基于網絡藥理學及分子對接研究梔子抗缺血性腦卒中的分子機制

孫 瑜， 蔡 媛， 沈冰冰， 李鵬輝， 鄧天好， 彭艷梅

(1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南省中醫藥研究院，湖南 長沙 410006)

缺血性腦卒中是腦卒中的一種常見類型，占腦卒中總數的85%[1]，隸屬于中醫中風范疇。“毒損腦絡”病機假說認為中風主要因為機體邪氣郁積日久而化熱，生風動血，以熱毒侵犯腦絡所致，主張以清熱解毒法治療中風[2-3]。梔子是茜草科植物梔子GardeniajasminoidesEllis的成熟果實，《神農本草經》記載梔子“味苦，性寒，主五內邪氣，胃中熱氣”，具有瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒之功效。現代藥理研究表明，梔子具有抗炎、鎮痛、保肝利膽、降血糖、降血壓等作用[4]。近年來研究發現梔子在臨床上治療缺血性腦卒中應用廣泛，含有梔子的中藥復方有很多，如清開靈注射液[5]、醒腦靜注射液[6]、天麻鉤藤飲[7]、安宮牛黃丸[8]、黃連解毒膠囊[9]、治郁顆粒[10]等。目前關于梔子在缺血性腦卒中的藥理作用研究開展比較廣泛，大量研究表明梔子中活性成分對于缺血性腦卒中有預防和保護作用，其機制包括抗氧化應激[11]、抗凋亡[12]、保護血腦屏障等[13]。然而，這些研究都是單一或主要指標成分針對單一靶標或單一通路，對于梔子治療缺血性腦卒中活性成分整體作用的分子機制還不明確。

網絡藥理學是建立在組學數據分析、虛擬計算及網絡數據庫檢索基礎上的生物信息網絡構建及網絡拓撲結構分析策略，其系統性與中醫藥的整體觀相吻合[14]。近年來網絡藥理學在中藥研究中的應用促進了中藥從“單一靶點、單一成分”向“多靶點、多組分”的轉變，為中藥藥效物質基礎研究、闡述中藥治療作用整體機制提供了新手段。本文旨基于網絡藥理學和分子對接的方法分析梔子治療缺血性腦卒中的分子機制，以期為后續實驗研究提供理論參考。其具體流程分析見圖1。

圖1 梔子治療缺血性腦卒中的網絡藥理學及分子對接分析流程圖Fig.1 Network pharmacology and molecular docking flowchart of Gardeniae Fructus in treatment for cerebral ischemic stroke

1 方法

1.1 梔子中活性成分篩選和靶點預測 通過檢索中藥系統藥理學數據庫與分析平臺 (Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)，以口服生物利用度(oral bioavailabity,OB)≥30%、類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18的2個藥代動力學屬性值進行梔子活性成分及其作用靶標篩選，并根據已發表的文獻報道補充未預測到的活性化合物及其已知靶點。篩選結束后，在Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org)將化合物作用靶標進行基因名的轉化和規范。

1.2 梔子治療CIS相關靶點的獲得 利用Gene Cards(https://www.genecards.org/)、OMIM(http://www.omim.org/)數據庫，以“Ischemic stroke”、“Cerebral ischemia”、“Cerebral ischemic stroke”為關鍵詞進行檢索，刪除重復靶點，得到CIS發病過程已知靶點，在Uniprot數據庫中將疾病基因靶點進行規范。利用Venny 2.1(http://bionfoggp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)在線工具繪制梔子活性成分與CIS相關靶點的韋恩圖，并獲得交集靶點。

1.3 “疾病-成分-靶點”網絡模型的構建 將“1.1”“1.2”項下活性成分、靶點及疾病關系導入Cytoscape軟件以完成相關網絡構建，其中“節點”(node)表示藥物、分子、靶點、疾病，“邊”(edge)表示節點之間的關系。采用network analyzer插件進行網絡特征分析，以度值(degree)大小反映節點大小，介數值(betweenness)反映邊粗細，從而明確梔子中抗CIS較為重要的成分及相互作用力度。

1.4 梔子治療CIS蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡的構建 根據已經得到的疾病與梔子有效成分的交集靶點，利用STRING平臺(物種選擇Homosapiens)建立PPI網絡，并導入Cytoscape軟件中，通過網絡拓撲分析得出度值(degree)和緊密值(combined scores), 以度值大小反映節點的大小和顏色，緊密值反映邊的粗細和顏色，再利用MCODE插件和CytoHubba插件得出網絡中連接最為緊密的子網絡和核心靶點。

