木犀草素固體脂質(zhì)納米粒的制備及其體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

楊 娟， 尚曙玉， 賈 安， 郭銳稅， 馮永豪

(1.黃河科技學(xué)院醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450006；2.上海雷允上藥業(yè)有限公司，上海 201401)

木犀草素屬于黃酮類化合物，主要來源于白毛夏枯草、裸花紫珠、密蒙花、野菊花等植物中[1]，并且在洋蔥、芹菜等蔬菜中也存在，具有神經(jīng)保護(hù)、抗炎、保肝、抗腫瘤等藥理作用[2-3]，研究價(jià)值較高。但該成分口服吸收較差，從而限制了其藥效發(fā)揮及臨床應(yīng)用，故采用新型制劑技術(shù)改善其口服吸收生物利用度非常必要。目前，已有包合物、膠束、微乳等制劑學(xué)報(bào)道[4-6]，但缺少藥動(dòng)學(xué)研究。

固體脂質(zhì)納米粒是采用單一或混合脂質(zhì)材料作為載體，將藥物夾嵌或包裹在載體材料中制得的粒徑在50～1 000 nm之間的膠粒給藥系統(tǒng)[7-8]，促進(jìn)藥物口服吸收效果明顯。本實(shí)驗(yàn)將木犀草素制成該劑型后，對(duì)其粒徑、電位、藥物存在狀態(tài)、體外溶出進(jìn)行研究，再考察其體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)，以期為該成分開發(fā)利用提供參考。

1 材料

XP205型電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；Agilent 1200型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；DF-101S型磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；Vortex-2型渦旋振蕩儀(上海滬析實(shí)業(yè)有限公司)；Nanosep?型超濾離心管(截留相對(duì)分子質(zhì)量10 000，美國Pall公司)；DW-86L328型超低溫冰箱(浙江捷勝低溫設(shè)備有限公司)；FD-1A-80型冷凍干燥機(jī)(上海豫明儀器有限公司)；GY-GSDCY-24型氮?dú)獯祾邇x(上海歸永電子有限公司)；LS13320XR激光衍射粒度分析儀(美國貝克曼公司)。

木犀草素對(duì)照品(批號(hào)111751-201812，純度98.9%，中國食品藥品檢定研究院)；香葉木素對(duì)照品(批號(hào)P0587，上海源葉生物科技有限公司)；木犀草素原料藥(批號(hào)P201005，純度98.1%，北京索萊寶生物有限公司)；單硬脂酸甘油酯(批號(hào)1521489324-2)、泊洛沙姆188(F-68，批號(hào)1815004)(德國巴斯夫公司)；磷脂[PC-98T，輔必成(上海)醫(yī)藥科技有限公司]。

SD大鼠購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，體質(zhì)量(300±20)g，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(滬)2012-0003，于溫度25 ℃、相對(duì)濕度55%的實(shí)驗(yàn)室中飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 木犀草素固體脂質(zhì)納米粒制備 采用乳化蒸發(fā)-低溫固化法。取20 mg木犀草素、150 mg單硬脂酸甘油酯、150 mg磷脂，置于20 mL乙醇中，在75 ℃水浴中磁力攪拌加熱溶解，作為有機(jī)相；取0.8 g泊洛沙姆188、0.4 g聚山梨酯80，溶于40 mL蒸餾水中，于75 ℃水浴中磁力攪拌(轉(zhuǎn)速1 000 r/min)加熱溶解，作為水相，將有機(jī)相緩慢加到水相中，溫度維持在75 ℃，持續(xù)磁力攪拌濃縮至25 mL，迅速置于-4 ℃冰箱中固化，即得。同法制備空白固體脂質(zhì)納米?；鞈乙?。

2.2 木犀草素含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 Agilent C18色譜柱(4.6 mm ×200 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈-四氫呋喃-0.1%磷酸二氫鉀(70∶1∶29)；體積流量1.0 mL/min；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長282 nm；進(jìn)樣量20 μL。

