HPLC法同時測定刺山柑果實正丁醇部位中3種成分及該部位抑菌活性

包曉瑋， 趙文燕， 曾蘭君， 魏晨業， 金渭荃

(1.新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆軍區保障部藥品儀器監督檢驗站，新疆 烏魯木齊 830052)

刺山柑CapparisspinosaL.為白花菜科山柑屬植物，屬多年生藤本小半灌木[1]，其藥用部位為葉、果實、根皮，性溫，味辛、苦，具有祛風、通鼻竅、止淤消腫、止痛活血之功效，維吾爾族民間常將其果實搗碎后貼敷，用于治療關節炎和肩周炎等疾病[2]。Khanfar[3]從刺山柑中分離得到2個新化合物，經質譜分析鑒定均為生物堿；Sharaf等[4]對3種山柑屬植物中的黃酮進行分析，共發現23種，其中果實含槲皮素-3-O-蕓香糖苷、槲皮素-7-O-蕓香糖苷等；Germanò等[5]從刺山柑地上部分中分離得到蘆丁、異鼠李素-3-蕓香苷。

研究表明，蘆丁[6]、對羥基苯甲酸[7]、異槲皮苷[8]均具有良好的抗菌作用。因此，本實驗在前期基礎上[9-10]建立HPLC法同時測定刺山柑果實正丁醇部位中上述3種成分含量，并評價該部位抑菌活性，以期為該藥材質量控制提供基礎，也為今后開發天然廣譜抗菌成分提供依據。

1 材料

1.1 儀器 LC-20AB高效液相色譜儀，配置SPD-20A紫外檢測器(日本島津公司)；KQ-250DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；FA2004N型電子天平(上海菁海儀器有限公司)。

1.2 試劑與藥物 刺山柑于2019年5月購于新疆烏魯木齊市北園春批發市場，經新疆農業大學食品科學與藥學學院藥學系馬生軍副教授鑒定為正品。蘆丁對照品(批號Y16M9S61523，純度≥98%)、對羥基苯甲酸(批號MKBK3576V，純度≥99%)(上海源葉生物科技有限公司)；異槲皮苷對照品(成都曼思特生物科技有限公司，批號MΜST-18051005，純度≥99.74%)。0.22 μm有機相微孔濾膜(美國Thermo-Fisher公司)。色譜純甲醇、乙腈(美國Sigma-Aldrich公司)；色譜純甲酸、分析純乙酸銨(國藥集團化學試劑有限公司)；水為娃哈哈純凈水。

1.3 菌種 大腸桿菌[CMCC(B)44102]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]，均由新疆維吾爾自治區藥檢所提供。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液制備 精密稱取蘆丁、異槲皮苷、對羥基苯甲酸對照品適量，甲醇制成1 mg/mL貯備液，吸取適量并混勻，甲醇稀釋，即得(三者質量濃度均為10 μg/mL)，0.22 μm微孔濾膜過濾。

2.2 供試品溶液制備 取藥材干燥果實，粉碎后過60目篩，稱取200 g，按料液比1∶10用80%、50%乙醇各超聲提取3次，每次50 min，提取液合并，減壓濃縮得浸膏，混懸于等量蒸餾水中，按1∶2比例依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，合并正丁醇萃取液，減壓濃縮，得相應部位浸膏4.02 g，精密稱取10 mg，10 mL甲醇溶解，即得，0.22 μm微孔濾膜過濾。

2.3 色譜條件 島津Inertsil ODS-3色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流動相乙腈(含0.1%甲酸)-乙酸銨(含0.1%甲酸)(25∶75)；體積流量0.8 mL/min；柱溫40 ℃；檢測波長280 nm；進樣量20 μL。色譜圖見圖1。

1. 蘆丁 2. 對羥基苯甲酸 3.異槲皮苷圖1 各成分HPLC色譜圖

2.4 線性關系考察 將“2.1”項下貯備液用甲醇依次稀釋成32、16、8、4、2、1、0.5 μg/mL對照品溶液，在“2.3”項色譜條件下各進樣20 μL測定。以對照品質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，分別以S/N=3、S/N=10為檢出限、定量限，結果見表1，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表1 各成分線性關系

2.5 精密度試驗 精密吸取“2.1”項下對照品溶液20 μL，在“2.3”項色譜條件下進樣測定6次，測得蘆丁、對羥基苯甲酸、異槲皮苷峰面積RSD分別為1.88%、1.85%、1.79%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗 取正丁醇部位適量，按 “2.2”項下方法制備供試品溶液，于0、2、4、8、10、12、24 h在“2.3”項色譜條件下各進樣20 μL測定，測得蘆丁、對羥基苯甲酸、異槲皮苷峰面積RSD分別為1.24%、1.77%、1.35%，表明溶液在24 h內穩定性良好。

