胃饑餓素在妊娠糖尿病患者外周血與臍帶血中的表達及其對高糖所致胰島B細胞凋亡及功能損傷的影響▲

曾 燕 勾憲飛 陳曉燕 許志新

(1 重慶市第七人民醫院婦產科，重慶市 400069，電子郵箱：demeterpow@163.com；2 重慶市涪陵區婦幼保健院產科，重慶市 408000；3 重慶市中醫院婦科，重慶市 400000；4 重慶醫科大學基礎醫學院，重慶市 400016)

妊娠糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)是一種常見的妊娠期并發癥，影響全球約25%的孕婦[1-2]。GDM嚴重影響母嬰健康，其不僅是胎兒致死率、致殘率增高的重要原因，還增加孕婦發生子癇、產后大出血及難產等并發癥或不良預后的風險[3]。此外，GDM患者及其子代遠期更易發生2型糖尿病或肥胖等代謝紊亂疾病[4]。而在妊娠期間母體對胰島素的敏感性會隨著妊娠進展而逐漸降低，為維持正常的血糖水平，機體對胰島素的需求量將顯著增加[5]，故母體的胰島B細胞數量增多及功能增強，以分泌更多的胰島素應對母體升高的血糖濃度[6-7]。因此，大量學者認為胰島B細胞的數量減少及功能障礙與GDM的發生和發展密切相關[3，6-7]。

胃饑餓素是胃黏膜層α細胞分泌的一種內源性活性肽，由28個氨基酸組成，相對分子量為33 000，其作為生長激素促分泌素的內源性配體，能夠顯著刺激生長激素促分泌激素的釋放[8]。既往大量研究證實，GDM患者體內的胃饑餓素表達顯著降低，其可能與母體胰島素抵抗的發生具有相關性[9-11]，但胃饑餓素在GDM患者胎兒體內的表達情況及其對胰島B細胞功能的影響卻尚未明確。因此本研究通過觀察胃饑餓素在GDM患者與正常妊娠孕產婦血清及其臍帶血中的表達差異，分析胃饑餓素水平與GDM患者血糖、胰島素代謝指標的相關性，并進一步探討胃饑餓素對胰島B細胞功能的影響，為闡明GDM及相關代謝疾病的發生和發展提供新的理論基礎及實驗室依據。

1 資料與方法

1.1 臨床標本來源 選取2018年4月至2019年4月于重慶市第七人民醫院婦產科住院分娩的50例GDM孕產婦(GDM組)，并選取同時期正常妊娠的50例孕產婦作為對照組。GDM的診斷符合第9版《婦產科學》[12]中的相關標準，即在妊娠第24～28周空腹口服75 g葡萄糖進行OGTT，達到空腹血糖≥5.1 mmol/L、服糖后2 h血糖≥10.0 mmol/L、服糖后3 h血糖≥8.5 mmol/L中任意一項即可診斷為GDM。所有孕產婦均為單胎妊娠且經陰道分娩。排除合并心腦血管、肺、肝、腎等疾病者，合并甲狀腺等內分泌疾病者及妊娠前確診為糖尿病者。所有研究對象均簽署知情同意書，本研究已通過我院醫學倫理委員會審批。

