響應面法優化酸模根莖中黃酮提取工藝

劉俊

（信陽農林學院，河南 信陽 464000）

酸模（Rumex acetosa L.），又名野菠菜、山大黃，是蓼科酸模屬多年生草本植物，為民間傳統藥用植物，全草供藥用[1]。該屬的羊蹄、鈍葉酸模、巴天酸模、皺葉酸模等均作為草藥“土大黃”廣泛使用，具有清熱解毒、行瘀止血、殺菌止癢等功效，用于治療疥癬和多種出血癥[2]。蓼科酸模屬植物的主要化學成分為蒽醌類、黃酮類、萘、二苯乙烯、香豆素及有機酸等[3]，其中黃酮化合物具有抗氧化、抗輻射、抗腫瘤、抗抑郁、擴張血管、降低血糖等多種功能[4-6]，是一種天然抗氧化劑和天然保健原料，廣泛應用于醫學、食品營養學等領域，具有廣闊的市場前景[7-8]。本試驗采用微波輔助醇提法提取酸模根莖中的黃酮，并通過響應面法優化了提取工藝；借助試驗設計軟件Design-Expert 8.0.6.1 軟件，采用Box-Behnken 模式對各主要影響因素之間的單一作用進行了研究，得出最佳的提取工藝參數，為酸模資源的深度研究與開發提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸模根莖，自行采摘，產地為河南信陽；無水乙醇（分析純），購自北京化工廠；蘆丁標準品，購自中國藥品生物制品鑒定所；硝酸鋁、氫氧化鈉(分析純），均購自天津市化學制劑三廠)；石油醚、亞硝酸鈉(分析純），均購自國藥集團化學試劑科技有限公司。

1.2 儀器與設備

電子分析天平，北京賽多利斯儀器系統有限公司；UV-1600 型紫外可見光分光光度計，北京瑞利分析儀器公司；微波萃取設備，廣州萬程微波設備有限公司；SF-170 型高速粉碎機，上海中藥機械廠；電熱恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；80-2 型電動離心機，江蘇恒豐儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 酸模根莖黃酮提取工藝流程

酸模干燥根莖→粉碎，過篩→石油醚浸泡，去除色素→70%乙醇浸泡→過濾，留取上清液。

1.3.2 主要工藝操作要點

（1）原料處理。將預先清理、切段處理的新采摘酸模根莖放入80 ℃鼓風干燥箱中烘干，然后使用粉碎機將其粉碎，過60 目篩，再裝入封口袋中，置于干燥器中保存備用。

（2）蘆丁標準曲線的制作。采用亞硝酸鈉—硝酸鋁顯色法[5]測定黃酮含量。分別準確移取0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL，0.1 mg/mL 的蘆丁標準液，于6 支干凈的10 mL 容量瓶中，加入70%乙醇溶液補足至5 mL。加入5%NaNO2溶液0.3 mL，震蕩搖勻，放置8 min；然后加入10%Al (NO3)3溶液0.3 mL，震蕩搖勻，靜置8 min；再加入4%NaOH 4 mL，用70%乙醇定容到10 mL，震蕩搖勻，放置20 min 后，于510 nm 波長處測定吸光度，繪制蘆丁標準曲線，擬合得回歸方程：A=16.55×C－0.0165，R2=0.9984（線性范圍：0～0.05 mg/mL）。

（3）樣品溶液的制備。在確定料液比下，以70%乙醇溶液作提取溶劑，在設置好的溫度、微波強度下提取一定時間，趁熱抽濾，再移至100 mL 容量瓶中并用70%乙醇定容，制成樣品溶液。

（4）黃酮提取率的測定。移取5 mL 的待測提取液于10 mL 容量瓶中，加入5%NaNO2溶液0.3 mL，震蕩搖勻，放置8 min；然后加入10%Al(NO3)3溶液0.3 mL，震蕩搖勻，靜置8 min；再加入4%NaOH 4 mL，用70%乙醇定容到10 mL，震蕩搖勻，放置20 min 后，以不加提取液組為對照組，于510 nm 波長處測吸光度，根據吸光度和蘆丁標準曲線計算酸模根黃酮提取率，并按下式計算：W=×100%（C為提取液中黃酮的質量濃度，單位為mg/mL；V為提取液的體積，單位為mL，m為酸模根莖粉末質量，單位為g）。

