離子液體輔助提取牡丹皮中丹皮酚工藝的優化

唐一梅， 秦 蓓*， 張德柱， 王 錦

(1.西安醫學院藥學院藥物研究所，陜西 西安 710021；2.陜西盤龍藥業集團股份有限公司，陜西 西安 710025)

丹皮酚具有抑菌抗炎[1-2]、抗腫瘤[3-5]、增強免疫功能[6]等作用，在國際市場上售價較高。雖然我國丹皮資源豐富，但傳統提取工藝存在提取損失大、提取成本高等不足[7]，導致資源浪費。

離子液體是由有機陽離子和無機或有機陰離子組成的熔融鹽[8]，具有熱穩定性好、蒸氣壓低、溶解能力強等優點[9-17]，已用于有機合成[10-11]、電化學[12]、生物工程[13]、萃取技術[14-17]等領域。另外，離子液體結構的可設計性也可用于天然產物活性成分的提取與分離[18-19]。

本實驗研究了水蒸氣蒸餾法、回流法，不同溶劑體系及離子液體加入方式、種類、濃度對丹皮酚提取率的影響，發現[RMIM]Br-水體系回流(煎煮)時丹皮酚提取率最高；離子液體-水-水蒸氣蒸餾法能夠獲得大量揮發油，但丹皮酚含量極低，并且水蒸氣蒸餾法不能獲得此結果。與傳統提取工藝相比，離子液體輔助提取牡丹皮中丹皮酚、揮發油具有操作簡單、節約資源、節約能源等優點[7]，值得工業化推廣。

1 材料

1.1 試劑與藥物 1-甲基-3-丁基-咪唑溴([BMIM]Br)、1-甲基-3-己基咪唑溴([HMIM]Br)、1-甲基-3-辛基咪唑溴離子液體([OMIM]Br)均為自制。丹皮酚對照品(批號Y27F7Y17002，上海源葉生物科技有限公司)。牡丹皮(市售)經西安醫學院藥學院生藥教研室張彥老師鑒定為芍藥科植物牡丹PaeouiaSuffruicoatAndr.的干燥根皮。六氟磷酸鉀(分析純，薩恩化學技術有限公司)；甲醇(色譜純，美國Fisher公司)。

1.2 儀器 LC-1260高效液相色譜儀(美國安捷倫科技公司)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鄭州長城科工貿有限公司)；調溫型電熱套(北京科偉永興儀器有限公司)；SB-5200DT超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

2 方法與結果

2.1 牡丹皮中丹皮酚的提取

2.1.1 水蒸氣蒸餾法 取藥材5 g，置于250 mL圓底燒瓶中，加10倍量水超聲處理15 min，加熱蒸餾，收集餾出液，冷卻至室溫，置于4 ℃冰箱中冷藏24 h，濾過，25 ℃下干燥稱重，即得丹皮酚晶體。取3份藥材，同法提取3次，即得提取物晶體。

2.1.2 水-NaCl水蒸氣蒸餾法

2.1.2.1 不同加鹽量 取藥材5 g，置于250 mL圓底燒瓶中，加10倍量水，再分別加入0、0.5、0.75、1.0、1.25 g NaCl超聲處理15 min，加熱蒸餾，收集餾出液，冷卻至室溫，置于4 ℃冰箱中冷藏24 h，洗滌，濾過，25 ℃下干燥稱重，即得提取物晶體。每種方法各稱取3份藥材，同法提取3次。

2.1.2.2 不同浸泡時間 取藥材5 g，置于250 mL圓底燒瓶中，加10倍量水，在加入0.75 g NaCl分別浸泡1、2 h后超聲處理15 min，加熱蒸餾，收集餾出液，冷卻至室溫，置于4 ℃冰箱中冷藏24 h，洗滌，濾過，25 ℃下干燥稱重，即得提取物晶體。每種方法各稱取3份藥材，平行提取3次。

2.1.3 水-離子液體水蒸氣蒸餾法 取藥材5 g，置于250 mL圓底燒瓶中，按液料比10∶1進行提取(離子液體與水比例1∶9)，精密量取5.00 mL[OMIM]Br至圓底燒瓶中，先浸泡30 min，再加45 mL蒸餾水超聲處理15 min，加熱蒸餾提取，餾出液于4 ℃冰箱中冷藏24 h，同法操作3次，即得離子液體浸泡后加水、水-離子液體浸泡后的油狀提取物。

2.1.4 水體系回流 取藥材5 g，置于250 mL圓底燒瓶中，按液料比10∶1進行提取，超聲處理15 min，加熱回流提取2次，每次1 h，合并濾液，于水浴鍋上濃縮至適量。

2.1.5 [RMIM]Br-water體系回流

2.1.5.1 不同離子液體種類 取藥材5 g，置于250 mL圓底燒瓶中，按液料比10∶1進行提取(離子液體與水比例1∶9)，精密量取5.00 mL[RMIM]Br(R=butyl、hexyl、hexyl)至圓底燒瓶中，浸泡30 min，再加45 mL蒸餾水超聲處理15 min，加熱回流提取2次，每次1 h，合并濾液，于水浴鍋上濃縮至適量。

2.1.5.2 不同離子液體濃度的選擇 取藥材5 g，置于250 mL圓底燒瓶中，液料比為10∶1，分別按離子液體與水比例1∶15、1∶12、1∶6、1∶3進行提取，精密量取不同體積[OMIM]Br至圓底燒瓶中，浸泡30 min后加入不同體積蒸餾水超聲處理15 min，再加熱回流提取2次，每次1 h，合并濾液，于水浴鍋上濃縮至適量。