1.2 細胞系及主要試劑 胰島B細胞MIN6購自中國科學院上海細胞庫。RPMI-1640、胎牛血清購自美國HyClone公司(批號：AD15505803、AD14201137)；β-巰基乙醇、L-谷氨酰胺、青鏈霉素混合液均為100 U/mL購自美國Sigma公司(批號：EZ1300F509、EZ0415D216、EZ419F107)；細胞計數檢測(cell counting kit-8，CCK-8)試劑盒、膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-fluorescein isothiocyanate，Annexin V-FITC)/碘化丙啶凋亡檢測試劑盒購自江蘇碧云天(批號：D77041、D253071)；大鼠抗小鼠胃饑餓素單克隆抗體、大鼠抗小鼠B細胞淋巴瘤-2相關X蛋白(B-cell lymphoma-2 associated X protein，Bax)單克隆抗體、人胃饑餓素酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購自美國Abcam公司(批號：ab10953、ab07409、ab50121)；兔抗小鼠活化型合半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase,Cleaved-Caspase-3)單克隆抗體、大鼠抗小鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)購自美國CST公司(批號：40718T、20933T)；兔抗小鼠蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)多克隆抗體，兔抗小鼠磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,p-Akt)多克隆抗體購自美國Selleckchem公司(批號：S1104、S1219)；辣根過氧化物酶(hoseradish peroxidase，HRP)標記的山羊抗兔或抗大鼠IgG二抗購自武漢博士德(批號：AR1075)；SYBR Premix Ex Taq試劑盒購自日本TaKaRa公司(批號：RR309AB)；Opti-MEM購自美國Gibco公司(批號：30152-D417)；TRIzol、二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒購自美國Invitrogen公司(批號：129340、746286)；小鼠胰島素ELISA試劑盒(美國Andygene公司，批號：043-S5261B)；其他試劑均為國產分析純；胃饑餓素過表達慢病毒載體(LV-胃饑餓素)和陰性對照慢病毒載體(LV-NC)由上海凱基生物科技有限公司構建；PCR引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣本采集及血糖檢測:所有研究對象均禁食8～10 h，于次日采集其肘靜脈血5 mL，并于胎兒娩出且斷臍后采集臍帶血3 mL。將收集到的外周靜脈血與臍帶血于室溫下2 200 r/min離心5 min，取上層血清，采用葡萄糖氧化酶法檢測空腹血糖及臍帶血葡萄糖水平，應用放射免疫法測定空腹胰島素(fasting insulin,FINS)及臍帶血胰島素水平。計算穩態模型胰島素抵抗(homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR)指數，HOMA-IR指數=(空腹血糖×FINS)/22.5。常規測量兩組研究對象產前身高及體重，并計算其體質指數，體質指數=體重(kg)/身高2(m2)。

1.3.2 外周血及臍帶血胃饑餓素水平檢測：按照ELISA試劑盒使用說明方法檢測兩組孕產婦外周血及臍帶血血清中胃饑餓素表達水平。實驗單獨重復3次。

1.3.3 細胞培養、分組及慢病毒轉染：(1)細胞培養。常規復蘇胰島B細胞MIN6后，使用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素、100 μg/mL L-谷氨酰胺及5 μL/mL β-巰基乙醇的RPMI-1640培養液于37℃、5% CO2恒溫培養箱進行培養。待MIN6細胞貼壁生長融合至80%時，使用0.25%的胰酶進行消化傳代。(2)分組方法。將細胞分為7組進行實驗。對照組，即正常培養且無任何特殊處理的MIN6細胞；LV-NC組，即正常培養的轉染LV-NC的MIN6細胞(RPMI-1640葡萄糖濃度為5.0 mmol/L)；LV-胃饑餓素組，即正常培養的轉染LV-胃饑餓素的MIN6細胞(RPMI-1640葡萄糖濃度為5.0 mmol/L)；高糖組，即采用葡萄糖濃度為20.0 mmol/L的培養液進行培養的MIN6細胞；高糖+LV-NC組，即采用高糖(葡萄糖濃度為20.0 mmol/L)培養液進行培養的轉染LV-NC 24 h后的MIN6細胞；高糖+LV-胃饑餓素組，即采用高糖(葡萄糖濃度為20.0 mmol/L)培養液進行培養的感染LV-胃饑餓素慢病毒24 h后的MIN6細胞；高糖+LY294002組，即應用終濃度為25 μmol/L的磷脂?；?-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)抑制劑LY294002(美國Sigma公司，批號：EZ1018D031)10 μM進行預處理30 min后再經高糖(葡萄糖濃度為20.0 mmol/L)培養液培養的MIN6細胞。上述各組細胞置于37℃、5% CO2恒溫培養箱中培養24 h后用于后續實驗。(3)轉染方法。轉染前24 h，取處于對數生長期的MIN6細胞進行常規消化后計數，按1×105個/mL的細胞密度接種至6孔板中，并加入200 μL預先使用Opti-MEM稀釋的慢病毒液(感染復數=30)，同時加入12.5 μg終質量濃度為5 μg/mL的Polybrene(美國Sigma公司，批號：EZ7409A231)，充分混勻后于37℃、5% CO2恒溫培養箱中培養24 h，棄除原培養液，更換為上述新鮮培養液，繼續原條件培養72 h后，用4 μg/mL的嘌呤霉素進行篩選10 d，取穩定感染后的細胞采用實時熒光PCR及蛋白質印跡法分別檢測胃饑餓素mRNA及蛋白的表達。

