基于生物信息學和網絡藥理學研究獨活寄生湯治療絕經后骨質疏松癥的分子機制

管世兵， 陳春燕， 涂 楚， 陸忠杰*

(1.六安市中醫院藥劑科，安徽 六安 237006；2.六安市中醫院心病科，安徽 六安 237006)

絕經后會造成女性卵巢肺功能衰退，體內雌性激素水平顯著下降，導致谷歌效應障礙最終誘發骨質疏松癥的發生[1]。研究表明，此類患者多以骨量減少，骨脆度增加，外界輕微外力可引發骨折，嚴重的影響了患者的生活質量[2]。因此，通過積極探尋有效藥物治療顯得尤為關鍵。獨活寄生湯出自《備急千金要方》，長期應用骨關節炎治療，能夠有效緩解膝關節炎臨床癥狀[3]。新進研究發現，獨活寄生湯也能夠改善骨質疏松癥患者臨床癥狀，提高患者的生活質量[4]。但是目前有關獨活寄生湯對絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)的作用機制尚不清楚。因此本研究基于網絡藥理學和生物信息學手段探究獨活寄生湯對PMOP的分子作用機制，為臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級雌性SD大鼠30只，6～8周齡，由安徽醫科大學動物實驗中心提供,動物生產許可證號 SCXK(皖)2017-001，飼養條件相對濕度50%～70%，12 h/12 h交替光照，實驗期間均正常飲食飲水。

1.1.2 試劑與藥物 獨活寄生湯購于安徽中醫藥大學附屬第一醫院，由獨活(9 g)、桑寄生(6 g)、牛膝(6 g)、杜仲(6 g)、秦艽(6 g)、防風(6 g)、肉桂(6 g)、細辛(6 g)、川芎(6 g)、當歸(6 g)、芍藥(6 g)、干地黃(6 g)、人參(6 g)、茯苓(6 g)、甘草(6 g)組成，生藥量為2.269 g/mL；BCA試劑盒(江蘇碧云天生物技術有限公司)；caspase-3抗體、Bcl-2(美國CST公司)；p53、p21抗體(武漢三鷹生物技術有限公司)；GAPDH抗體、一抗、二抗稀釋液(江蘇碧云天生物技術有限公司)。

1.1.3 儀器 雙能X射線骨密度儀小動物專用掃描和分析軟件(美國Hologic公司)；MTS-858miniBionix生物材料力學試驗機(美國MTS公司)；凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 獨活寄生湯活性化合物成分篩選和靶點預測 在中藥系統藥理學數據庫和分析平臺(TCMSP)中檢索獨活寄生湯各味中藥的所有化合物成分，并根據成分毒物動力學(absorption and distribution and metabolism and excretion，ADME)參數進一步對潛在有效化合物進行篩選，篩選條件為：口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，藥物相似性(drug-likeness，DL)≥0.18。利用TCMSP數據庫中靶點預測模型預測所篩選出化合物的潛在作用靶點。

1.2.2 GEO芯片數據分析PMOP相關靶點 本研究從Gene Expression Omnibus數據庫中下載編號為“GSE56116”的芯片數據，該芯片數據的原始文件將10例絕經后骨質疏松患者作為觀察組，另取3例健康絕經后女性作為對照組，對所有患者的基因表達譜進行測序，并尋找兩組間基因表達差異。所有血液樣本全部采用“GPL4133”平臺進行檢測。本研究采用R語言及limma等軟件包對基因芯片數據進行分析，默認參數設置來鑒別相關差異表達基因，以 log FC與P值為篩選條件，篩選標準為|log FC|>1、P<0.05，所篩選出的基因被視為顯著差異表達基因。

1.2.3 獨活寄生湯治療關鍵靶點篩選及其蛋白質相互關系網絡構建 采用Perl語言腳本對篩選出的獨活寄生湯活性成分潛在靶點和PMOP相關靶點取交集，得到共同靶點；采用Cytoscape 3.7.2軟件中的BisoGenet插件繪制上述靶點的調控網絡，在網絡圖形中用“節點”(node)表示化合物分子，“邊”(edge)表示化合物分子與靶點之間的關系；最后采用Cyot NCA插件進一步對調控網絡進行拓撲分析。

