直接打開二硫鍵的方式將IgG分解成輕鏈和重鏈[51,81]，以減小待分析物的分子質量，降低質譜分析難度，提供更精確的糖型信息。

3.4.1IgG Fab和Fc的分析 質譜分析一般只提供Fc糖基化修飾的信息，結合超高效液相色譜(UPLC)技術可獲得Fc和Fab結構域糖基化修飾的信息。IgG Fab結構域的氨基酸序列與體細胞的突變密切相關，因此，Fab糖基化修飾分析非常復雜。利用IdeS酶對IgG酶解，產生F(ab’)2和2個Fc片段，可實現Fab和Fc片段的分析，示于圖3。Fc片段可以與protein G結合，糖基化的F(ab’)2碎片隨后在PNGase F酶作用下進行多糖釋放。PNGase F多糖釋放和唾液酸乙基酯化或2-AA多糖標記已成功用于Fab和Fc特異性糖基化修飾分析[82]。通過改變離子導向裝置電壓參數，開發了一種用于IgG Fab和Fc片段表征的N端Top-down測序方法[83]。應用傅里葉變換離子回旋共振質譜對人IgG1進行Top-down和Middle-down MS的深度表征，獲得了詳細的序列數據[84]。

注：IdeS將IgG酶解后產生1個F(ab’)2和2個Fc片段；木瓜蛋白酶將IgG酶解后產生2個Fab和1個Fc片段；胃蛋白酶將IgG酶解后產生1個F(ab’)2和Fc碎片肽段，酶解時間延長，F(ab)2進一步裂解產生2個Fab片段；無花果蛋白酶在4 mmol/L半胱氨酸溶液中酶解IgG產生1個F(ab’)2和碎片化的Fc肽段，在25 mmol/L半胱氨酸溶液中酶解產生2個Fab和碎片化的Fc肽段圖3 完整IgG質譜分析酶解示意圖Fig.3 Enzymatic hydrolysis schematic of complete IgG mass spectrometric analysis

3.4.2單克隆抗體藥物的分析 由于多克隆抗體(如血清IgG)的可變區存在極大的序列異質性，質譜技術在完整IgG分子水平分析糖基化修飾的應用大多集中在單克隆抗體上[85]。因IgG Fc區糖基化修飾對治療性抗體的安全性和臨床療效有著深遠的影響，因此，高效的糖蛋白定量分析技術對治療性抗體的開發和質量控制起著重要作用，其中IgG Fc的糖譜被認為是藥物療效的關鍵。Top-down MS已成為蛋白質鑒定的一種可行選擇，尤其在治療性抗體藥物結構表征上有著迫切的需求[86]。結合多種碎裂技術(如，ETD、ECD和基質輔助激光解吸電離源衰變(MALDI-ISD))的Top-down和Middle-down MS分析已用于表征單克隆抗體 IgG1和融合IgG蛋白[87]，可提供有關糖基化位點和不同組合蛋白種類的信息。

4 IgG糖基化修飾與生理、病理狀態的關系

4.1 IgG Fc N-糖基化修飾與生理狀態的關系

血清IgG的糖型組成與機體的生理狀態相關，其糖基化修飾水平與年齡密切相關[88]，尤其在57歲以下人群中差異更為明顯[89]，其相關性并非單一的正負關系[51]。在25歲時，IgG半乳糖基化修飾約為20%～30%；70歲時約為40%[90-91]。隨著年齡增長，Fc段的核心巖藻糖基化修飾水平呈下降趨勢，而平分型N-乙酰葡糖胺修飾水平則表現為上升趨勢[92-93]。除與年齡相關外，IgG糖鏈組成還與性別相關，在60歲以下人群中的差異尤為顯著[94]。與男性相比，女性血清IgG的半乳糖基化水平顯著高于同年齡組男性，并且隨著年齡增加而下降的趨勢變得更為明顯[51,94]。這可能是IgG半乳糖基化修飾在一定程度上受雌激素濃度的影響，如妊娠期水平升高[95]，絕經后水平降低[96]。此外，雌激素在女性體內作為IgG半乳糖基化修飾的調節劑，揭示了一種與性別相關的免疫反應調節機制[97]。