1.3.4 CCK-8法檢測細胞增殖能力：收集生長狀態良好的待測MIN6細胞，常規消化細胞后接種至96孔板中，調整細胞密度至2×104個/孔,并向每孔加入200 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液，置于37℃、5% CO2恒溫培養箱培養，分別于12 h、24 h、36 h、48 h時向每孔加入10 μL CCK-8試劑后繼續原條件培養2 h，用酶標儀(美國Bio-Rad公司，型號：HBS-1101)檢測每孔于490 nm處的吸光度值，每個時間點每組設置5個復孔，繪制細胞的生長曲線。

1.3.5 Annexin V-FITC法檢測細胞凋亡情況：收集生長狀態良好的待測MIN6細胞，2 200 r/min離心5 min，棄上清，使用4℃預冷的磷酸緩沖鹽溶液洗滌細胞2次，2 min/次，按上述方法離心后收集細胞沉淀，用195 μL Annexin V-FITC結合液重懸細胞，并調整細胞密度至7×105個/mL。依次加入5 μL Annexin V-FITC及10 μL碘化丙啶染色液，輕輕搖晃離心管以充分混勻后，室溫下避光孵育30 min。300目濾膜過濾細胞團塊后，進行流式細胞儀(美國BD Bioscience公司，型號：FACSCalibur)檢測細胞凋亡情況。實驗單獨重復3次。

1.3.6 胰島素釋放試驗：取生長狀態良好的對照組、LV-NC組與LV-胃饑餓素組的MIN6細胞，使用含低糖(3.3 mmol/L)或高糖(16.7 mmol/L)的RPMI-1640培養基于37℃、5% CO2細胞培養箱中分別進行處理1 h。取細胞培養上清液，3 400 r/min離心10 min后按照胰島素ELISA試劑盒說明書檢測上清液中的胰島素含量。實驗單獨重復3次。

1.3.7 實時熒光定量PCR：取LV-胃饑餓素組、LV-NC組及對照組MIN6細胞，采用TRIzol法提取待測細胞總RNA，分光光度計檢測純度與濃度后，根據反轉錄試劑盒(美國Thermo公司，批號：01116837)說明書反轉錄為cDNA，反應體系：0.5 μg RNA模板，1 μL引物，4 μL 5×反應緩釋液，1 μL RiboLock RNase抑制劑，2 μL 10 mM dNTP Mix，1 μL RevertAid M-MuLVRT，無RNA酶水補充至20 μL。再按照實時熒光PCR試劑說明書及預實驗確定的反應時間與溫度進行實時定量PCR，反應體系為：10 pmol引物、10 μL 2×Taq Master Mix、3 μL的cDNA模板和10 μL ddH2O，共25 μL體系。反應條件為95℃(10 min)預變性后，變性95℃(7 s)→退火60℃(20 s)→72℃(38 s)，40個循環周期。胃饑餓素上游引物：5′-GCAGCAGCGGCTTCACA-3′，下游引物：5′-ACATCCAAACAGGAGCGTCAT-3′；GAPDH上游引物：5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，下游引物：5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。 以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算胃饑餓素 mRNA的相對表達水平。