1.2.4 基因本體(GO) 功能分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG) 通路富集分析 本研究采用R語言及相關功能程序包進行GO和KEGG分析。對上述獨活寄生湯活性成分靶點和SARS-CoV感染性肺炎相關靶點取交集后，將所得的靶點進行ID轉換，即使用R語言將靶點轉化為可識別的entrez ID；在R語言中調用相關生物類程序包，如clusterProfiler、BiocManager、enrichplot等進行數據處理；調用R語言中數據可視化程序包，如ggplot等繪制GO和KEGG富集分析的條形圖。

1.2.5 分組、造模及給藥 雌性SD大鼠適應性飼養1周后，隨機分為假手術組，模型組和獨活寄生湯組，每組各10只。模型組和獨活寄生湯組大鼠采用背側入路雙側卵巢切除法造模，假手術組切除雙側卵巢旁脂肪組織，手術后7 d，期間對大鼠采用青霉素肌肉注射，預防切口感染。獨活寄生湯組大鼠按照10 mL/(kg·d)劑量進行灌胃，實驗組根據“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”換算，按照9.3 g/(kg·d)劑量進行灌胃，連續治療12周。手術后12周，3組大鼠進行腰椎骨密度檢測。

1.2.6 骨密度檢測 大鼠麻醉后取仰臥位，采用雙能X射線對大鼠全身進行掃描，設定腰椎為感興趣區域，最后通過儀器相關軟件進行腰椎骨密度分析。

1.2.7 大鼠骨生物力學檢測 實驗檢測前12 h，從冷凍冰箱內取出L4椎體，去除椎間盤、附件、終板，利用砂紙打磨椎體上下兩端以保證兩面的水平，放置于室溫條件下解凍，MTS法進行腰椎壓縮實驗。根據實驗儀器相關軟件進行數據分析得到各組大鼠腰椎剛度和最大載荷。

1.2.8 Western blot實驗 (1)取大鼠脛骨近端骨組織約150 mg，剪碎后放置于1.5 mL的組織研磨管內并按照1∶2～1∶3比例加入組織裂解液放置在已經預冷后的組織勻漿儀中進行研磨；(2)高速離心機4 ℃、12 000 r/min離心15 min，收集骨組織上清液，采用BCA法進行蛋白質濃度定量檢測；(3)按照每孔上樣量為30 μg進行蛋白質凝膠電泳實驗，電泳轉膜后牛奶封閉時間約2 h，孵育對應caspase-3(1∶1 000)、Bcl-2(1∶2 000)、p53(1∶500)、p21(1∶500)和GAPDH一抗(1∶1 000)4 ℃過夜，孵育二抗(1∶5 000)1 h，于搖床搖晃洗膜，含吐溫磷酸鹽緩沖液洗滌后加入發光聚合物，使用膠片曝光，圖片掃描后用 Image J 軟件計算各條帶的灰度值，以各目標條帶灰度值與內參GAPDH條帶灰度值的比值表示目標蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 獨活寄生湯活性成分篩選、ADME分析及靶點預測 通過檢索TCMSP數據庫，共計檢索獨活寄生湯中茯苓、甘草、秦艽、白頭翁、大棗、黃連、杜仲、川牛膝、熟地、秦皮、赤芍、黃芩、黃柏、黨參、人參、干姜、防風、白術、獨活、桑寄生、半夏、川芎、當歸、細辛24味中藥共計2 733種相關成分及其ADME參數。根據OB、DL參數共篩選出符合標準的活性成分334個，見圖1。獨活寄生湯中各味中藥活性成分OB≥30%、DL≥0.18的比例見圖2。利用TCMSP數據庫靶點預測技術對上述活性成分進行作用靶點預測，排除重復的后共獲得潛在作用靶點313個。

圖1 符合OB≥30%、DL≥0.18篩選標準的化合物數量

圖2 各味中藥活性成分符合OB≥30%、DL≥0.18的比例

2.2 PMOP相關靶點基因及其差異分析 進一步挖掘GSE56116芯片數據原始文件中的相關數據，共獲取健康受試者、PMOP患者間明顯改變的基因共971個，其中在PMOP患者中表達上調的541個，表達下調的430個，差異基因表達熱圖、火山圖見圖3～4。

