響應(yīng)面法優(yōu)化酸模根莖中黃酮提取工藝

劉俊

（信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院，河南 信陽(yáng) 464000）

酸模（Rumex acetosa L.），又名野菠菜、山大黃，是蓼科酸模屬多年生草本植物，為民間傳統(tǒng)藥用植物，全草供藥用[1]。該屬的羊蹄、鈍葉酸模、巴天酸模、皺葉酸模等均作為草藥“土大黃”廣泛使用，具有清熱解毒、行瘀止血、殺菌止癢等功效，用于治療疥癬和多種出血癥[2]。蓼科酸模屬植物的主要化學(xué)成分為蒽醌類(lèi)、黃酮類(lèi)、萘、二苯乙烯、香豆素及有機(jī)酸等[3]，其中黃酮化合物具有抗氧化、抗輻射、抗腫瘤、抗抑郁、擴(kuò)張血管、降低血糖等多種功能[4-6]，是一種天然抗氧化劑和天然保健原料，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、食品營(yíng)養(yǎng)學(xué)等領(lǐng)域，具有廣闊的市場(chǎng)前景[7-8]。本試驗(yàn)采用微波輔助醇提法提取酸模根莖中的黃酮，并通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化了提取工藝；借助試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件Design-Expert 8.0.6.1 軟件，采用Box-Behnken 模式對(duì)各主要影響因素之間的單一作用進(jìn)行了研究，得出最佳的提取工藝參數(shù)，為酸模資源的深度研究與開(kāi)發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸模根莖，自行采摘，產(chǎn)地為河南信陽(yáng)；無(wú)水乙醇（分析純），購(gòu)自北京化工廠；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品鑒定所；硝酸鋁、氫氧化鈉(分析純），均購(gòu)自天津市化學(xué)制劑三廠)；石油醚、亞硝酸鈉(分析純），均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；UV-1600 型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)，北京瑞利分析儀器公司；微波萃取設(shè)備，廣州萬(wàn)程微波設(shè)備有限公司；SF-170 型高速粉碎機(jī)，上海中藥機(jī)械廠；電熱恒溫水浴鍋，常州國(guó)華電器有限公司；80-2 型電動(dòng)離心機(jī)，江蘇恒豐儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 酸模根莖黃酮提取工藝流程

酸模干燥根莖→粉碎，過(guò)篩→石油醚浸泡，去除色素→70%乙醇浸泡→過(guò)濾，留取上清液。

1.3.2 主要工藝操作要點(diǎn)

（1）原料處理。將預(yù)先清理、切段處理的新采摘酸模根莖放入80 ℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干，然后使用粉碎機(jī)將其粉碎，過(guò)60 目篩，再裝入封口袋中，置于干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。采用亞硝酸鈉—硝酸鋁顯色法[5]測(cè)定黃酮含量。分別準(zhǔn)確移取0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL，0.1 mg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，于6 支干凈的10 mL 容量瓶中，加入70%乙醇溶液補(bǔ)足至5 mL。加入5%NaNO2溶液0.3 mL，震蕩搖勻，放置8 min；然后加入10%Al (NO3)3溶液0.3 mL，震蕩搖勻，靜置8 min；再加入4%NaOH 4 mL，用70%乙醇定容到10 mL，震蕩搖勻，放置20 min 后，于510 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得回歸方程：A=16.55×C－0.0165，R2=0.9984（線性范圍：0～0.05 mg/mL）。

（3）樣品溶液的制備。在確定料液比下，以70%乙醇溶液作提取溶劑，在設(shè)置好的溫度、微波強(qiáng)度下提取一定時(shí)間，趁熱抽濾，再移至100 mL 容量瓶中并用70%乙醇定容，制成樣品溶液。

（4）黃酮提取率的測(cè)定。移取5 mL 的待測(cè)提取液于10 mL 容量瓶中，加入5%NaNO2溶液0.3 mL，震蕩搖勻，放置8 min；然后加入10%Al(NO3)3溶液0.3 mL，震蕩搖勻，靜置8 min；再加入4%NaOH 4 mL，用70%乙醇定容到10 mL，震蕩搖勻，放置20 min 后，以不加提取液組為對(duì)照組，于510 nm 波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，根據(jù)吸光度和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酸模根黃酮提取率，并按下式計(jì)算：W=×100%（C為提取液中黃酮的質(zhì)量濃度，單位為mg/mL；V為提取液的體積，單位為mL，m為酸模根莖粉末質(zhì)量，單位為g）。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

