顯微紅外光譜法聯合其他手段剖析6批問題清火片的造假本質

艾 蕓， 許苗苗， 張 楠， 李 媛， 張 鑫， 王舒懿， 謝志民

(西安市食品藥品檢驗所，陜西 西安 710054)

清火片是一種常用的清火解毒類中藥制劑，具有清熱瀉火、通便之功效，用于治療咽喉腫痛、牙痛、頭目眩暈、口鼻生瘡、風火目赤、大便不通[1]，收載于《中華人民共和國衛生部藥品標準》中藥成方制劑第二冊[2]，由大黃、石膏、薄荷腦、大青葉組成，該制劑生產工藝中除了大青葉煎煮濃縮外，其余3味中藥均以粉末形式參與入藥。西安市食品藥品檢驗所在承擔2018年國家藥品評價性抽驗檢驗過程中發現，某生產企業生產的6批清火片在顯微鏡下可見大量不應有的礦物碎塊，為了確定其性質，本實驗進行了顯微紅外光譜鑒定、總灰分檢查、酸不溶性灰分檢查、鋁元素含量測定、有機染料檢查，揭示了其造假本質。

顯微紅外光譜法是將顯微鏡技術應用到紅外光譜儀中，并將顯微鏡的直觀成像和紅外光譜的官能團化學分析相結合，不僅能對物體進行形貌成像，而且還可提供物體空間各個點的光譜信息[3]，作為將光譜分析和圖像技術相結合的一種新型技術，它具有高精度、高靈敏度、快速、無損、可視化和無污染等優點，能選擇樣品的不同部位的紅外光譜圖像進行分析，從而得到測量位置處物質的分子結構、官能團等信息，是了解未知物質分子組成的強有力的方法[4-5]。因此，本實驗采用該方法對6批問題清火片進行研究。

1 材料

1.1 儀器 IRTracer-100傅里葉變換紅外光譜儀、AIM-9000紅外顯微鏡、UHPLC Nexera X2系列超高效液相色譜儀(配置8060三重四級桿串聯質譜儀)、LC2010AHT高效液相色譜儀(配置DAD檢測器)(日本Shimadzu公司)；iCAP 7000電感耦合等離子體發射光譜儀(美國Thermo公司)；Ethos-One微波消解儀(意大利Milestone公司)；光學顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 試劑與藥物 亮藍(批號112010-201501，中國食品藥品檢定研究院)；鋁標準溶液(1 000 μg/mL，GSB04-1713-2004，國家有色金屬及電子材料分析測試中心)。清火片(批號161002、170301、170401、170402、170501、180401，國內某生產企業)。硝酸為優級純(德國Merck公司)；氫氟酸為UP級(蘇州晶瑞化學股份有限公司)。

2 方法與結果

2.1 顯微鑒別 取本品粉末適量，用稀甘油裝片后在顯微鏡下觀察，發現無機結晶團塊眾多，透明或半透明；淡藍色碎塊棱角明顯，邊緣黑色，表面可見藍黑色色素顆粒；水合氯醛透化后，可見小圓洞或裂隙；大黃的特征稀少，零星可見糊化淀粉粒團塊和草酸鈣簇晶。見圖1。

圖1 6批樣品顯微特征圖

2.2 礦物碎塊性質確定

2.2.1 總灰分 取本品10片，除去糖衣，稱定質量，計算片芯平均質量，研細，取約2 g，精密稱定，按照灰分測定法[6]測定，結果見表1。按照質量標準處方和制法，本品每片含大黃100 mg、石膏50 mg、薄荷腦6.5 mg、大青葉400 mg(煎煮)；企業操作規程顯示，本品每片加淀粉75 mg。大黃總灰分按10%(藥典規定限度)計算，大青葉出膏率按5%計算，石膏(CaSO4·2H2O)含水量按19%計算，則本品每片含非灰分200 mg，最大總灰分分別為平均片重的16.04%(161002)、15.50%(170301)、14.16%(170401)、18.57%(170402)、14.46%(170501)、16.60%(180401)，測定結果分別超出52.76%(161002)、61.58%(170301)、63.62%(170401)、60.90%(170402)、63.08%(170501)、60.60%(180401)，表明該企業在生產時非法添加了52.8%～63.6%以上無機礦物質，與顯微鏡下觀察到的大量無機結晶碎塊一致。

表1 6批樣品片芯中總灰分、酸不溶性灰分、鋁含量測定結果

2.2.2 顯微紅外光譜 將本品除去糖衣，研細，取少量粉末平鋪于鋁鏡上，顯微鏡下選擇邊緣顯藍黑色的無機團塊，在4 000～400 cm-1范圍內反射法測定吸光度(檢測器MCT；分辨率8 cm-1；掃描次數50次；動鏡速度20；變跡函數Sqr Triangle)，并與標準譜庫進行比較，發現批號161002、170301、170401、170402、170501均易檢出無機顏料群青藍(Na6Al6Si6O24S4)，而批號180401由于其他物質干擾導致其檢出稍難，見圖2～3。

圖2 藍色碎塊顯微圖譜

圖3 藍色碎塊紅外圖譜

2.2.3 酸不溶性灰分 取上述總灰分，按照灰分測定法[6]測定，結果見表1。由此可知，企業非法添加的無機礦物質主要是硅酸鹽類化合物，印證了顯微紅外光譜結果。

2.2.4 鋁含量測定 取本品粉末約0.1 g，精密稱定，置于聚四氟乙烯消解罐中，精密加入硝酸8 mL、雙氧水4 mL、氫氟酸2 mL，浸泡4 h，置于微波爐內中，趕酸至消解液剩余2～3 mL，加水定容至25 mL聚乙烯塑料量瓶中，作為供試品溶液。同法制備空白溶液。