1.3.8 蛋白質印跡實驗：取方法1.3.3中的各組MIN6細胞，使用4℃預冷的磷酸緩沖鹽溶液洗滌細胞3次，2 min/次，加入RIPA細胞裂解液及蛋白酶抑制劑提取細胞中總蛋白。采用二喹啉甲酸法進行蛋白定量，將蛋白樣品加入5×上樣緩沖液(體積比為1 ∶4)，并于沸水中加熱變性10 min。取30 μg的蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳以分離蛋白，采用濕轉法將分離的蛋白轉至聚偏二氟乙烯膜上，5%的脫脂奶粉于室溫下封閉2 h后,分別加入Akt(1 ∶500)、p-Akt(1 ∶300)、Bax(1 ∶800)、Cleaved-Caspase-3(1 ∶800)、胃饑餓素(1 ∶500)、GAPDH(1 ∶1 500)一抗，4℃搖床孵育過夜。洗滌緩沖液清洗3次，5 min/次，以HRP標記的二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1 h，以洗滌緩沖液清洗3次，5 min/次。最后均勻滴加化學發光液發光液后，使用凝膠成像儀進行曝光拍照，Image J軟件測定條帶灰度值，以目標蛋白與內參GAPDH的比值作為其相對含量。以上實驗單獨重復3次。

1.4 統計學分析 采用SPSS 19.0和GraphPad Prism 5.0進行統計學分析，計量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗;計數資料以例數或百分比表示，比較采用χ2檢驗。采用Spearman法分析胃饑餓素水平與相關檢測指標間的相關性。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組孕產婦的臨床資料比較 兩組孕產婦的年齡、分娩時孕周、產前血壓、產前體質指數、胎盤質量、新生兒體重、新生兒性別比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)，而GDM組孕產婦的空腹血糖、FINS、HOMA-IR指數、臍帶血葡萄糖、臍帶血胰島素、臍帶血 HOMA-IR指數均高于對照組(均P<0.05)，見表1。

表1 兩組孕產婦臨床資料的比較

2.2 兩組孕產婦外周血和臍帶血胃饑餓素水平 GDM組外周血和臍帶血胃饑餓素表達水平均低于對照組(P<0.05)。見表2。Spearman相關分析顯示，對照組、GDM組孕產婦外周血胃饑餓素表達水平均與臍帶血胃饑餓素表達水平呈正相關(rs=0.434，P<0.001；rs=0.628，P<0.001)。

表2 兩組孕產婦外周血及臍帶血胃饑餓素水平的比較(x±s，pg/mL)

2.3 GDM孕產婦外周血及臍帶血胃饑餓素水平與糖代謝相關指標之間的相關性分析 Spearman相關分析顯示，GDM孕產婦外周血胃饑餓素水平與空腹血糖、FINS及HOMA-IR指數均呈負相關(rs=-0.481，P<0.001；rs=-0.352，P=0.036；rs=-0.412，P<0.001)，臍帶血胃饑餓素水平亦與空腹血糖、FINS及HOMA-IR均呈負相關(rs=-0.602，P<0.001；rs=-0.317，P<0.001；rs=-0.289，P<0.001)。

2.4 慢病毒感染后胰島B細胞胃饑餓素mRNA及蛋白的表達 與對照組相比，LV-胃饑餓素組細胞的胃饑餓素 mRNA與蛋白相對表達水平均增加(均P<0.05)，而LV-NC組細胞的胃饑餓素mRNA與蛋白相對表達水平的變化均無統計學意義(均P>0.05)，見表3及圖1。

表3 3組胰島B細胞胃饑餓素mRNA及蛋白的相對表達水平(x±s)

