熟地黃多糖對前列腺癌PC-3細胞增殖凋亡的作用及對VEGF/Akt信號通路的影響

夏旭 崔洪泉 胡培森 王交托

河南省中醫院（河南中醫藥大學第二附屬醫院）泌尿外科（鄭州450000）

前列腺癌為男性生殖系統常見惡性腫瘤之一，對男性健康的危害性在全部腫瘤中位列第二［1］。目前，關于前列腺癌的傳統療法往往對局限性和激素敏感性病變有較好療效，但仍有小部分患者復發并轉移、轉化為激素抵抗型前列腺癌，這是泌尿腫瘤學最復雜的問題［2］。地黃是傳統補益類中藥，可經炮制、加工為熟地黃，熟地黃中多糖成分含量高，有抑瘤、增強免疫作用，已被證實在鼻咽癌等治療中獲取較為理想的效果［3-4］，但對前列腺癌細胞尤其是對雄激素非依賴性前列腺癌細胞作用的科學評價報道鮮見。據報道［5］，血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路在多種惡性腫瘤發展中有重要作用，參與細胞增殖、侵襲、凋亡。本實驗猜測VEGF/Akt 信號通路在雄激素非依賴性前列腺癌發展中發揮了作用，故基于該通路分析熟地黃多糖對前列腺癌PC-3 細胞增殖、侵襲、凋亡的影響，為熟地黃多糖在雄激素非依賴性前列腺癌治療中的進一步開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞人前列腺癌PC-3 細胞（上海傳秋生物科技有限公司，批號：CQ80165）。

1.1.2 藥物、試劑和儀器熟地黃多糖（陜西慈源生物有限公司，測定純度在90%以上），細胞凋亡AnnexinV/PI 檢測試劑盒（美國BD 公司），鼠抗人血管內皮細胞生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）、Akt、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）、p-Akt單克隆抗體（一抗）（美國Abcam 公司），辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的純化山羊抗小鼠IgG 二抗、β-actin 抗體（北京百奧萊博科技有限公司）。Transwell 小室（美國BD 公司），CytoFLEX 流式細胞儀（美國貝克曼庫爾特公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與分組將凍存的人前列腺癌PC-3 細胞復蘇，再置入含10%胎牛血清的DMEM培養液內，在5% CO2、37 ℃條件下培養，常規更換培養液，細胞貼壁后，采用0.25%胰蛋白酶消化、傳代，選取對數生長期細胞作為實驗對象。將PC-3細胞接種在96 孔板內，確保每個培養孔內約有1 ×106個細胞，每孔加入0.18 mL DMEM 培養液，繼續孵育24 h，PC-3 細胞貼壁后可分為4 組：空白組、低、中、高劑量組，分別予以0、20、40、60 μmol/L 熟地黃多糖溶液處理，每組平行設置5 個樣本。

1.2.2 MTT 法檢測人前列腺癌PC-3 細胞增殖情況取各組細胞，按上述方法培養24、48、72 h 后，滴入20 μL MTT 溶液（5 mg/mL）繼續培養4 h，棄上清，在培養孔內加入150 μL DMSO，搖床輕微震蕩10 min。采用Bio-Tek808 酶標儀檢測570 nm 波長處每孔吸光度值，計算細胞增殖抑制率，細胞增殖抑制率=（1-劑量組平均吸光度值/空白組平均吸光度值）×100%。

1.2.3 Transwell 侵襲實驗檢測PC-3 細胞侵襲能力采用OPTI-MEM培養基按3∶1比例稀釋Matrigel基質膠，鋪于Transwell 小室內，每孔40 μL，置入37 ℃孵箱內反應1 h，待Matrigel 基質膠凝固后備用。取各組細胞，按上述方法培養細胞72 h 后，采用胰蛋白酶消化、重懸，將細胞數調節為1 × 106個/mL，再將200 μL 細胞懸液接種在Transwell 小室上室（鋪有Matrigel 基質膠），再取600 μL 完全培養基加入下室，置入37 ℃培養箱內持續培養24 h。取出Transwell 小室，拭凈Transwell 小室膜上PC-3細胞，4%多聚甲醛固定10 min，以0.2%結晶紫對膜下PC-3 細胞進行染色，光鏡下隨機計數5 個高倍視野下細胞數，計數紫色染色穿膜細胞，取平均值，即細胞侵襲能力。