2.2.2 線性關(guān)系考察 稱取木犀草素對(duì)照品20 mg，溶于100 mL乙腈中，混勻，得到貯備液(0.2 mg/mL)，取10 mL至100 mL量瓶中，乙腈-四氫呋喃-0.1%磷酸二氫鉀(70∶1∶29)定容至20 μg/mL，稀釋至10、5、1、0.1、0.05 μg/mL，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以木犀草素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，得方程為Y=22.057 2X-1.078 6(r=0.999 8)，在0.05～20 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.3 方法學(xué)考察 取1 mL木犀草素固體脂質(zhì)納米?；鞈乙海糜?0 mL量瓶中，5 mL乙腈超聲處理5 min后定容至刻度，6 000 r/min離心20 min，取上清液1 mL，置于10 mL量瓶中，乙腈-四氫呋喃-0.1%磷酸二氫鉀(70∶1∶29)定容，得到供試品溶液，于0、2、6、12、24 h在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得木犀草素峰面積RSD為1.34%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。制備6份供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得木犀草素含量RSD為1.52%，表明該方法重復(fù)性良好。取0.05 μg/mL(低)、5 μg/mL(中)、20 μg/mL(高)對(duì)照品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得木犀草素峰面積RSD分別為0.41、0.11%、0.12%，表明儀器精密度良好。取9份空白固體脂質(zhì)納米粒混懸液各1 mL，分別置于10 mL量瓶中，加入800 μg/mL對(duì)照品溶液0.8、1.0、1.2 mL各3份，5 mL乙腈超聲處理5 min后定容至刻度，6 000 r/min離心20 min，取上清液1 mL，置于10 mL量瓶中，乙腈-四氫呋喃-0.1%磷酸二氫鉀(70∶1∶29)定容至刻度，取上清液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得木犀草素平均加樣回收率分別為99.09%、98.83%、100.17%，RSD分別為1.11%、1.69%、0.85%。

2.3 包封率、載藥量測(cè)定 取2.0 mL混懸液，置于量瓶中，5 mL甲醇超聲處理5 min后定容至10 mL，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣20 μL測(cè)定木犀草素總含量m總，另取2.0 mL混懸液至4 mL超濾離心管中(截留分子量為30 kDa)，10 000 r/min離心30 min，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣20 μL測(cè)定游離藥量m游離，計(jì)算包封率、載藥量，公式分別為包封率=[(m總-m游離)/m總]×100%、載藥量=[(m總-m游離)/(m總+m脂質(zhì))]×100%。結(jié)果，3批固體脂質(zhì)納米粒平均包封率為85.24%，載藥量為5.24%。

2.4 形態(tài)觀察 取木犀草素固體脂質(zhì)納米粒混懸液0.1 mL，加入4 mL蒸餾水混勻，滴于銅網(wǎng)上，2%磷鎢酸染色，自然晾干，置于掃描電鏡(TEM)下拍照，結(jié)果見圖1。由此可知，所得納米粒形狀規(guī)整，呈類球形或球形，無粘連。

圖1 木犀草素固體脂質(zhì)納米粒TEM圖Fig.1 TEM image for luteolin solid lipid nanoparticles

2.5 粒徑、Zeta電位測(cè)定 取木犀草素固體脂質(zhì)納米?；鞈乙?.1 mL，加入4 mL蒸餾水混勻后置于比色皿中，測(cè)定粒徑、Zeta電位，結(jié)果見圖2～3，可知兩者平均值分別為176.35、-33.8 mV。

圖2 木犀草素固體脂質(zhì)納米粒粒徑分布Fig.2 Particle size distribution of luteolin solid lipid nanoparticles

圖3 木犀草素固體脂質(zhì)納米粒Zeta電位Fig.3 Zeta potential of luteolin solid lipid nanoparticles

2.6 凍干粉制備及其X射線粉末衍射(XRPD)研究

2.6.1 制備方法 取“2.1”項(xiàng)下木犀草素固體脂質(zhì)納米?；鞈乙?，以3%乳糖為凍干劑，混勻后密封，置于-70 ℃超低溫冰箱中預(yù)凍2 d，迅速轉(zhuǎn)移至冷凍干燥機(jī)中(-30 ℃)抽真空2 d，于6 h內(nèi)勻速升溫至25 ℃，取出，即得。復(fù)溶后，凍干粉平均粒徑為236.81 nm，Zeta電位為-27.1 mV，包封率為78.85%，載藥量為4.72%，木犀草素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.85%。