1.5 GO、KEGG富集分析 利用Metascape(https://metascape.org/)輸入交集靶點，對GO Biological Process、GO Molecular Function、GO Cellular Component、KEGG Pathway進行全面富集，預測靶點的功能分布，設定P<0.01。

1.6 分子對接 從PDB數據庫(https://www.rcsb.org/)中以物種選擇為Homosapiens、蛋白分辨率為2.0～3.0為條件，搜索并下載血管內皮生長因子A(vascular endothelia growth factor A，VEGFA)、絲裂原激活蛋白激酶8(mitogen-activated protein kinase 8，MAPK8)、白細胞介素6(interleukin 6，IL6)的3D結構PDB格式文件。利用MOE軟件對蛋白進行優化(去水、加氫、計算電荷、能量最小化等)后與從TCMSP中下載的小分子(mol 2格式)進行對接，選取結合能≤-5.0 kJ/mol[15]者作為梔子抗缺血性腦卒中的活性成分篩選依據。

2 結果

2.1 目標成分靶點預測 通過對TCMSP數據庫中已報道的梔子成分及其藥代動力學參數的相關檢索，共搜集到活性成分98種。同時，根據OB和DL參數結合文獻[16-19]對梔子活性成分進行篩選，共搜集到入血活性成分17種，見表1。利用相關靶點預測技術對上述活性成分進行作用靶點預測，排除重復靶點，并用Uniprot數據庫對基因靶點進行規范，共獲得預測靶點97個。

表1 梔子中活性成分

2.2 CIS相關基因及其與梔子活性成分相關的靶點 利用Gene Card、OMIM數據庫，以“Ischemic stroke”、“Cerebral ischemia”、“Cerebral ischemic stroke”為關鍵詞進行檢索，分別發現4 333、101個靶點，刪除重復靶點，在Uniprot數據庫將疾病基因靶點進行規范，得到總靶點數4 409個。通過Venny 2.1在線工具繪制梔子活性成分靶點與CIS相關靶點的韋恩圖，并得到交集靶點共80個，見圖2。

圖2 梔子活性成分靶點與缺血性腦卒中相關靶點的韋恩圖Fig.2 Venn diagram of targets for active constituents of Gardeniae Fructus and cerebral ischemic stroke-related targets

2.3 “疾病-成分-靶點”網絡模型 通過Cytoscape軟件構建的網絡共獲得94個節點和237個關系，如表2、圖3所示。

表2 梔子治療缺血性腦卒中的活性成分

圖3 “疾病-成分-靶點”網絡圖Fig.3 Disease-constituents-targets network diagram

2.4 蛋白相互作用網絡構建與核心靶點篩選 蛋白互作網絡(protein protein interaction network, PPI network)見圖4A。由于PPI網絡中蛋白質的相互關系復雜程度不同，存在著部分復雜程度較高的區域(dense regions)，是PPI網絡中潛在的子網絡，其連線密度較高，具有重要生物學意義，故再利用Cytoscape軟件中的MCODE插件及過分子復合物檢測算法對相互作用關系進行分析，比較score大小得到region，見圖4B。為了更加精確地找到梔子抗缺血性腦卒中的核心靶點，通過CytoHubba插件進行MCC運算，得到核心靶點，其中前十個見圖5。

圖4 梔子-缺血性腦卒中靶點PPI網絡(A)及其靶點子網絡(B)Fig.4 Gardeniae Fructus-cerebral ischemic stroke stroke target PPI network(A) and its target subnet(B)

圖5 按MCC法排名的前10個靶點Fig.5 Top 10 targets ranked by MCC method

2.5 GO、KEGG富集分析 Metascape平臺擁有全面的注釋功能，并且每月更新基因注釋的數據資料[20- 21]，本研究采用該平臺對梔子治療缺血性腦卒中相關靶點進行信號通路分析，結果如圖6所示。由此可知，梔子治療缺血性腦卒中主要參與的生物學過程包括細胞對激素刺激的反應(cellular response to hormone stimulus)、對無機物的反應(response to inorganic substance)、對異源生物刺激的反應(response to xenobiotic stimulus)、對酮的反應(response to ketone)、細胞對氮化合物的反應(cellular response to nitrogen compound)、凋亡信號通路(apoptotic signaling pathway)。相關靶點治療缺血性腦卒中的功能主要富集于轉錄因子結合(transcription factor binding)、核受體活性(nuclear receptor activity)、激酶結合(kinase binding)、激活轉錄因子結合(activating transcription factor binding)、泛素蛋白連接酶結合(ubiquitin-like protein ligase binding)等。主要參與的細胞組分包括膜筏(membrane raft)、質膜蛋白復合物(plasma membrane protein complex)、轉錄因子復合物(transcription factor complex)等。