1.2.4 流式細胞儀檢測PC-3 細胞凋亡率采用Annexin-V-FITC/PI 雙染法檢測PC-3 細胞凋亡情況，取各組細胞，（1 × 106/孔）接種至6 孔板培養至72 h，再收集細胞，參考Annexin-V-FITC/PI 凋亡試劑盒步驟染色，即去離子水稀釋10×Binding Buffer為1×Binding Buffer，收集細胞，使用預冷1×PBS 重懸細胞1 次，2 000 rpm 離心10 min，洗滌細胞，加入300 μL 的1×Binding Buffer 懸浮細胞，Annexin-VFITC 標記，上機前5 min 加入5 μL 的PI 染色進行PI 標記，上機前補加200 μL 的1×Binding Buffer，上流式細胞儀檢驗，以相應軟件分析。

1.2.5 Western blot 法檢測細胞內VEGF/Akt 信號通路相關蛋白表達取各組細胞，接種至6 孔板培養至72 h，轉入離心管，2 500 ×g離心10 min，棄上清液，按細胞量加入細胞抽提試劑，裂解15 min。1 000 ×g離心10 min，棄上清液，BCA 法提取總蛋白。調節蛋白濃度，加入1/5 體積的5×Buffer，沸水浴10 min 變性，每孔上樣20 μg，采用10%濃度的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，0.1% TBST 洗膜5 次。一抗孵育VEGFR2（1∶400）、Akt（1∶500）、PI3K（1∶500）、p-Akt（1∶1 000）、β-actin（1∶1 000）抗體，4 ℃過夜，TBST 緩沖液洗膜2 次，HRP 標記的純化山羊抗小鼠IgG 二抗（1∶2 000）室溫孵育0.5 h。ECL 顯色，采集圖像分析，目的蛋白與β-actin 灰度值之比為VEFGR2、Akt、p-Akt 蛋白相對表達量。

1.3 統計學方法采用SPSS 19.0 統計軟件分析數據，計量資料以均數±標準差表示，采用單因素方差分析，再用t檢驗行兩兩比較。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 熟地黃多糖對人前列腺癌PC-3 細胞增殖的抑制作用隨著熟地黃多糖處理濃度增加，PC-3細胞增殖抑制率逐漸升高，呈明顯濃度依賴性，且呈時間梯度升高（P＜0.05）。見表1、圖1。

表1 不同時間點、不同濃度熟地黃多糖對PC-3 細胞增殖抑制率Tab.1 Inhibitory rate of Rehmannia glutinosa polysaccharide on PC-3 cell proliferation at different time and concentrations ±s，%

表1 不同時間點、不同濃度熟地黃多糖對PC-3 細胞增殖抑制率Tab.1 Inhibitory rate of Rehmannia glutinosa polysaccharide on PC-3 cell proliferation at different time and concentrations ±s，%

注：a 與空白組比較，P＜0.05；b 與低劑量組比較，P＜0.05；c 與中劑量組比較，P＜0.05；d與24 h比較，P＜0.05；e與48 h比較，P＜0.05

組別空白組低劑量組中劑量組高劑量組F 值P 值24 h 0.04±0.01 14.82±2.15a 37.69±4.34ab 45.98±5.48abc 165.430＜0.001 48 h 0.06±0.02 20.34±2.67ad 44.31±4.14abd 53.18±5.17abcd 226.244＜0.001 72 h 0.11±0.03 29.64±3.88ade 49.66±5.19abde 67.48±6.43abcde 200.316＜0.001

2.2 熟地黃多糖對人前列腺癌PC-3 細胞侵襲能力的影響隨著熟地黃多糖處理濃度增加，PC-3細胞的穿膜細胞數逐漸減少，有明顯濃度依賴性（P＜0.05）。見表2、圖1。

