茶藨子木層孔菌化學成分及其抗腫瘤活性

鮑夢雨， 曹宸貞， 李媛媛， 劉玉紅， 馬 艷

(山東中醫藥大學藥學院，山東 濟南 250355)

針層孔菌屬為擔子菌亞門、層菌綱、非褶菌目、銹革孔菌科[1]，現有研究表明，該屬真菌含有多糖、甾體類、萜類、黃酮類等活性成分，具有抗腫瘤、增強免疫、抗氧化等生物活性，呈現很好的市場開發前景[2]。

茶藨子木層孔菌Phellinusribis，為針層孔菌屬藥用真菌，寄生于山楂、梨樹的活體根莖上[3]，主要分布于中國、日本、韓國。目前，國內外已經從茶藨子木層孔菌中分離得到多糖類、色素類、神經酰胺類、苯駢呋喃類成分[4-6]，并且發現它們有抗腫瘤、增強免疫、神經保護等活性[7-9]。為了進一步開發利用茶藨子木層孔菌資源，本實驗對其甲醇提取物進行分離純化，從中得到4個化合物，均為苯乙烯基吡喃酮衍生物。其中，化合物1～4均為首次從本真菌中分離得到，對肝癌HepG2的增殖均顯示抑制作用，以1最顯著。

1 材料

JMS-700高分辨質譜儀(日本捷歐路公司)；Inova-600型核磁共振儀(美國Varian公司)；半制備液相色譜儀(日本分光Jasco公司)；柱色譜硅膠(63～210 μm，日本關東化學株式會社)；薄層色譜硅膠GF254(德國Merck公司)；Sephadex LH-20(美國GE Healthcare公司)；Cosmosil 5C18-MS-Ⅱ半制備色譜柱(10 mm×250 mm，5 μm，日本Nacalai公司)。所用試劑均為分析純或色譜純。

茶藨子木層孔菌采集于濟南歷城山區，由山東中醫藥大學生藥學教研室徐凌川教授鑒定為正品。

2 提取與分離

取1.8 kg茶藨子木層孔菌的干燥粗粉，用甲醇室溫浸提30 d，提取液減壓濃縮得浸膏20 g，浸膏用硅膠柱色譜進行初步分離，用二氯甲烷、二氯甲烷-乙酸乙酯(9∶1、1∶1)、乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲醇(9∶1、7∶3、1∶1)依次洗脫，合并后得到7個流分Fr.1～7。

Fr.4經Sephadex LH-20(甲醇)得9個部分(Fr.4.1～Fr.4.9)，Fr.4.5經制備HPLC甲醇-水(1∶1)分離純化，得組分Fr.4.5.6，再經制備薄層氯仿-甲醇(7∶3)，得化合物4(1.5 mg)。流分Fr.3用Sephadex LH-20(甲醇)分離，合并得到8個組分Fr.3.1～Fr.3.8，Fr.3.5用硅膠柱色譜氯仿-甲醇(20∶1)處理，再經HPLC柱甲醇-水(65∶35)制備，得化合物1(5 mg)；Fr.3.7經HPLC制備純化，用丙酮-水(32∶68，1%TFA)洗脫，得組分Fr.3.7.4(4.4 mg), 溶于500 μL甲醇，靜置72 h，上清為化合物2(1.2 mg)，沉淀為化合物3(1.8 mg)。