黃酮類(lèi)化合物易溶于醇類(lèi)溶劑，本試驗(yàn)采用微波輔助醇提法提取酸模中黃酮，分別考察了提取時(shí)間、提取溫度、液料比三因素對(duì)黃酮提取率的影響。

1.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與試驗(yàn)水平的確定

本試驗(yàn)固定微波強(qiáng)度，以70%乙醇溶液作為溶劑，分別考察了提取時(shí)間（0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h）、提取溫度（40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80℃）、液料比（10∶1 mL/g、20∶1 mL/g、30∶1 mL/g、40∶1 mL/g、50∶1 mL/g）三個(gè)因素對(duì)酸模黃酮提取率的影響。最終確定三因素的三水平為提取時(shí)間（1 h、1.5 h、2 h）、提取溫度（50 ℃、60 ℃、70 ℃）、液料比（20∶1 mL/g、30∶1 mL/g、40∶1 mL/g）。

1.4.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在“1.4.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與試驗(yàn)水平的確定”的基礎(chǔ)上，運(yùn)用Design-Expert8.0.6.1 軟件進(jìn)行Box-Behnken 設(shè)計(jì)，以黃酮提取率為響應(yīng)值，采用三因素三水平優(yōu)化酸模黃酮的提取工藝，各因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表

2 試驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)分析

2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 試驗(yàn)結(jié)果與回歸方程

利用Design-Expert 8.0.6.1 軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化酸模黃酮的提取條件，由數(shù)據(jù)分析得到黃酮提取率自變量與相關(guān)變量之間關(guān)系的擬合方程為：提取率(%)=5.04+0.26A+0.059B+0.14C-0.18AB-0.14AC-0.042BC-0.23A2-0.30B2-0.11C2。通過(guò)該方程可以計(jì)算實(shí)驗(yàn)的預(yù)測(cè)值，如表2 所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.1.2 回歸模型的方差分析

從表3 中擬合優(yōu)度、方差的分析結(jié)果可知，該模型具有極低的p 值(p<0.01)，表明該模型具有顯著性；而失擬項(xiàng)p 值大于0.05，表明該方程對(duì)試驗(yàn)擬合情況好，試驗(yàn)誤差小。相關(guān)系數(shù)R2 為0.9481，表明酸模黃酮提取率的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值之間非常接近，模型預(yù)測(cè)性好。此外，系數(shù)變異值CV(2.43%)較低，表明實(shí)驗(yàn)的精確度較高，重復(fù)性好。對(duì)酸模黃酮提取的影響極顯著的因素有一次項(xiàng)A、C 和二次項(xiàng)A2、B2及交互項(xiàng)BC。通過(guò)比較F 值的大小，可得出影響酸模黃酮提取效果的因素順序?yàn)椋禾崛r(shí)間(A)＞液料比(C)＞提取溫度(B)。

表3 二次響應(yīng)面回歸模型方差分析

2.2 最佳提取工藝和驗(yàn)證

由響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化得到最佳工藝條件：提取時(shí)間為1.74 h、提取溫度為59.34 ℃、液料比為33.76∶1 mL/g。為了便于實(shí)際操作，將酸模根莖黃酮的最佳提取工藝參數(shù)修正為：1.8 h，提取溫度60 ℃，液料比34∶1 mL/g。在改進(jìn)條件下，進(jìn)行三組重復(fù)性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，提取率依次為4.97%、5.05%、5.16%，3 組均值為5.09%，與預(yù)測(cè)值5.12%十分接近，表明該模型預(yù)測(cè)性很好。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用響應(yīng)面法優(yōu)化酸模根莖中黃酮的提取工藝，運(yùn)用Design-Expert 8.0.6.1 軟件進(jìn)行Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，最終確定酸模根莖中黃酮的最佳提取工藝為：1.8 h，提取溫度60 ℃，液料比34∶1 mL/g。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)測(cè)酸模根莖黃酮提取率的平均值為5.09%，十分接近預(yù)測(cè)值5.12%，說(shuō)明該模型能較好地預(yù)測(cè)各因素與酸模根莖黃酮提取率之間的關(guān)系。