核糖體合成調控因子1對乳腺癌細胞阿霉素抗性的影響

鄭文祥 王軍 楊茜 周娜 侯琳

(青島大學基礎醫學院，山東 青島 266071 1 生物化學與分子生物學系； 2 病理系)

乳腺癌是最常見的惡性腫瘤之一，在全球范圍內位居女性癌癥死亡原因的首位[1-2]。隨著綜合療法的發展，乳腺癌患者的生存率有了顯著提高。阿霉素是廣泛用于乳腺癌治療的蒽環類藥物[3]，目前脂質體[4-5]、新型納米材料[6]等與阿霉素的聯合應用在臨床顯示了良好的治療效果。盡管阿霉素對乳腺癌具有顯著的療效，但由于其耐藥性[7]，導致一些患者的預后仍然較差。耐藥還可導致乳腺癌的復發和轉移概率增加，從而影響患者的預后[8]。因此，如何逆轉腫瘤細胞對化療藥物的耐受性成為近年來的研究熱點之一。

腫瘤細胞的耐藥機制非常復雜[9]，其中一些與腫瘤發生發展密切相關的蛋白異常表達是一個重要原因[10]。核糖體合成調控因子1(RRS1)主要定位于細胞核仁和內質網，參與調節核糖體蛋白、RNA生物合成[11]，并且與細胞的衰老[12]、周期調控[13]等密切相關。近年來研究表明，在多種不同的腫瘤中都觀察到RRS1的表達明顯升高。進一步研究發現，沉默RRS1的表達可明顯促進乳腺癌細胞的凋亡[14]。因此RRS1可作為治療乳腺癌的一個潛在的新靶標，但目前尚未發現關于RRS1與化療藥耐藥性之間關系的研究報道。因此本實驗擬探討沉默RRS1表達是否會增強乳腺癌耐藥細胞對于阿霉素的敏感性，為乳腺癌耐藥研究提供數據參考。

1 材料和方法

1.1 材料來源

人乳腺癌MCF-7細胞系由我院醫學研究中心贈送；人耐阿霉素乳腺癌MCF-7/ADR細胞系購自湖南豐暉生物科技有限公司；DMEM、RPMI-1640培養基購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；Cell Counting Kit-8(CCK8)試劑盒、胰蛋白酶消化液及青鏈霉素混合液、BCA蛋白質定量試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；細胞周期檢測試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；RRS1單克隆抗體購自英國Abcam公司；慢病毒轉染載體和轉染試劑盒購于上海吉凱基因醫學科技股份有限公司。

1.2 細胞培養及處理

將MCF-7細胞培養于含體積分數0.10的胎牛血清和含10 g/L青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養基中；MCF-7/ADR細胞培養于含5 mg/L阿霉素、含體積分數0.10胎牛血清和含10 g/L青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養基中。所有細胞均置于37 ℃、含體積分數0.05 CO2的細胞培養箱內常規培養，待細胞生長至對數期進行后續實驗。

1.3 實驗方法

1.3.1Western blot方法檢測RRS1在MCF-7與MCF-7/ADR細胞中的表達 取對數生長期的乳腺癌MCF-7細胞與耐阿霉素乳腺癌MCF-7/ADR細胞分別進行培養，當細胞融合度約達90%時，棄掉培養基，分別用PBS洗1次，采用RIPA裂解法提取總蛋白，裂解緩沖液配制比例為PMSF∶RIPA=1∶100，采用BCA蛋白測定試劑盒測定總蛋白濃度。以SDS-PAGE電泳分離蛋白，目的蛋白轉移到PVDF膜上后，室溫下以體積分數0.05脫脂奶粉封膜2 h，然后在4 ℃下以一抗(1∶1 000)孵育過夜。TBST洗膜3次后，二抗(1∶1 000)室溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，使用ECL試劑盒檢測蛋白的表達。實驗重復3次，結果取均值。