3 結構鑒定

化合物1：黃色粉末(甲醇)，分子式C23H16O8。HRFAB-MSm/z: 421.089 8[M+H]+。1H-NMR (600 MHz，丙酮-d6)δ: 7.36 (1H，d，J=2.2 Hz，H-6′)，7.35 (1H，d，J=16.1 Hz，H-7)，7.26 (1H，dd，J=8.3，2.1 Hz，H-10′)，7.19 (1H，d，J=1.9 Hz，H-9)，7.06 (1H，dd，J=8.3，1.9 Hz，H-13)，6.93 (1H，d，J=8.3 Hz，H-9′)，6.90 (1H，s，H-4)，6.88 (1H，d，J=8.3 Hz，H-12)，6.83 (1H，d，J=15.9 Hz，H-6)，2.67(3H，s，1′-CH3)；13C-NMR (150 MHz，丙酮-d6)δ:158.3 (C-1)，109.2 (C-2)，161.1(C-3)，95.7 (C-4)，159.2 (C-5)，117.5 (C-6)，135.5 (C-7)，128.9 (C-8)，114.6 (C-9)，146.4 (C-10)，147.9 (C-11)，116.5 (C-12)，121.6 (C-13)，32.2 (C-1′)，196.9 (C-2′)，119.4 (C-3′)，154.8 (C-4′)，121.3 (C-5′)，115.3 (C-6′)，145.9 (C-7′)，148.4 (C-8′)，116.3 (C-9′)，120.9 (C-10′)。以上數據與文獻[10]基本一致，故鑒定為inoscavin C。

化合物2：深黃色無定型粉末，分子式C21H14O7。HRFAB-MSm/z: 401.064 6[M+Na]+。1H-NMR (600 MHz，CD3OD)δ: 7.30 (1H，d，J=15.9 Hz，H-2′)，7.20 (1H，d，J=2.1 Hz，H-2″)，7.16 (1H，dd，J=8.2，2.1 Hz，H-6″)，7.04 (1H，d，J=2.1 Hz，H-4′)，6.96 (1H，s，H-3)，6.94 (1H，dd，J=8.5，2.1 Hz，H-8′)，6.83(1H，d，J=8.2 Hz，H-5″)，6.83 (1H，s，H-7)，6.77 (1H，d，J=8.2 Hz，H-7′)，6.70 (1H，d，J=15.8 Hz，H-1′)；13C-NMR (150 MHz，CD3OD)δ:158.3 (C-2)，100.3 (C-3)，161.3 (C-4)，158.6 (C-6)，96.5 (C-7)，117.4 (C-1′)，135.5 (C-2′)，129.3 (C-3′)，114.7 (C-4′)，146.8 (C-5′)，148.3 (C-6′)，116.6 (C-7′)，121.6 (C-8′)，122.4 (C-1″)，112.7 (C-2″)，146.9 (C-3″)，148.0 (C-4″)，116.8 (C-5″)，117.9 (C-6″)，112.3 (C-3a)，162.7 (C-7a)。以上數據與文獻[11]基本一致，故鑒定為phellifuropyranone A。

化合物3：黃色粉末，分子式C20H12O8。HRFAB-MSm/z: 381.060 3[M+H]+。1H-NMR (500 MHz，CD3OD)δ:8.41 (1H，s，H-7)，7.60 (1H，s， H-10)，7.42 (1H，d，J=15.9 Hz，H-2′)，7.08 (1H，d，J=1.9 Hz，H-4′)，6.99 (1H，dd，J=8.5，1.9 Hz，H-8′)，6.79(1H，d，J=8.3 Hz，H-7′)，6.70 (1H，d，J=15.8 Hz，H-1′)，6.52 (1H，s，H-4)；13C-NMR (125 MHz，CD3OD)δ:162.0 (C-1)，160.5 (C-3)，99.9 (C-4)，161.2 (C-6)，115.4 (C-7)，148.2(C-8)，155.2 (C-9)，111.8 (C-10)，116.3 (C-1′)，138.1 (C-2′)，128.8 (C-3′)，114.9 (C-4′)，146.9 (C-5′)，149.1 (C-6′)，116.6 (C-7′)，122.3 (C-8′)，162.7 (C-4a)，112.6 (C-6a)，129.1 (C-10a)，100.6 (C-10b)。以上數據與文獻[12]基本一致，故鑒定為phelligridin D。