表2 不同濃度熟地黃處理PC-3 細胞的穿膜細胞數Tab.2 The number of penetrating cells in PC-3 cells treated with different concentrations of Rehmannia glutinosa ±s

表2 不同濃度熟地黃處理PC-3 細胞的穿膜細胞數Tab.2 The number of penetrating cells in PC-3 cells treated with different concentrations of Rehmannia glutinosa ±s

注：a 與空白組比較，P＜0.05；b 與低劑量組比較，P＜0.05；c 與中劑量組比較，P＜0.05

組別 空白組 低劑量組 中劑量組 高劑量組F 值P 值穿膜細胞數（個/視野）44.78±3.5236.14±3.38a25.58±2.46ab12.78±1.08abc122.899＜0.001

圖1 不同濃度熟地黃處理PC-3 細胞的穿膜細胞數（結晶紫染色，×40）Fig.1 The number of invasive cells in PC-3 cells treated with different concentrations of Rehmannia glutinosa（crystal violet staining，×40）

2.3 熟地黃多糖對人前列腺癌PC-3細胞凋亡率的影響隨著熟地黃多糖處理濃度增加，PC-3 細胞凋亡率逐漸升高，有明顯濃度依賴性（P＜0.05）。見表3、圖2。

表3 不同濃度熟地黃處理PC-3 細胞凋亡率Tab.3 apoptosis rate of PC-3 cells treated with different concentrations of Rehmannia glutinosa ±s

表3 不同濃度熟地黃處理PC-3 細胞凋亡率Tab.3 apoptosis rate of PC-3 cells treated with different concentrations of Rehmannia glutinosa ±s

注：a 與空白組比較，P＜0.05；b 與低劑量組比較，P＜0.05；c 與中劑量組比較，P＜0.05

空白組 低劑量組 中劑量組 高劑量組F 值P 值組別凋亡率1.03±0.19 8.77±0.69a 17.57±1.42ab 21.97±1.71abc 318.803＜0.001

圖2 不同濃度熟地黃處理PC-3 細胞凋亡率Fig.2 Apoptosis rate of PC-3 cells treated with different concentrations of Rehmannia glutinosa

2.4 人前列腺癌PC-3細胞中VEGF/Akt 信號通路相關蛋白表達隨著熟地黃多糖處理濃度增加，PC-3 細胞中VEGFR2、p-PI3K、p-Akt 蛋白表達逐漸下調，有明顯濃度依賴性（P＜0.05），PI3K、Akt 蛋白表達組間對比差異無統計學意義（P＞0.05）。見表4、圖3。

表4 不同濃度熟地黃處理PC-3 細胞中VEGF/Akt 信號通路相關蛋白表達Tab.4 expression of VEGF/Akt signaling pathway related proteins in PC-3 cells treated with different concentrations of Rehmannia glutinosa ±s

表4 不同濃度熟地黃處理PC-3 細胞中VEGF/Akt 信號通路相關蛋白表達Tab.4 expression of VEGF/Akt signaling pathway related proteins in PC-3 cells treated with different concentrations of Rehmannia glutinosa ±s

注：與空白組比較，aP＜0.05；與低劑量組比較，bP＜0.05；與中劑量組比較，cP＜0.05

組別VEGFR2Aktp-AktPI3Kp-PI3K空白組0.88±0.131.25±0.140.91±0.111.20±0.130.88±0.12 aa 低劑量組中劑量組高劑量組F 值P 值0.65±0.11 0.49±0.09ab 0.32±0.05abc 28.704＜0.001 1.22±0.16 1.26±0.17 1.24±0.15 0.060 0.980 0.58±0.09 0.37±0.06ab 0.25±0.03abc 67.713＜0.001 1.21±0.15 1.19±0.17 1.22±0.14 0.038 0.990 0.52±0.11 0.31±0.08 0.20±0.03 53.033＜0.001

圖3 PC-3 細胞中VEGF/Akt 信號通路相關蛋白表達Western blot 條帶圖Fig.3 Expression of VEGF/Akt signaling pathway related proteins in PC-3 cells by Western blot