圖6 GO功能分析Fig.6 GO function analysis

另外，梔子治療缺血性腦卒中涉及的通路包括液體剪切應力和動脈粥樣硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)、MAPK、核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)、VEGF信號通路、血小板活化(platelet activation)等，見圖7、表3。

圖7 KEGG富集分析前20條通路Fig.7 Top 20 channels by KEGG enrichment analysis

表3 KEG富集分析結果

2.6 梔子有效成分與VEGFA、MAPK8、IL6的分子對接 將12種有效成分與核心靶點VEGFA、MAPK8、IL6所對應的蛋白復合晶體進行對接，結果見圖8，可知VEGFA與亞油酸乙酯、藏紅花酸、β-谷甾醇的結合能最小，MAPK8與京尼平苷、亞油酸乙酯、5-羥基-7-甲氧基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)色酮的結合能最小，IL6與亞油酸乙酯、豆甾醇、京尼平苷的結合能最小。綜上所述，MOL001494(亞油酸乙酯)、MOL001406(藏紅花酸)、MOL000358(β-谷甾醇)、MOL004557(京尼平苷)、MOL003095[5-羥基-7-甲氧基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)色酮]、MOL000449(豆甾醇)與VEGFA、MAPK8、IL6結合較好，其分子對接模型見圖9。

圖8 分子對接結果Fig.8 Results of molecular docking

圖9 分子對接的最優復合結構及相互作用Fig.9 Optimal composite structures and interactions of molecular docking

3 討論

本研究通過構建“疾病-成分-靶點”網絡模型進行拓撲分析，共得到梔子治療CIS的12個核心成分，即藏紅花酸、京尼平、歐前胡素、梔子苷、蘇丹紅三、槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、豆甾醇、亞油酸乙酯、5-羥基-7-甲氧基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)色酮、異山柰素，這些化合物均有相關文獻報道[22-25]，說明網絡藥理學研究方法中篩選參數及模型構建合理。根據degree值可知槲皮素、山柰酚作用靶點最多，說明槲皮素和山柰酚在梔子治療CIS發揮重要作用。楊冉等[26]研究表明槲皮素通過氧化應激反應對腦缺血再灌注大鼠的血腦屏障具有保護作用。此外，山柰酚[27]可通過抑制TLR4和NF-κB來減少炎癥因子TNF-α和IL-1β的水平從而改善大鼠腦缺血再灌注神經功能。

通過PPI網絡拓撲分析，梔子治療CIS的核心靶點包括VEGFA、MAPK8、IL6等。其中，VEGFA是一種促血管生成因子，主要富集于VEGF信號通路，David 等[28]研究發現，VEGFs在腦損傷和缺氧的雙重刺激下，VEGF 能通過促進缺血半暗帶內殘存毛細血管內皮細胞的增殖和遷移來促進血管的新生。MAPK8是細胞內的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[29]，該類激酶在腦缺血損傷中和缺血性神經元損傷中發揮重要作用。KEGG通路分析發現，梔子治療CIS與液體剪切應力和動脈粥樣硬化、MAPK、NF-κB、VEGF、血小板活化等信號通路相關，其大致可分為3個功能模塊：①抗炎機制，其中NF-κB信號通路中的NF-κB為下端的關鍵分子，對炎性因子的轉錄表達起著直接調控作用，抑制NF-κB通路可以阻止促炎細胞因子的產生[30]。②動脈粥樣硬化等血流速和血管相關機制。顱內動脈粥樣硬化是CIS的常見誘因。晚期動脈粥樣硬化會導致血小板活化、血管收縮、血栓形成，引發血流動力學，并導致CIS的形成。③綜合調控機制，如MAPK信號通路，其主要由細胞外信號調節激酶1/2、氨基末端激酶、p38 MAPK 和細胞外信號調節激酶54條信號轉導途徑組成[31]。p38 MAPK通路中p38不僅參與炎癥反應，還與缺血缺氧、炎癥因子、內毒素、高滲透壓、牽張和剪切應力等細胞應激時信號轉導有關[32]。進一步選取PPI核心靶點VEGFA、MAPK8、IL6分別與12個核心成分進行分子對接，結果顯示12個成分與3個靶點之間都有較好的結合能力，說明這12個核心成分可以直接與關鍵靶點相互作用，均為梔子治療CIS的潛在成分。

綜上所述，本研究以梔子為研究對象，通過網絡藥理學方法預測其治療CIS潛在的作用成分、靶標及通路，并結合分子對接進一步驗證成分與靶標的相互作用，從系統層面闡釋了梔子治療CIS具有多成分-多靶點-多通路的作用機制，為后續進一步探討和實驗設計的優化等提供了重要參考依據。