圖3 差異表達基因熱圖

圖4 差異基因表達火山圖

2.3 獨活寄生湯治療PMOP的PPI網絡構建 將“2.1”項下獲得的獨活寄生湯有效成分潛在作用靶點與“2.2”項下獲得的PMOP相關差異基因靶點取交集共得到獨活寄生湯治療PMOP關鍵靶點19個。采用Cytoscape軟件建立獨活寄生湯中藥調控網絡，如圖2所示，共獲得134個節點和157個關系，半夏中的MOL002714，藿香中的MOL005916、甘草中的MOL004835及柴胡、款冬花、甘草、藿香、麻黃及紫菀中的共有成分MOL000098等有效成分與網絡中的多個靶點存在相互作用，而GSK3B、NCOA1及CA2等靶點也能作用于多個有效成分，見圖5。

圖5 獨活寄生湯治療PMOP的基因調控網絡圖

為進一步獲得更多節點的傳遞信息和更高的節點信息傳遞效率，本研究采用Cytoscape軟件中的BiosGenet和CytoNCA插件，于DIP、BIOGRID、HPRD、INTACT、MINT和BIND數據庫種建立獨活寄生湯治療PMOP的19個關鍵靶點的蛋白質相互作用網絡，并對網絡節點的拓撲屬性進行了分析篩選，共發現關鍵節點161個，篩選策略示意圖見圖6。

圖6 獨活寄生湯關鍵節點的目標帥選策略圖

2.4 GO、KEGG富集分析 利用R軟件及相關程序包對獨活寄生湯治療PMOP的19個鍵靶點進行GO和KEGG富集分析，將GO富集過程中的分子生物學過程、分子功能及細胞成分和KEGG通路按照P值升序排列，分別取前20、25位進行分析，若未滿20或25個則全部納入分析，結果見圖7～8和表1。由圖7可知，獨活寄生湯治療PMOP關鍵靶點涉及的生物學過程主要包括response to xenobiotic stimulus、xenobiotic metabolic process、sterol metabolic process等，分子功能主要包括glutathione binding、oligopeptide binding、cofactor binding等，細胞成分主要包括intercellular bridge、sarcoplasmic reticulum、sarcoplasm等；由表1、圖8可知，獨活寄生湯治療PMOP的主要信號通路包括Fluid shear stress and atherosclerosis(hsa05418)、Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450(hsa00980)、Leishmaniasis(hsa05140)等，而GSTM1、GSTM2、CCND1、CD40LG、IL4、FOS是各通路主要的富集基因。

注：柱狀圖長度代表基因富集個數，顏色深度代表P值。圖7 獨活寄生湯治療PMOP的GO富集柱狀圖

圖8 獨活寄生湯治療PMOP的KEGG關系網絡圖

表1 獨活寄生湯治療PMOP的KEGG分析

2.5 獨活寄生湯對大鼠骨密度和生物學力的影響 表2顯示，獨活寄生湯灌胃處理12周后，與假手術組比較，模型組大鼠骨密度、剛度、最大載荷均降低(P<0.01)；與模型組比較，獨活寄生湯組大鼠骨密度、剛度和最大載荷均升高(P<0.05，P<0.01)。

表2 獨活寄生湯對大鼠骨密度和生物學力的影響

2.6 獨活寄生湯對p53信號通路相關蛋白表達影響 圖9～10顯示，P53信號通路相關蛋白主要涉及p53、p21以及相關凋亡蛋白(caspase-3和Bcl-2)；與假手術組比較，模型組caspase-3表達升高(P<0.01)，Bcl-2表達降低(P<0.01)，p53和p21蛋白表達均升高(P<0.01)；與模型組比較，獨活寄生湯藥物干預組caspase-3表達降低(P<0.01)，Bcl-2表達升高(P<0.05)，p53和p21蛋白表達均降低(P<0.05)。

注：與假手術組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖9 獨活寄生湯對caspase-3、Bcl-2表達的影響

注：與假手術組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05。圖10 獨活寄生湯對p53、p21表達的影響