2.6.2 XRPD 掃描條件為銅靶，管壓40 kV，掃描范圍3°～45°，掃描速度5°/min，分別對(duì)木犀草素、空白脂質(zhì)納米粒凍干粉、物理混合物(木犀草素+空白脂質(zhì)納米粒凍干粉)、木犀草素固體脂質(zhì)納米粒進(jìn)行XRPD掃描，結(jié)果見圖4。由此可知，木犀草素圖譜中有許多晶體衍射峰，表明其存在狀態(tài)為晶型；空白脂質(zhì)納米粒凍干粉也出現(xiàn)許多晶體衍射峰；物理混合物中仍可見在4.2°、9.3°處的特征晶體衍射峰；在木犀草素固體脂質(zhì)納米粒中未發(fā)現(xiàn)上述晶型衍射峰，表明木犀草素制成固體脂質(zhì)納米粒后的存在狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o定型。

注：a～d分別為木犀草素固體脂質(zhì)納米粒、物理混合物、空白脂質(zhì)納米粒凍干粉、木犀草素。圖4 各樣品XRPD圖Fig.4 XRPD patterns for various samples

2.7 體外釋藥研究 取木犀草素固體脂質(zhì)納米粒凍干粉1.4 g(含木犀草素10 mg)，加入3 mL溶出介質(zhì)后轉(zhuǎn)移至透析袋(截留分子量8 000～14 000 Da)中，兩端扎緊。取木犀草素10 mg，同法制備對(duì)照品。以900 mL 1%SDS溶液為釋放介質(zhì)，溫度、轉(zhuǎn)速分別設(shè)置為37 ℃、100 r/min，于0、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12、24 h各取樣3 mL，取樣后立即補(bǔ)加3 mL 1%SDS溶液，5 000 r/min離心10 min，取上清液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖5，可知原料藥24 h累積溶出度僅為31.9%；固體脂質(zhì)納米粒釋藥過程分為快速釋藥期(前6 h)和緩慢釋藥期(6 h～24 h)，累積溶出度提高至71.5%。再分別采用Higuchi模型、Weibull模型、零級(jí)模型、一級(jí)模型對(duì)固體脂質(zhì)納米粒釋藥過程進(jìn)行擬合，發(fā)現(xiàn)Weibull模型擬合度最佳，方程為lnln[1/(1-Mt/M∞)]=0.511lnt-1.336(R2=0.979 2)。

圖5 木犀草素體外釋藥曲線Fig.5 In vitro drug release curves for luteolin

2.8 體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

2.8.1 灌胃液制備 取木犀草素固體脂質(zhì)納米粒凍干粉0.53 g，0.5%CMC-Na溶液制成1.5 mg/mL混懸液(以木犀草素計(jì))。取木犀草素5 mg，同法制成1.5 mg/mL混懸液。

2.8.2 分組、給藥及血樣采集 12只大鼠采用拋幣法隨機(jī)分為2組，按10 mg/kg劑量分別灌胃給予“2.8.1”項(xiàng)下2種灌胃液，乙醚麻醉后于0.15、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、8、12 h立即眼眶取血適量(0.2～0.4 mL)，置于肝素潤濕的離心管中，振蕩后4 000 r/min離心2 min，取上層血漿，冷凍保存。

2.8.3 血漿樣品處理 參考文獻(xiàn)[4,9]報(bào)道，精密吸取血漿樣品100 μL至離心管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液50 μL、 HCl溶液(3 mol/L)200 μL，置于60 ℃水浴中1.5 h，加入150 μL 5%HClO4溶液，振蕩10 min后加入2 mL乙酸乙酯，渦旋5 min，8 000 r/min離心20 min后取出，取上層有機(jī)相，45 ℃氮?dú)獯蹈傻脷堅(jiān)尤?00 μL流動(dòng)相復(fù)溶。

2.8.4 內(nèi)標(biāo)、對(duì)照品溶液制備 稱取香葉木素對(duì)照品10 mg，溶于100 mL乙腈中(100 μg/mL)，精密量取1 mL至100 mL量瓶中，乙腈定容混勻，精密吸取5 mL至10 mL量瓶中，即得500 ng/mL內(nèi)標(biāo)溶液。取“2.2.2”項(xiàng)下貯備液，乙腈依次稀釋至1 500、750、300、100、20 ng/mL，即得對(duì)照品溶液。