2.7 重復性試驗 取正丁醇部位適量，按“2.1”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.3”項色譜條件下各進樣20 μL測定，測得蘆丁、對羥基苯甲酸、異槲皮苷峰面積RSD分別為1.60%、1.88%、1.81%，表明該方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗 取各成分含量已知的正丁醇部位9份，分別80%、100%、120%水平加入對照品溶液[11]，按 “2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3”項色譜條件下進樣測定，計算回收率，結果見表2。

表2 各成分加樣回收率試驗結果(n=9)

2.9 樣品含有量測定 取正丁醇部位6份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3”項色譜條件下進樣測定，計算含量，結果見表3。

表3 各成分含量測定結果(mg/g，n=6)

2.10 抑菌活性研究 精密稱取正丁醇部位浸膏1 g，加入1 mL DMSO充分溶解，得到1 g/mL供試液。將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌在無菌條件下接種于新鮮斜面固體培養基，置于37 ℃恒溫培養箱中培養過夜進行活化，再接種于液體無菌LB培養基振蕩培養。

取編號1-7的無菌離心管，無菌條件下在1號試管中加入5.4 mL LB液體培養基，其余各管加入3 mL。再于1號試管中加入0.6 mL供試液，充分混勻至100 mg/mL，吸取3 mL藥液加到2號管中，振蕩混勻后倍比稀釋，吸取3 mL藥液加到3號管中，以此類推，2～7號管中供試液質量濃度依次為50、25、12.5、6.25、3.125 mg/mL。在各離心管中加入200 μL金黃色葡萄球菌的菌懸液，充分混勻后封口，37 ℃下恒溫振蕩培養18～24 h。采用活菌計數法測定細菌濃度[12]，以LB液體培養基將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌濃度調至1×106CFU/mL，取0.2 mL加到各離心管中。同時，另設只含LB液體培養基的空白對照及未加入細菌的陰性對照。

供試液在培養箱中培養24 h后，各取200 μL至無菌固體培養基平皿中涂板，置于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h。以平板上無細菌生長或生長菌落數小于3個時對應的稀釋度為最小抑菌濃度，平板上完全無細菌生長時對應的稀釋度為最小殺菌濃度，平行3次，取平均值。結果，正丁醇部位對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的最小抑菌濃度分別25、25、6.25 mg/mL, 最小殺菌濃度分別為50、32.5、12.5 mg/mL，即對三者抑制作用大小依次為枯草芽孢桿菌>金黃色葡萄球菌>大腸桿菌。

3 討論

本實驗考察了流動相甲醇-0.1%磷酸(10∶90、20∶80、30∶70、40∶60、50∶50)、乙腈(含0.1%甲酸)-7.5 mmol/L乙酸銨(含0.1%甲酸)(15∶85、25∶75、30∶70、35∶65、50∶50)及其等度、梯度洗脫方式[13-14]，發現與甲醇相比，乙腈洗脫能力、分離效果較好，最終確定為乙腈(含0.1%甲酸)-7.5 mmol/L乙酸銨(含0.1%甲酸)等度洗脫(25∶75)。再考察了體積流量0.8、1.0 mL/min，發現在0.8 mL/min時蘆丁、對羥基苯甲酸、異槲皮苷均能基線分離，分離度均大于1.5，理論塔板數以蘆丁計均大于7 000。黃酮紫外光譜在240～400 nm波長范圍內有2個吸收帶，處于290～380 nm之間的為帶Ⅰ，處于240～280 nm之間的為帶Ⅱ，本實驗通過SPD-20紫外檢測器得到280、360 nm波長處對照品溶液色譜圖[15-17]，發現蘆丁、異槲皮苷均有較大吸收峰，而且色譜峰峰形良好，分離度理想，但對羥基苯甲酸在360 nm處無吸收峰，故選擇280 nm作為檢測波長。

綜上所述，刺山柑果實正丁醇部位對革蘭氏陽性菌(枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌)的抑制作用大于革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)；從形態結構分析，革蘭氏陽性菌中肽聚糖含量較高，而革蘭氏陰性菌中其含量較低，并且后者最外層外膜為脂多糖，表明活性成分可通過破壞肽聚糖結構來抑制細菌，但對脂多糖結構的作用較弱。