4.2 IgG Fc N-糖基化修飾與病理狀態的關系

IgG糖基化修飾在病理狀態下將發生顯著改變。自身免疫性疾病(如風濕性關節炎和系統性紅斑狼瘡患者)與健康人IgG糖鏈有著顯著差異[98-100]。血清中的IgG不僅包含與疾病密切相關的IgG，還包含健康人體固有的自身抗體和穩態抗體。與疾病不相關的IgG糖基化修飾會干擾與疾病密切相關的IgG糖基化修飾的檢測，甚至可能掩蓋與疾病密切相關的IgG糖基化修飾變化趨勢。因此，為更精準地研究疾病對IgG FcN-糖基化修飾的影響，需要關注對疾病特異IgG(DSIgG)的研究。采用Native-PAGE可分離出與疾病相關的免疫炎癥蛋白復合物，再結合SDS-PAGE分離技術，可以從人血液中分離得到DSIgG，可對IgG Fc段糖基化修飾進行深入研究[81]。

IgG Fc糖基化修飾在不同慢性疾病，如甲狀腺癌[51]、肺癌[101]、非小細胞肺癌[102]、胰腺癌[103]及胃癌[81]等中均發現了異常變化。利用基質輔助激光解吸電離-傅里葉變換離子回旋共振質譜分析了IgG2 Fc 6種巖藻糖基化修飾(如G0F、G1F、G2F、G0FN、G1FN和G2FN)，可用作胰腺疾病診斷的潛在標志物。肺癌患者的IgG1 Fc半乳糖基化修飾呈下降趨勢[101]，且IgG Fc糖基化修飾形式可作為區分非小細胞肺癌和肺部良性疾病的潛在個體化標志物[102]。研究還發現，半乳糖基化修飾、唾液酸化修飾及N-乙酰葡糖胺基化修飾(GlcNAc)與這2種病理狀態密切相關[81]。IgG糖基化修飾的改變極大地改變了其生物學功能，并與個體的年齡、性別和疾病狀態相關[51,89,93,104]。其中，核心巖藻糖基化修飾、唾液酸化修飾、半乳糖基化修飾、平分型N-乙酰葡糖胺基化修飾和高甘露糖基化修飾[105]對IgG的物理化學特性有著重要影響。近年來的研究表明，IgG糖鏈結構變化與疾病狀態密切相關，IgG糖鏈結構變化可為自身免疫性疾病和腫瘤的診斷與監測提供新的策略。

4.2.1核心巖藻糖基化修飾 IgG FcN-糖鏈結構變化可通過影響與Fc結合的各種受體的能力來調節抗體效應功能。核心巖藻糖基化修飾的寡糖是在高爾基體中通過巖藻糖基轉移酶FUT8從GDP-Fuc上轉運來的巖藻糖殘基合成而來。IgG Fc核心巖藻糖會影響與FcγRIIIa的結合，且表現為非巖藻糖基化修飾的抗體與FcγRIIIa的結合最強[106]。體外實驗表明，采用化學酶法生成的IgG1糖苷，去除核心巖藻糖對IgG與FcγRIIIa的結合和抗體的ADCC作用有著顯著的增強作用，且唾液酸在核心巖藻糖修飾下可對ADCC產生不利的影響[107]。相對于缺乏巖藻糖的IgG，糖鏈結構中的核心巖藻糖降低了IgG抗體與IgG FcγRIIIa的結合，導致ADCC活性降低。胃癌患者中Fc核心巖藻糖基化修飾水平在疾病的Ⅱ期和Ⅲ期階段表現出較明顯的升高，表明核心巖藻糖基化修飾可能與胃癌的進展相關[108]。在卵巢癌患者的核心巖藻糖基化修飾研究中也觀察到類似的現象[109]。

4.2.2唾液酸化修飾 唾液酸修飾作為糖鏈末端唯一帶電荷的糖殘基，對抗體Fc結構的影響最大[110]。單唾液酸化修飾的IgG約占10%左右[111-112]，雙唾液酸化修飾的IgG約占1%[113]。Fc高唾液酸化修飾會降低IgG與FcγRIIIA受體，以及其與細胞表面抗原結合的親和性，導致ADCC作用減弱，IgG的功能由促炎轉為抗炎作用[114]。在癌癥患者中，單唾液酸化修飾的IgG呈下降趨勢，而雙唾液酸化修飾的IgG呈上升趨勢[115]。

4.2.3半乳糖基化修飾 IgG半乳糖基化修飾是唾液酸化轉移酶的底物，其唾液酸化修飾水平通常伴隨著半乳糖基化修飾水平的升高而上調。免疫系統的變化會導致人類抗原特異性IgG半乳糖基化修飾水平的瞬時增加，而對IgG的總半乳糖基化修飾水平沒有顯著影響，表明無半乳糖基化修飾的IgG更具致病性，即IgG半乳糖基化修飾具有抗炎活性[96]。根據IgG Fc糖鏈末端半乳糖基化殘基的數量，可以將IgG糖型分為無半乳糖基化修飾(G0)、二天線糖鏈中的一分支發生半乳糖基化修飾(G1)以及二天線糖鏈的兩分支均發生半乳糖基化修飾(G2)3種類型。近年來的研究主要集中于IgG Fc半乳糖糖基化修飾與腫瘤之間的關系。在多發性骨髓瘤[116-117]、胃癌[81,108,118-120]、胰腺癌[103,121]、結直腸癌[70,122-124]、肺癌[102,125]、前列腺癌[115,126-127]、卵巢癌[128-129]、乳腺癌[130-131]患者的血清中發現IgG G0水平較健康對照組高，而IgG G2水平顯著降低。