2.2 溶液制備和色譜條件

2.2.1 對照品溶液 精密稱取丹皮酚對照品10.12 mg，置于25 mL 量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 [RMIM]Br-water體系按[RMIM]Br與KPF6比例1∶1加入KPF6，乙酸乙酯反復洗滌，收集乙酸乙酯層，除去溶劑后甲醇定容至25 mL量瓶中，分別精密吸取1.00 mL，甲醇定容至10 mL量瓶中，搖勻，即得。

2.2.3 色譜條件 Agilent HC-ODS (2)色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動相甲醇-水(60∶40)；體積流量1 mL/min；檢測波長274 nm；進樣量10 μL。

2.3 線性關系考察 精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，在“2.2.3”項色譜條件下各進樣10 μL測定。以吸光度為縱坐標(A)，丹皮酚質量濃度為橫坐標(X)進行回歸，得方程為A=35.794X+241.30(r=0.999 1)，在20.44 ～408.8 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.4 丹皮酚含量測定 根據2020版《中國藥典》附錄《藥品質量標準分析方法驗證指導原則》要求，采用外標法測定丹皮酚含量。

2.4.1 水蒸氣蒸餾法 水蒸氣蒸餾得到的丹皮酚晶體熔點為49.8 ℃，而文獻報道其范圍在49～51 ℃之間，故本實驗所得為純品。浸泡時間為0、1、2 h 時，丹皮酚質量分別為63.10、44.40、42.0 mg，即不浸泡時效果最佳，見圖1。

圖1 NaCl加入量對丹皮酚提取量的影響Fig.1 Effect of NaCl addition on the extraction amount of paeonol

2.4.2 水-離子液體水蒸氣蒸餾法 取5 g藥材，離子液體浸泡后分別加水、水-離子液體浸泡，水蒸氣蒸餾法得油狀提取物，平行3次，得油狀物。

2.4.3 水-離子液體體系回流法 精密吸取“2.2.2”項下供試品溶液10.0 μL，在“2.2.3”項色譜條件下進樣測定，結果見圖2，丹皮酚提取量見圖3。

圖2 不同溶劑體系中丹皮酚色譜圖Fig.2 Chromatograms of paeonol in differentsolvent systems

圖3 離子液體種類對丹皮酚提取量的影響Fig.3 Effect of ionic liquid type on the extraction amount of paeonol

2.4.4 不同濃度離子液體體系回流法 精密吸取“2.2.2”項下供試品溶液10.0 μL，在“2.2.3”項色譜條件下進樣測定，結果見圖4，丹皮酚提取量見圖5。

圖4 不同濃度離子液體中丹皮酚色譜圖Fig.4 Chromatograms of paeonol in different concentrations of ionic liquids

圖5 離子液體濃度對丹皮酚提取量的影響Fig.5 Effect of ionic liquid concentration on the extraction amount of paeonol

3 討論與結論

由圖1可知，NaCl-水蒸氣蒸餾法提取時最優工藝為5 g藥材加入15%NaCl、10倍量蒸餾水，不浸泡直接超聲處理15 min，表明NaCl的存在可減弱丹皮酚在水中的溶解度，易于結晶析出。由圖2、4可知，HPLC法對丹皮酚提取結果進行實時檢測時，能快速獲得不同溶劑體系、不同濃度離子液體體系對丹皮酚提取率的影響。由圖3可知，選擇1-辛基-3-甲基咪唑溴([OMIM]Br)作為離子液體時丹皮酚提取率最高。另外，由于[RMIM]Br離子液體隨著烷基鏈長的增長疏水性增加，故在疏水性成分丹皮酚的物質傳遞過程中，[OMIM]Br傳質能力強于[HMIM]Br、[BMIM]Br。

在水蒸氣蒸餾提取過程中，[OMIM]Br浸泡后加水時油狀提取物質量為946.7 mg，而[OMIM]Br-水浸泡油狀物的質量為688.3 mg。經HPLC法分析發現，該油狀提取物中丹皮酚含量很低，也低于傳統水蒸氣蒸餾提取，其原因可能為離子液體有破壞細胞壁和纖維素的能力，有利于揮發油釋放，但加水稀釋后上述作用減弱，導致其含量降低。

在離子液體-水-水蒸氣蒸餾法提取丹皮酚過程中，大量油狀物被餾出，并且冷藏靜置后無結晶析出。經HPLC法分析發現，揮發油中丹皮酚含量很低，其原因可能為離子液體破壞了細胞壁和纖維素[20]，使得揮發油易于釋放的同時包覆了丹皮酚，抑制了該成分遷移與釋放[21]。

離子液體的加入可破除細胞壁，溶解纖維素，釋放活性成分；與活性成分之間存在一定的相互作用力而有利于傳質，使后者遷移到溶劑體系中；破壞細胞壁和纖維素，使丹皮酚更好地遷移。但離子液體加到一定量時提取體系黏度增加，反過來會抑制丹皮酚遷移，故其加入量應有限度，具體有待繼續研究。

丹皮酚最佳提取工藝是采用回流(煎煮)提取，離子液體[OMIM]Br，離子液體與水比例1∶3，液料比10∶1，提取2次，KPF6除去殘留離子液體，提取液萃取劑乙酸乙酯。與傳統提取方法比較，離子液體加入量少，易于去除，污染??；丹皮酚提取率高，操作方法簡單，易于工業化；得到了水蒸氣蒸餾法不能獲得的大量揮發油，有利于節約牡丹皮資源。