3 討論

前列腺癌發病機制與原癌基因激活，抑癌基因失活密切相關，細胞增殖、凋亡失衡為其發生和發展的主要因素［6］。中藥乃我國藥用資源寶庫，大約50%的癌癥化療藥物源自中藥材天然產物及其衍生物，部分中藥具有抑制癌細胞增殖、誘導癌細胞凋亡的效果［7-8］。地黃有“補血之君，壯水之主”的美稱，是傳統延年益壽的中藥，熟地黃多糖作為地黃有效成分之一，在改善腫瘤微環境、抑制腫瘤增殖轉移等有良好效果。因此選用熟地黃多糖為實驗藥物，分析治療前列腺癌中的抗腫瘤活性以及誘導凋亡機制，為新藥研發奠定藥理基礎。

李哲等［9］在抑制鼻咽癌增殖轉移中靶向采用熟地黃多糖治療，發現熟地黃多糖在鼻咽癌增殖轉移抑制中有一定時間、劑量依賴性；董靜等［10］報道熟地黃多糖可誘導肝癌細胞凋亡，共同提示了熟地黃多糖在抑制癌細胞增殖、凋亡方面有一定作用。本研究結果顯示：在0、20、40、60 μmol/L 熟地黃多糖處理前列腺癌PC-3 細胞72 h 后，PC-3 細胞增殖抑制率隨著熟地黃多糖濃度、培養時間延長而持續提高，提示地黃多糖對前列腺癌PC-3 細胞有增殖抑制作用，呈劑量、時間依賴效應；在抑制前列腺癌PC-3 細胞侵襲、誘導凋亡方面，熟地黃多糖亦呈現出明顯劑量依賴性，初步證明了熟地黃多糖對雄激素非依賴性前列腺癌有治療作用。

惡性腫瘤的產生、進展實質上是打破了細胞增殖、凋亡的動態平衡，因而研究癌細胞增殖、侵襲以及凋亡機制十分必要［11-12］。信號通路是相關學者研究癌細胞凋亡的重點關注問題，林星長等［13］研究發現，前列腺癌PC-3 細胞抗凋亡的主要機制是抑制VEGF/Akt 信號通路。VEGF 受體家族包括VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3 三個成員，其中VEGFR2 是負責調節腫瘤血管生成的信號轉導通路，可特異性抑制癌細胞轉移、增殖并誘導凋亡［14］。因VEGFR2 能夠促進腫瘤細胞生成，天然成為抑制實體瘤生長的靶標，阻斷VEGF/VEGFR2 信號轉導可謂抗癌過程中的重要策略［15-16］。Akt 為VEGFR2 下游效應因子，可在不同信號刺激下經磷酸化誘導下游靶點，刺激腫瘤細胞生成［17-18］。Akt 是PI3K/Akt 信號傳導通路的重要激酶，被上游激酶激活后，進入細胞核磷酸化轉錄因子，從而調節細胞增殖、侵襲、凋亡等細胞行為［19-20］。本研究結果顯示：隨著熟地黃多糖處理濃度增加，PC-3 細胞中VEGFR2、p-PI3K、p-Akt 蛋白表達逐漸下調，有明顯濃度依賴性，提示熟地黃多糖可能通過抑制VEGF/Akt 信號通路發揮抗前列腺癌的作用。

綜上所述，熟地黃多糖對前列腺癌PC-3 細胞有抑制增殖、侵襲以及誘導凋亡的作用，可能通過抑制VEGF/Akt 信號通路實現的。本次研究成果豐富了關于中藥治療雄激素非依賴性前列腺癌的報道，有一定參考價值。但前列腺癌PC-3 細胞增殖、侵襲、凋亡可能受多條信號通路調控，本研究不足之處在于僅完成了VEGF/Akt 信號通路研究，且局限于雄激素非依賴性前列腺癌的治療，應進一步進行其他相關通路研究，不斷完善熟地黃多糖抗前列腺癌PC-3 細胞的具體機制方面研究，為中醫藥治療前列腺癌提供新道路。