4.2.4平分型N-乙酰葡糖胺修飾 末端N-乙酰葡糖胺可以通過MBL途徑激活補體，N-乙酰葡糖胺的增加會阻礙C1q與抗體的結合[132]，表現為抗炎作用。在所有IgG Fc糖鏈中，只有約10%含有平分型GlcNAc[133]。平分型GlcNAc的升高可以通過提高IgG與FcγRIII的親和力來強化ADCC作用[95]。但也有研究表明，平分型GlcNAc對結合FcγR或C1q沒有顯著影響[134]。在胃癌患者中，平分型GlcNAc水平降低[135]，這可能歸因于胃癌患者體內平分型聚糖殘基N-乙酰葡糖胺轉移酶3(MGAT3)的酶活性下降，平分型GlcNAc修飾的IgG水平降低，導致IgG與FcγRIIIA的親和性隨之下降，使ADCC作用減弱，腫瘤侵襲性增強。

4.2.5高甘露糖基化修飾 目前，對高甘露糖基化修飾的研究主要集中在治療性重組IgG，重組抗體中高甘露聚糖修飾水平可從1%提高至20%，而內源性人體IgG中只含有微量水平(<0.1%)的高甘露糖基化修飾[136]。采用高分辨質譜測定糖鏈譜隨時間的變化，發現高甘露糖基化修飾的相對水平隨著時間的增加而下降，其他糖鏈則幾乎保持不變，說明含有Fc高甘露糖糖鏈的治療性IgG在人體內比其他糖鏈形式清除得更快[137-138]。治療性單克隆抗體的N-糖基化修飾是藥物安全性和有效性的一個重要產品質量屬性，在生物仿制藥的開發過程中需要增加高甘露糖基化修飾的百分比以提高藥物的療效[139]。

4.3 IgG Fab糖基化修飾與病理狀態的關系

IgG Fab糖鏈在病理狀態下也會發生顯著改變。研究發現，IgG可能通過Fab片段上的糖鏈與抗原結合的IgG分子和巨噬細胞結合，影響抗原-抗體結合和巨噬細胞極化，有助于腫瘤細胞逃避免疫監視[140]。在類風濕性關節炎患者中，IgG Fab的核心巖藻糖基化修飾和平分型N-乙酰葡糖胺修飾水平在患病組略有下降[141]，還有研究表明，類風濕性關節炎患者的IgG Fab糖基化修飾總體水平有所上升[142]。在骨髓瘤患者中，Fab段唾液酸化修飾、核心巖藻糖基化修飾和N-乙酰葡糖胺基化修飾的水平升高[143]。在濾泡性淋巴瘤、彌漫性淋巴瘤和伯基特淋巴瘤患者中，Fab互補決定區的糖基化位點顯著增多，而非功能區糖基化位點則無明顯變化[144-145]。在惡性黑色素細胞瘤患者中發現了抗GRP78的自身抗體Fab段糖基化修飾的改變，其可影響惡性黑色素細胞的生長和轉移[146]。

5 總結與展望

IgG的生物學功能與其糖基化修飾狀態密切相關，質譜技術在研究IgG糖基化修飾中發揮著重要作用。隨著質譜技術的快速發展，研究人員分別在IgG的糖鏈水平、糖肽水平和完整蛋白水平開發了各種質譜分析方法，且揭示了IgG糖基化修飾狀態與某些疾病之間的關系。然而，對IgG糖基化修飾狀態的鑒定仍面臨一些挑戰。首先，在糖鏈分析中，一般先將其從肽段上釋放，再通過酰胺化衍生或烷基酯化穩定糖鏈結構，以提高質譜檢測的靈敏度，但衍生化處理使得樣本更加復雜化，且在一定程度上破壞了糖鏈結構。其次，在糖肽分析中普遍存在肽信號對糖肽信號的抑制作用，如何高效地將肽和糖肽分離是亟待解決的問題。最后，在完整蛋白糖基化修飾分析中對質譜儀性能及人員的要求較高，較難大范圍地推廣。