采用電感耦合等離子發射光譜法測定[6](檢測波長396.152 nm；RF發射功率1 150 W；蠕動泵轉速50 r/min；輔助氣體積流量0.5 L/min；載氣體積流量0.70 L/min；冷卻氣體積流量12.0 L/min；載氣壓力0.6 MPa；沖洗時間30 s；重復測定3次；鋁標準溶液0.4、0.8、1.6、3.2、4.0、8.0 μg/mL，回歸方程Y=10 080X，r=0.999 9)，結果見表1，印證了顯微紅外光譜結果。

2.3 亮藍檢查

2.3.1 TLC法 取本品5片，除去包衣，研細，加10 mL甲醇超聲處理20 min，取出，3 000 r/min離心5 min，取上清液，作為供試品溶液；另取亮藍對照品，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，作為對照品溶液。按照薄層色譜法[6]，吸取上述2種溶液各10 μL，點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-正丁醇-無水乙醇-濃氨-水(2∶12∶2.6∶0.6∶2.8)為展開劑，展開，取出，晾干，結果見圖4。由此可知，6批樣品TLC色譜圖中均有與亮藍對照品對應的斑點。

1.161002 2.170401 3.170402 4.170301 5.1705016.180401. 7.亮藍對照品圖4 亮藍TLC色譜圖

2.3.2 HPLC-DAD法分析

2.3.2.1 色譜條件與系統適用性試驗 流動相甲醇(A)-0.02 mol/L乙酸銨(B)，梯度洗脫，程序見表2；體積流量1.0 mL/min；DAD檢測器，檢測波長254 nm。理論塔板數按亮藍峰計，不低于5 000。

表2 梯度洗脫程序

2.3.2.2 對照品溶液制備 取“2.3.1”項下對照品溶液，甲醇制成每1 mL含20 μg該成分的溶液，即得。

2.3.2.3 供試品溶液制備 取“2.3.1”項下供試品、對照品溶液，點于硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-正丁醇-無水乙醇-濃氨-水(2∶12∶2.6∶0.6∶2.8)為展開劑，展開，取出，晾干，刮取樣品中亮藍對應的條斑，加5 mL甲醇溶解，離心，取上清液，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.3.2.4 色譜分析 精密吸取“2.3.2.2”項下對照品溶液、“2.3.2.3”項下供試品溶液各20 μL，在“2.3.2.1”項色譜條件下進樣測定，結果見圖5。由此可知，6批樣品在亮藍對照品色譜圖相應位置上均顯示相同紫外吸收的色譜峰。

1.亮藍圖5 亮藍HPLC-DAD色譜圖

2.3.3UHPLC-MS/MS法

2.3.3.1色譜條件Shim-packGISTC18色譜柱(100mm×2.1mm，2μm)；流動相乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，梯度洗脫(0～3min，10%～25%A；3～12.5min，25%～98%A；12.5～13min，98%～10%A)；體積流量0.4mL/min；柱溫30℃；進樣量2μL。色譜圖見圖6。

圖6 亮藍總離子流圖及二級質譜圖

2.3.3.2質譜條件ESI正離子源，溫度300℃；脫溶劑管溫度250℃；加熱塊溫度400℃；霧化氣體積流量3.0L/min；加熱氣體積流量10.0L/min；干燥氣體積流量10.0L/min；采用多反應監測(MRM)模式測定，m/z793.20～623.15,713.15；碰撞電壓-45、-39eV。

2.3.3.3對照品溶液制備 取“2.3.2.2”項下對照品溶液，加甲醇制成每1mL含100ng該成分的溶液，即得。

2.3.3.4供試品溶液制備 精密吸取“2.3.2.3”項下供試品溶液1mL，置于100mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，0.22μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.3.3.5色譜分析 精密吸取“2.3.3.3”項下對照品溶液、“2.3.3.4”項下供試品溶液各2μL，在“2.3.3.1”和“2.3.3.2”項條件下進樣測定，結果見圖6。由此可知，6批樣品色譜圖中均出現與亮藍對照品色譜保留時間一致的色譜峰。

3 討論

6批涉嫌摻假清火片總灰分、酸不溶性灰分分別為68.8%～79.5%、52.5%～62.2%，表明企業可能非法添加了硅酸鹽類無機礦物質，顯微紅外光譜法進一步檢查結果顯示，推測此無機礦物為染料群青藍(Na6Al6Si6O24S4)。再采用ICP-OES法測定元素含量，發現鋁含量較高，由于鋁并非人體所必需的元素[7]，攝入后很難被代謝，當蓄積量超出人體所能承受的范圍后會導致中樞神經紊亂，影響智力發育和骨骼病變[8-10]。我國對于不同類型食品中鋁添加劑的使用進行了明確規定，例如國家標準GB 2760-2014要求面制品中鋁的殘留量≤100 mg/kg[11]。

近年來，中藥外源性有害物質殘留越來越受到關注[12-14]。本實驗發現，6批問題清火片中鋁含量高達296.38～2 135.78 mg/kg，嚴重超出了正常限量，需引起關注，同時TLC、HPLC-DAD、UHPLC-MS/MS檢查結果顯示，里面還非法添加了有機染料亮藍。由此可知，它們均為造假產品，已建議對涉嫌造假的企業進行飛行檢查，嚴肅處理，國家藥品監督管理局也已要求當地藥品監管部門控制其銷售。另外，清火片現行質量標準已不能有效控制藥物質量，故建議對其進行補充完善，以期保證用藥有效性和安全性。