1.3.2慢病毒的構建及各組細胞的轉染 慢病毒構建委托上海吉凱基因醫學科技股份有限公司，實驗分為攜帶有shRRS1慢病毒感染組(實驗組)和空載體慢病毒轉染組(對照組)兩組。根據預實驗，得出實驗組和對照組的MOI值均為30，最適作用時間為9 h。取對數生長期的MCF-7/ADR細胞用胰酶消化后進行計數，以每孔6×105個細胞接種于6孔板中，待細胞融合度約達60%時換為無血清培養基，加入病毒及感染增強液，作用9 h換為完全培養基繼續培養。48 h后用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白(GFP)的強弱，即代表病毒的轉染效率的高低。選取GFP表達率70%以上穩定轉染的細胞進行后續實驗。

1.3.3Western blot方法檢測MCF-7/ADR細胞RRS1蛋白的表達量 提取穩定轉染的實驗組和對照組細胞總蛋白，以Western blot方法檢測兩組細胞中RRS1蛋白的表達量。

1.3.4CCK8法檢測阿霉素對MCF-7/ADR細胞的抑制水平 取穩定轉染的實驗組和對照組細胞，以3 000個/孔的密度接種于96孔板中，后分別加入0.01、0.10、0.20、0.30、0.50、0.80、1.00 mg/L的阿霉素37 ℃培養48 h，每個濃度設3個復孔。每孔細胞經PBS洗滌2次后，加入10 μL CCK8，正常培養條件下孵育3 h，用酶標儀測量波長450 nm處的吸光度值，計算IC50值。

1.3.5流式細胞術檢測細胞內阿霉素累積量 取穩定轉染的實驗組和對照組的細胞分別與阿霉素(5 mg/L)共同孵育2 h后用胰酶消化，離心重懸于冰冷的PBS中，由于阿霉素自帶紅色熒光，可通過流式細胞儀檢測紅色熒光強弱，以紅色熒光強弱代表細胞內阿霉素的相對累積量。

1.3.6平板克隆實驗檢測細胞的增殖水平 制備穩定轉染的實驗組和對照組單細胞懸液，將兩組細胞以3 000個/孔的密度接種于6孔板中，每組3個復孔。置于37 ℃、含體積分數0.05 CO2的培養箱內常規培養，約10～14 d出現肉眼可見的集落后終止培養。棄舊培養基加PBS后洗3次。每孔加體積分數0.04多聚甲醛溶液2 mL固定細胞30 min；結晶紫染色30 min，流水緩慢沖洗，室溫自然晾干；將6孔板倒置并疊加一張帶有網格的透明膠片，低倍鏡下觀察集落形成情況，計數大于10個細胞的克隆數。

1.3.7流式細胞術檢測細胞凋亡情況 制備穩定轉染的實驗組和對照組單細胞懸液并進行細胞計數，取5×105～1×106個細胞重懸于500～1 000 μL 1×Binding Buffer中，2 000 r/min離心5 min；棄上清液，加入100 μL 1×Binding Buffer重懸細胞后，加入5 μL Annexin V-FITC輕輕混勻，室溫避光孵育15～20 min；加入200～300 μL 1×Binding Buf-fer，上機檢測前5 min加入5 μL PI，混勻后將細胞懸液用300目篩網過濾，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.4 統計學分析

使用GraphPad Prism 6.0軟件對數據進行統計學分析處理，計量資料以均數±標準差進行表示，兩組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 MCF-7和MCF-7/ADR細胞中RRS1表達量比較

Western blot實驗結果顯示，MCF-7和MCF-7/ADR細胞中RRS1蛋白相對表達量分別為0.79±0.03和1.27±0.02，兩者比較差異均具有顯著意義(t=13.05，P<0.05)。

2.2 兩組細胞中RRS1蛋白表達量的比較

對照組和實驗組細胞中RRS1蛋白相對表達量分別為1.38±0.07、0.33±0.04，組間比較差異具有顯著性(t=12.71，P<0.05)。

2.3 阿霉素對兩組MCF-7/ADR細胞抑制能力的比較

實驗組和對照組阿霉素對MCF-7/ADR細胞IC50值分別為(0.74±0.12)、(12.37±0.07)mg/L，兩組比較差異有顯著性(t=2.87，P<0.05)。