圖1 3組胰島B細胞中胃饑餓素蛋白的表達情況

2.5 過表達胃饑餓素對高糖誘導的胰島B細胞增殖的影響 培養48 h時，與對照組相比，高糖組、高糖+LV-NC組及高糖+LV-胃饑餓素組胰島B細胞增殖能力均降低(P<0.05)；而與高糖組相比，高糖+LV-胃饑餓素組胰島B細胞增殖能力增強(P<0.05)，高糖+LV-NC組的細胞增殖能力變化無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 4組胰島B細胞增殖能力的比較(x±s，吸光度值)

2.6 過表達胃饑餓素對高糖誘導的胰島B細胞凋亡的影響 與對照組相比，高糖組、高糖+LV-NC組及高糖+LV-胃饑餓素組胰島B細胞的凋亡率均降低(P<0.05)；而與高糖組相比，高糖+LV-胃饑餓素組胰島B細胞的凋亡率降低(P<0.05)，高糖+LV-NC組的細胞凋亡率變化無統計學意義(P>0.05)，見表5及圖2。

表5 4組胰島B細胞凋亡率的比較(x±s，%)

圖2 4組胰島B細胞的凋亡情況

2.7 過表達胃饑餓素對胰島B細胞胰島素分泌功能的影響 在低糖的條件下，低糖+LV-胃饑餓素組的胰島素釋放能力較低糖組明顯增加(P<0.05)，而低糖+LV-NC組無明顯改變(P>0.05)；在高糖的條件下，高糖+LV-胃饑餓素組的胰島素釋放能力亦較高糖組明顯增加(P<0.05)，而高糖+LV-NC組與高糖組差異無統計學意義(P>0.05)，見表6。

表6 各組胰島B細胞胰島素含量(x±s，μg/mL)

2.8 過表達胃饑餓素對高糖條件下胰島B細胞中PI3K/Akt信號通路表達的影響 與對照組相比，高糖組、高糖+LV-NC組、高糖+LV-胃饑餓素組及高糖+LY294002組胰島B細胞的p-Akt/Akt蛋白比值(Akt磷酸化水平)降低，而Bax及Cleaved-Caspase-3蛋白相對表達水平增加(P<0.05)；與高糖組、高糖+LV-NC組和高糖+LY294002組相比，高糖+LV-胃饑餓素組胰島B細胞的Akt磷酸化水平增加，Bax及Cleaved-Caspase-3蛋白相對表達水平降低(P<0.05)，見表7及圖3。

表7 胰島B細胞PI3K/Akt信號通路相關蛋白相對表達水平的比較(x±s)

圖3 各組胰島B細胞PI3K/Akt信號通路相關蛋白的表達情況

3 討 論

近年來，胃饑餓素作為既往具有GDM病史患者發生2型糖尿病的重要危險因素而逐漸得到重視[13]。胃饑餓素是主要由人體胃腸消化系統分泌的一種生物性多肽，其在下丘腦、心臟、胰腺細胞、肺及胎盤組織等其他組織中也有少量表達[14-16]。在體內，胃饑餓素作為一種促進食欲的多肽，不僅能夠促進食物的攝入和體重的增加，還能控制能量的代謝和胰島素的分泌，因此胃饑餓素在胰島素抵抗、肥胖及糖尿病等胰島素相關疾病的發生中具有重要作用[17-18]。而關于胃饑餓素與GDM的關系，既往大量研究已證實，GDM患者血清及胎盤組織中胃饑餓素的表達顯著降低，且胃饑餓素水平與GDM患者的血糖、三酰甘油等糖脂代謝指標及HOMA-IR指數呈負相關[9-11]，但目前關于胃饑餓素在GDM患者臍帶血中表達的研究甚少。