3 討論

獨活寄生湯是由獨活、桑寄生、牛膝、杜仲、秦艽、防風、肉桂、細辛、川芎、當歸、芍藥、干地黃、人參、茯苓、甘草組成。其中方劑中的獨活具有祛下焦風寒濕邪，為君藥。秦艽、防風祛風勝濕；肉桂溫里祛寒，通利血脈；細辛祛寒止痛，均為臣藥。桑寄生、牛膝、杜仲、芍藥補益肝腎，強壯筋骨；甘草調和諸藥，為使藥。諸藥合用，祛邪扶正，標本兼顧，達到祛風濕、止痹痛、益肝腎、補氣血之功效。當歸、川芎、干地黃養血活血；人參、茯苓、甘草補氣健脾，扶助正氣，均為佐藥[5-7]。既往研究發現獨活寄生湯能夠通過調控骨保護蛋白以及核因子-κB受體活化自配體和核因子-κB受體活化因子，從而調節骨吸收和骨重建等[8-9]。絕經后骨質疏松是女性絕經后的一種常見性骨骼疾病，是一種以骨密度低、骨組織微結構損傷，導致的骨脆性增加，最終易于發生骨折為特點的全身性骨病[10]。臨床試驗研究表明，獨活寄生湯能夠一定程度上改善骨質疏松患者的臨床癥狀增加骨密度[11]。但是目前有關于獨活寄生湯對PMOP的分子作用機制尚不完全清楚。因此，本研究通過網絡藥理學與生物信息學聯合篩查獨活寄生湯對PMOP的分子作用機制。

通過檢索TCMSP數據庫，共計檢索獨活寄生湯中茯苓、甘草、秦艽、白頭翁、大棗、黃連、杜仲、川牛膝、熟地、秦皮、赤芍、黃芩、黃柏、黨參、人參、干姜、防風、白術、獨活、桑寄生、半夏、川芎、當歸、細辛24味中藥并按照獨活寄生湯中各味中藥活性成分OB≥30%和DL≥0.18篩選得到有效活性化合物334中，涉及相關靶基因313個。進一步，通過生物信息學和GeneCards篩選得到PMOP患者差異表達基因971個，上調的基因541個，表達下調的基因430個。將獨活寄生湯涉及相關基因與PMOP有關基因取交集得到19個可能參與獨活寄生湯治療PMOP。最后對相關基因與有效活性化合物進行Cytoscape軟件處理得到134個節點和157條邊。以上篩查結果表明，獨活寄生湯治療PMOP具有多成分多靶點的特點。最后，通過GO功能和KEGG通絡富集分析得到獨活寄生湯治療PMOP的主要信號通路包括Fluid shear stress and atherosclerosis(hsa05418)、Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450、p53signaling pathway等，而GSTM1、GSTM2、CCND1、CD40LG、IL-4及 FOS是各通路主要的富集基因。p53信號通路廣泛涉及細胞增殖、凋亡等生物學過程。其中p53 是一種抑癌基因，其在細胞衰老中發揮重要作用。研究證實，p53能夠通過作用細胞有絲分裂進而影響p53和p21基因，激活相關基因表達，最終引起細胞復制性衰老[12-15]。細胞凋亡是機體的一種正常生理學過程，其是以caspase-3活化繼而誘導細胞凋亡小體形成最終被吞噬細胞吞噬處理[16]。以往研究均已證實，棕櫚酸能夠通過活化p53/p21信號誘導骨骼肌細胞衰老，同時上調caspase-3，下調Bcl-2誘導細胞凋亡增加，導致肌少癥[17-18]。另外研究表明，在骨質疏松癥大鼠模型中，p53和p21表達均顯著上調，給予槲皮素后能夠調控p53/p21途徑，抑制骨細胞樣細胞衰老，挽救雌激素缺乏導致的骨丟失[19]。以上研究均表明，p53信號通路在骨質疏松癥中發揮重要作用。因此，本研究通過構建PMOP大鼠模型探究獨活寄生湯能否通過p53信號途徑改善PMOP。結果發現，與假手術組比較，模型組大鼠骨密度、剛度和最大載荷均降低。與模型組比較，給予獨活寄生湯能夠升高骨密度、剛度和最大載荷。以上研究結果表明，獨活寄生湯能夠改善PMOP。為進一步探究相關分子作用機制，通過Western blot檢測凋亡相關蛋白以及p53和p21表達。與假手術組比較，模型組caspase-3表達升高，Bcl-2表達降低，p53和p21蛋白表達均升高。與模型組比較，獨活寄生湯藥物干預組caspase-3表達降低，Bcl-2表達升高，p53和p21蛋白表達均降低。

綜上所述，獨活寄生湯治療PMOP具有多成分多靶點特性，其可能通過p53信號通路抑制細胞凋亡和衰老改善PMOP臨床癥狀。以上研究為獨活寄生湯治療PMOP提供了新的理論依據。