2.4 兩組細胞中阿霉素累積量的比較

對照組和實驗組細胞中阿霉素的累積量分別為(5.84±0.11)%、(24.46±1.10)%，兩組比較差異有顯著性(t=16.92，P<0.05)。

2.5 兩組的細胞增殖能力比較

對照組和實驗組的克隆形成數分別為430.0±5.8、177.3±1.5，兩組比較差異均具有顯著意義(t=42.44，P<0.05)。

2.6 兩組的細胞凋亡率比較

對照組和實驗組的細胞凋亡率分別為1.26±0.03、65.34±0.52，兩組比較差異具有顯著意義(t=122.40，P<0.05)。見圖1。

圖1 兩組細胞凋亡率比較

3 討 論

目前，乳腺癌已經超過肺癌成為全球發病率最高的惡性腫瘤[1]，而且發病率呈逐年上升的趨勢?；熓侨橄侔┚C合治療的重要組成部分，化療藥物對乳腺癌有明顯的療效，可以明顯改善乳腺癌患者的預后[15-16]。阿霉素作為一種蒽環類廣譜化療藥物，較早應用于乳腺癌的治療，在乳腺癌術后輔助治療、新輔助治療和轉移或復發后的再次治療中被普遍采用[17]。單獨應用阿霉素或阿霉素與其他抗腫瘤藥物聯合應用對早、晚期乳腺癌均療效顯著。但部分患者在接受阿霉素化療一段時間后，會出現繼發性耐藥；還有部分未接受過阿霉素化療的患者對該藥物的反應性很低，會出現原發性耐藥，但具體的耐藥機制尚不清楚[18-19]。因此揭示乳腺癌對阿霉素耐藥的機制，尋找耐藥相關分子或基因，對提高阿霉素療效具有重要意義。

目前研究發現，化療耐藥性的產生與某些基因在腫瘤細胞內的異常表達密切相關[10]。RRS1作為RRS的一種，主要參與核糖體的生物合成過程[11]。近年來研究發現，RRS1的表達水平與宮頸癌的細胞周期有關[20]。在視網膜母細胞瘤組織和細胞中RRS1均表達升高，促進了視網膜母細胞瘤細胞的增殖和侵襲。WU等[21]研究發現，干擾RRS1可抑制大腸癌細胞周期的G2/M進程，對新生血管生成也有抑制作用，從而抑制了腫瘤細胞的增殖和侵襲。目前已經證實RRS1在乳腺癌組織中的表達水平高于周圍的非癌組織，且RRS1的高表達水平與患者淋巴結轉移及不良臨床預后有關。體內外研究均顯示，沉默RRS1基因能抑制乳腺癌細胞的增殖[14]，并顯著促進乳腺癌細胞的凋亡。以上研究均證實RRS1表達升高會促進腫瘤的發生發展，但RRS1的表達水平變化是否與乳腺癌細胞對阿霉素抗性的產生有關尚不清楚，在乳腺癌細胞阿霉素抗性中的作用機制也不是很明確。

本研究首先比較人乳腺癌MCF-7細胞和人耐阿霉素乳腺癌MCF-7/ADR細胞中RRS1的表達水平，顯示與MCF-7細胞相比，RRS1在MCF-7/ADR細胞中呈高表達，說明RRS1在耐阿霉素的乳腺癌細胞中表達水平較高。為進一步探討相關的作用機制，本研究通過慢病毒載體介導的shRNA沉默MCF-7/ADR細胞中RRS1的表達，檢測阿霉素對細胞IC50值的變化，結果顯示在MCF-7/ADR細胞中沉默RRS1后可使阿霉素對細胞的IC50值明顯降低，因此提示RRS1的表達升高與阿霉素抗性的產生有關。流式細胞術及平板克隆方法檢測顯示，沉默RRS1后，可顯著促進MCF-7/ADR細胞凋亡，抑制MCF-7/ADR細胞的增殖能力，并使細胞內阿霉素累積量明顯升高，表明RRS1表達升高可能會導致乳腺癌細胞對阿霉素產生抗性，而沉默RRS1表達后可降低乳腺癌細胞對阿霉素的抗性。

綜上所述，RRS1在耐阿霉素乳腺癌MCF-7/ADR細胞中高表達，沉默RRS1表達可顯著抑制細胞增殖及誘導細胞凋亡，降低MCF-7/ADR細胞對阿霉素的抗性，RRS1在乳腺癌細胞阿霉素抗性的產生過程中發揮了重要作用，有望成為乳腺癌治療新的分子靶點。