本研究結果顯示，GDM組外周血、臍帶血胃饑餓素表達水平均低于對照組(P<0.05)，提示胃饑餓素可能參與GDM的發生，這與既往研究結果[10-11，19]相似。此外，對照組、GDM組孕產婦外周血胃饑餓素表達水平均與臍帶血胃饑餓素表達水平呈正相關(P<0.05)，這說明妊娠母體胃饑餓素水平變化可能影響胎兒體內胃饑餓素的表達。進一步分析胃饑餓素與糖代謝指標的相關性，結果顯示GDM孕產婦外周血、臍帶血中的胃饑餓素表達水平均與其空腹血糖水平、胰島素水平及HOMA-IR指數呈負相關(P<0.05)，這表明胃饑餓素可能參與GDM患者及其胎兒的胰島素抵抗，且能影響兩者的血糖代謝過程。

研究顯示，胰島B細胞的數量減少及功能障礙與胰島素抵抗、GDM、糖尿病等代謝相關性疾病的發生和發展具有密切關系[3，6-7]。因此，本研究通過體外培養胰島B細胞MIN6，并通過慢病毒載體轉染以過表達胃饑餓素，從而進一步明確高糖環境下過表達胃饑餓素對胰島B細胞功能的影響。結果顯示，與對照組相比，LV-胃饑餓素組細胞的胃饑餓素mRNA與蛋白表達水平均增加(P<0.05)，說明成功建立了過表達胃饑餓素的胰島B細胞系。經高糖干預，高糖組的細胞增殖受到抑制，而凋亡率升高(P<0.05)；但與高糖組相比，高糖+LV-胃饑餓素組胰島B細胞增殖能力增強，凋亡率降低(P<0.05)。這提示過表達胃饑餓素能夠明顯減輕高糖對胰島B細胞增殖能力的抑制及促凋亡作用。此外，ELISA檢測顯示，在低糖或高糖條件下，過表達胃饑餓素的細胞的胰島素釋放能力均較低糖組或高糖組明顯增加(P<0.05)，提示無論在低糖或高糖環境中，過表達胃饑餓素均能促進胰島B細胞分泌胰島素。上述實驗結果表明，過表達胃饑餓素能夠改善高糖環境對胰島B細胞的功能損傷。

PI3K/Akt信號通路是與糖代謝密切相關的信號傳導途徑之一，該信號通路在胰島B細胞的生長、代謝、增殖、凋亡等過程中發揮重要的作用[20-21]。Akt是表達于多種組織及細胞中的一種絲/蘇氨酸激酶，有研究顯示Akt經磷酸化激活后有助于胰島B細胞抵抗糖脂毒性的損傷[22]。此外，有學者發現，脂肪酸能夠通過抑制Akt的磷酸化水平誘導胰島B細胞發生凋亡[23]。Bax是分布于細胞質的重要促凋亡蛋白，其在接受上游傳導的凋亡信號后被激活并發生分子構象的改變，隨即誘發細胞的一系列改變，促進細胞凋亡。凋亡蛋白酶Caspase-3是各種凋亡途徑的樞紐分子，也是細胞凋亡的指示劑，它的激活提示細胞已進入凋亡早期并最終發生細胞死亡[24]。本研究結果顯示，與高糖組與高糖+LV-NC組、高糖+LY294002X組相比，高糖+LV-胃饑餓素組胰島B細胞的Akt磷酸化水平增高，Bax及Cleaved-Caspase-3蛋白表達水平降低(P<0.05)，提示過表達胃饑餓素能夠顯著促進高糖環境中胰島B細胞的Akt磷酸化水平，并下調凋亡相關蛋白Bax與Cleaved-Caspase-3的表達；而預先使用LY294002處理細胞后，胰島B細胞中Akt磷酸化水平的抑制作用更為顯著，故凋亡相關蛋白Bax及Cleaved-Caspase-3蛋白表達水平出現明顯升高，這進一步提示促進PI3K/Akt信號通路的表達能有效保護胰島B細胞。

綜上所述，在GDM患者外周血及臍帶血中胃饑餓素表達均降低，且其與血糖水平和胰島素抵抗密切相關。過表達胃饑餓素能夠通過促進PI3K/Akt信號通路的活化來改善高糖所致的胰島B細胞損傷及功能障礙。