化合物4：橙黃色粉末，分子式C25H18O9。HRFAB-MSm/z: 463.103 8[M+H]+。1H-NMR (600 MHz，CD3OD)δ: 7.43 (1H，d，J=15.9 Hz，H-7)，7.08 (1H，d，J=1.9 Hz，H-9)，6.99 (1H，dd，J=8.8，1.9 Hz，H-13)，6.79 (1H，d，J=8.2 Hz，H-12)，6.74 (1H，d，J=15.2 Hz，H-6)，6.74 (1H，d，J=8.9 Hz，H-10′)，6.70(1H，d，J=2.1 Hz，H-7′)，6.58 (1H，dd，J=8.3，2.1 Hz，H-11′)，6.49 (1H，s，H-4)，5.65 (1H，s，H-5′)，5.57 (1H，s，H-2′)，1.97 (3H，s，1′-CH3)；13C-NMR (150 MHz，CD3OD)δ:160.6 (C-1)，99.5 (C-2)，176.8 (C-3)，95.5 (C-4)，167.0 (C-5)，117.3 (C-6)，139.9 (C-7)，128.5 (C-8)，115.1 (C-9)，146.9 (C-10)，149.4 (C-11)，116.6 (C-12)，122.6 (C-13)，192.9 (C-1′)，105.1 (C-2′)，203.1 (C-3′)，94.5 (C-4′)，95.9 (C-5′)，123.2 (C-6′)，115.5 (C-7′)，146.3 (C-8′)，147.8 (C-9′)，115.9(C-10′)，120.2(C-11′)，16.6(C-1′CH3)。以上數據與文獻[13]基本一致，故鑒定為inoscavin A。

4 抗腫瘤活性篩選

參照文獻[14]方法，測定化合物1～4在不同濃度下對肝癌HepG2細胞的抑制率。實驗組每孔加入20 μL樣品溶液，終濃度分別為5、10、20、40、80、160 μmol/L，同時設空白對照組、陽性對照組(5-Fu，終濃度為80 μmol/L)，每組重復6次，結果見圖1。由此可知，化合物1～4對肝癌HepG2細胞增殖的抑制活性在5～160 μmol/L濃度范圍內呈現出較好的劑量依賴性；在濃度為160 μmol/L時，各化合物對HepG2細胞的抑制率分別為71.8%、63.1%、45.2%、56.5%，即1抑制作用較強。

圖1 各化合物對HepG2細胞的抑制作用Fig.1 Inhibitory effects of various compounds on HepG2 cells

5 討論

茶藨子木層孔菌在中國、韓國作為傳統藥物被用于抗腫瘤[15]，療效確切，以往對其抗腫瘤活性的研究主要集中在水溶性大分子多糖類成分[16]，關于其小分子成分及抗腫瘤活性篩選的報道較少。本實驗在前期研究的基礎上，從茶藨子木層孔菌中分離鑒定出了4個苯乙烯基吡喃酮類化合物，均為首次從該真菌中分離得到。

據文獻報道，化合物1、4具有清除自由基和抑制Hela229細胞增殖的潛力[17]；化合物2、3對小鼠黑色素瘤和人肺癌細胞株的增殖有抑制作用，兩者GI50值分別為5.6～31.3、7.1～22.6 μmol/L[11]。另外，化合物4有強效脂氧合酶抑制活性[18]，化合物3還具有抗炎、抗氧化作用[19]，證明茶藨子木層孔菌具有較好的藥物開發前景。

本研究顯示，化合物1～4均具有明顯的抑制肝癌HepG2細胞增殖的活性，并在5～160 μmol/L濃度范圍內呈現出較好的劑量依賴性。其中，化合物1較化合物2對肝癌HepG2細胞的抑制作用強，可能是前者、結構多1個醛基；化合物4對肝癌HepG2細胞的抑制作用較化合物2弱，其結構多1個五元環，可能破壞了呋喃并吡喃酮環的平面性，后期可進一步考察其構效關系。本實驗豐富了茶藨子木層孔菌活性成分的研究，并為苯乙烯基吡喃酮類成分抗腫瘤的作用機制研究提供了參考，也為后期該真菌藥理活性研究提供了依據。