1.3.3 單因素試驗

黃酮類化合物易溶于醇類溶劑，本試驗采用微波輔助醇提法提取酸模中黃酮，分別考察了提取時間、提取溫度、液料比三因素對黃酮提取率的影響。

1.4 響應面試驗設計

1.4.1 單因素試驗結果與試驗水平的確定

本試驗固定微波強度，以70%乙醇溶液作為溶劑，分別考察了提取時間（0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h）、提取溫度（40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80℃）、液料比（10∶1 mL/g、20∶1 mL/g、30∶1 mL/g、40∶1 mL/g、50∶1 mL/g）三個因素對酸模黃酮提取率的影響。最終確定三因素的三水平為提取時間（1 h、1.5 h、2 h）、提取溫度（50 ℃、60 ℃、70 ℃）、液料比（20∶1 mL/g、30∶1 mL/g、40∶1 mL/g）。

1.4.2 響應面試驗設計

在“1.4.1 單因素試驗結果與試驗水平的確定”的基礎上，運用Design-Expert8.0.6.1 軟件進行Box-Behnken 設計，以黃酮提取率為響應值，采用三因素三水平優化酸模黃酮的提取工藝，各因素水平設計見表1。

表1 響應面實驗設計因素水平表

2 試驗結果與數據分析

2.1 響應面試驗結果分析

2.1.1 試驗結果與回歸方程

利用Design-Expert 8.0.6.1 軟件設計試驗優化酸模黃酮的提取條件，由數據分析得到黃酮提取率自變量與相關變量之間關系的擬合方程為：提取率(%)=5.04+0.26A+0.059B+0.14C-0.18AB-0.14AC-0.042BC-0.23A2-0.30B2-0.11C2。通過該方程可以計算實驗的預測值，如表2 所示。

表2 響應面試驗設計與結果

2.1.2 回歸模型的方差分析

從表3 中擬合優度、方差的分析結果可知，該模型具有極低的p 值(p<0.01)，表明該模型具有顯著性；而失擬項p 值大于0.05，表明該方程對試驗擬合情況好，試驗誤差小。相關系數R2 為0.9481，表明酸模黃酮提取率的實測值與預測值之間非常接近，模型預測性好。此外，系數變異值CV(2.43%)較低，表明實驗的精確度較高，重復性好。對酸模黃酮提取的影響極顯著的因素有一次項A、C 和二次項A2、B2及交互項BC。通過比較F 值的大小，可得出影響酸模黃酮提取效果的因素順序為：提取時間(A)＞液料比(C)＞提取溫度(B)。

表3 二次響應面回歸模型方差分析

2.2 最佳提取工藝和驗證

由響應面實驗的優化得到最佳工藝條件：提取時間為1.74 h、提取溫度為59.34 ℃、液料比為33.76∶1 mL/g。為了便于實際操作，將酸模根莖黃酮的最佳提取工藝參數修正為：1.8 h，提取溫度60 ℃，液料比34∶1 mL/g。在改進條件下，進行三組重復性驗證實驗，提取率依次為4.97%、5.05%、5.16%，3 組均值為5.09%，與預測值5.12%十分接近，表明該模型預測性很好。

3 結論

本試驗采用響應面法優化酸模根莖中黃酮的提取工藝，運用Design-Expert 8.0.6.1 軟件進行Box-Behnken 中心組合試驗設計，最終確定酸模根莖中黃酮的最佳提取工藝為：1.8 h，提取溫度60 ℃，液料比34∶1 mL/g。在此基礎上進行驗證試驗，實測酸模根莖黃酮提取率的平均值為5.09%，十分接近預測值5.12%，說明該模型能較好地預測各因素與酸模根莖黃酮提取率之間的關系。