2.8.5 專屬性、線性關(guān)系考察 取1 500、750、300、100、20 ng/mL對(duì)照品溶液各100 μL，分別加入50 μL內(nèi)標(biāo)溶液，45 ℃氮?dú)獯蹈傻脷堅(jiān)?，加入大鼠空白血漿100 μL，按“2.8.3”項(xiàng)下方法操作，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖6，可知該方法專屬性良好。以木犀草素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，木犀草素、內(nèi)標(biāo)(香葉木素)峰面積比值為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，得方程為Y=1.254 8X+0.102 2(r=0.991 2)，在20～1 500 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.木犀草素 2.內(nèi)標(biāo)(香葉木素)1.luteolin 2.internal standard (diosmetin)圖6 木犀草素HPLC色譜圖Fig.6 HPLC chromatograms of luteolin

2.8.6 方法學(xué)考察 取處理后的血漿樣品，于0、4、12、24、48 h在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得木犀草素、內(nèi)標(biāo)(香葉木素)峰面積比值RSD為1.75%，表明溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。以1 500、300、20 ng/mL血漿對(duì)照品溶液為高、中、低質(zhì)量濃度，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得日內(nèi)精密度RSD分別為6.11%、9.03%、10.56%，日間精密度RSD分別為8.92%、9.93%、11.05%，表明該方法精密度良好。取100 μL空白血漿，依次制成1 500、300、20 ng/mL溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣測(cè)定3次，測(cè)得木犀草素加樣回收率87.14%～97.09%，RSD為10.14%。取20 ng/mL血漿對(duì)照品溶液(不含內(nèi)標(biāo))，逐步稀釋后在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得定量限為5 ng/nL，檢測(cè)限為 2 ng/mL。

2.8.7 結(jié)果分析 圖7、表1顯示，與原料藥比較，固體脂質(zhì)納米粒tmax延長(P<0.01)，Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高(P<0.01)，相對(duì)生物利用度提高至2.28倍。

圖7 木犀草素血藥濃度-時(shí)間曲線Fig.7 Plasma concentration-time curves for luteolin

表1 木犀草素主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

3 討論

木犀草素水溶性較低，會(huì)發(fā)生溶出速率及溶出度受限、脂溶性差、透膜吸收困難、在胃腸道中容易受到酶解等問題[9-10]，導(dǎo)致其口服吸收生物利用度不理想。本實(shí)驗(yàn)將該成分制成固體脂質(zhì)納米粒后，藥物溶出速率、累積溶出度均得到提高，可能是由于它以無定型狀態(tài)存在于納米粒中，有助于溶解度提高；納米載藥系統(tǒng)使其比表面積明顯增加，促進(jìn)其快速溶出，增加其與胃腸道黏膜的接觸面積[11-14]。另外，藥物包裹于固體脂質(zhì)納米粒中時(shí)可避免與外界環(huán)境直接接觸，降低被破壞幾率，提高穩(wěn)定性，同時(shí)納米制劑可改善其滲透性[15]，促進(jìn)透膜吸收。

文獻(xiàn)[16]報(bào)道，木犀草素進(jìn)入人體后可與血清蛋白相結(jié)合，故需使該成分從結(jié)合態(tài)游離出來。本實(shí)驗(yàn)分別采用HCl、HClO4溶液對(duì)蛋白進(jìn)行水解、沉淀，并以乙酸乙酯提取，藥動(dòng)學(xué)結(jié)果顯示，固體脂質(zhì)納米粒tmax延后，可能是由于納米粒粒徑較小，提高了與胃腸道黏膜的粘附性，增加了在胃腸道中的滯留時(shí)間，導(dǎo)致tmax延后；Cmax顯著升高，可能與納米粒特殊吸收機(jī)制有關(guān)，可使藥物被高效吸收進(jìn)入血液循環(huán)，從而提高其口服生物利用度[17-18]。但固體脂質(zhì)納米粒促進(jìn)藥物吸收的程度還會(huì)受到納米粒粒徑、納米材料性質(zhì)、表面活性劑種類、納米粒表面親水親脂性及空間特性、體內(nèi)穩(wěn)定性及跨膜吸收過程中諸多因素的影響[13, 18-20]，今后尚需作進(jìn)一步研究。