IRE1a與miR-346相互調(diào)節(jié)維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激強度促進宮頸癌細胞順鉑耐藥

郭軍飛 賴衛(wèi)明 馬從利 穆小萍

廣東省婦幼保健院檢驗科（廣州510000）

宮頸癌是威脅婦女健康的常見疾病［1-2］。早期宮頸癌治療的主要方法是手術(shù)切除，已轉(zhuǎn)移或復發(fā)性宮頸癌的主要治療方法是順鉑（cisplatin）單獨或者聯(lián)合其他藥物化療，但宮頸癌細胞對順鉑獲得性耐受常導致化療失敗［3-4］。化療常導致腫瘤細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（edoplasmic reticulum stress，ERS），研究［5-8］表明ERS 既可介導某些化療藥物對細胞的殺傷，又參與了腫瘤細胞對某些化療藥的耐受。順鉑通過誘導DNA 損傷導致細胞凋亡［4，9］，目前ERS 在宮頸癌細胞順鉑耐藥中的作用和機制尚未明確。

miRNA 異常表達與多種疾病發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［11-12］。miRNA 既可調(diào)控ERS 過程，其表達水平也可被ERS 調(diào)節(jié)［13-16］。在宮頸癌細胞中，ERS 調(diào)節(jié)因子IRE1a 通過下調(diào)miR-125b 的表達促進細胞的凋亡［17］，有研究［18］發(fā)現(xiàn)IRE1a 可以上調(diào)miR-346的表達抑制細胞凋亡，目前ERS 條件下IRE1a 在促進或者抑制細胞凋亡轉(zhuǎn)換的機制尚未明確，IRE1a、miR-346 和miR-125b 三者間的關(guān)聯(lián)以及其在宮頸癌細胞順鉑耐藥中的作用還不清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)ERS 調(diào)節(jié)因子IRE1a 促進miR-346的表達，同時miR-346 反饋抑制IRE1a 的表達間接調(diào)控miR-125b 的表達，防止內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激強度過大，促進宮頸癌細胞對順鉑耐藥，本研究揭示了一種宮頸癌細胞順鉑耐藥的機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)和相關(guān)試劑本研究中使用到的宮頸癌細胞系均從美國典型培養(yǎng)物保存中心（American type culture collection）購買。采用含10% 胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2。通過向培養(yǎng)基中加入濃度逐漸增加的順鉑篩選順鉑耐藥的宮頸癌細胞。采用LipofectamineTM2000（Invitrogen，Carlsbad，CA）進行細胞轉(zhuǎn)染。通過向細胞培養(yǎng)基中加入終濃度為300 nmol/L 的毒胡蘿卜素（thapsigargin，Tg）誘導細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。轉(zhuǎn)染細胞所用的質(zhì)粒等均來源于課題組前期構(gòu)建。

1.2 RNA 提取以及實時熒光定量PCR 檢測用Trizol（Invitrogen，Carlsbad，CA）試劑提取細胞總RNA。采用MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（TAKARA，大連，中國）進行逆轉(zhuǎn)錄，并采用iCycler 實時定量PCR 檢測系統(tǒng)（Bio-rad）進行目標基因的定量PCR 檢測，U6 snRNA 和β-actin 作為內(nèi)參基因同時被檢測。本研究中使用到的引物序列如下，內(nèi)參基因U6 反轉(zhuǎn)錄引物序列：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′，上游序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游序列：5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。IRE1a定量PCR 上游引物5′-CTCTTCCAGCCCTACTACTTCCACG-3′，IRE1a 定量PCR 下游引物5′-TGTACGATTCCCTCCTCTCCCTTCC-3′；IRE1a 3′UTR 上游引物：5′ CGGAATTCCTCATATCCATGCCCAATGCACACG 3′，IRE1a 3′UTR 下游引物：5′CCGCTCGAGTTCTCTGGGTGCAAGCAGTCAAGGC 3′；IRE1a 過表達質(zhì)粒上游引物：5′CGGGATCCATGCCGGCCCGGCGGCTGCTGCTGC 3′，下游引物：5′ GGAATTCTCAGAGGGCGTCTGGAGTCACTGGG 3′。

1.3 細胞凋亡檢測細胞進行相應轉(zhuǎn)染和/或藥物處理后，將細胞收集，用冰冷的1×PBS 洗細胞兩遍后將細胞重懸在結(jié)合緩沖液中，加入5 μL FITC-標記的annexin V（Invitrogen，Carlsbad，CA），室溫避光放置15 min 后加入5 μL 碘化丙啶，室溫避光作用10 min 后，通過流式細胞儀進行檢測，所有檢測在染色完成后30 min 內(nèi)完成。

1.4 Western blot細胞進行相應轉(zhuǎn)染和/或藥物處理后，將細胞收集，用含0.1% SDS，1% NP-40，1 mmol/L MgCl2and 10 mmol/L Tris，pH 8.0 的裂解液裂解細胞制備蛋白樣品。通過SDS-PAGE 膠分離蛋白并轉(zhuǎn)印至經(jīng)甲醇預處理的PVDF 膜上，用1× TBST 溶液配制的5%脫脂牛奶封閉PVDF 膜1 h，加入相應的一抗，4℃孵育過夜，用1× TBST 溶液洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h，洗膜后顯影曝光。

1.5 統(tǒng)計學方法計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，組間的差異采用t檢驗進行比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激調(diào)節(jié)因子IRE1a 促進miR-346 的表達與親本細胞相比，順鉑耐藥的宮頸癌細胞存在基礎水平的ERS（圖1A），在順鉑處理條件下順鉑耐藥細胞的ERS 強度維持穩(wěn)定，而親代細胞ERS 強度明顯高于耐藥細胞（圖1B）。通過基因芯片和實時熒光定量PCR 檢測，發(fā)現(xiàn)與親本細胞相比順鉑耐藥細胞中多種miRNA 表達發(fā)生顯著變化，其中miR-346、miR-125b 等表達上調(diào)（表達分別上調(diào)4.9 倍和1.6 倍），miR-138 和miR-34a 表達下調(diào)（相對表達分別是親代細胞的53%和40%）。通過特異性抑制劑或者通過小干擾RNA（small inhibitory RNA，siRNA）抑制UPR 不同通路的關(guān)鍵因子，發(fā)現(xiàn)IRE1a 參與順鉑耐藥細胞miR-346 表達水平的上調(diào)（圖1C、D）。

圖1 親本細胞和順鉑耐藥細胞ERS 和miRNA 表達情況比較Fig.1 Comparison of ERS state and miRNA expression between parental and cisplatin-resistant cells

2.2 miR-346 參與宮頸癌細胞順鉑耐藥的調(diào)控在順鉑耐藥的宮頸癌細胞中封閉miR-346 可以降低順鉑的半數(shù)抑制濃度，促進細胞發(fā)生凋亡；而在親本細胞中過表達miR-346 可以增加順鉑的半數(shù)抑制濃度，減少細胞凋亡（圖2A-C）。在親本細胞中過表達miR-346 可以減輕順鉑引起的ERS 強度，而在順鉑耐藥細胞中封閉miR-346 導致順鉑引起的ERS 增強（圖2D、E）。

圖2 miR-346 調(diào)節(jié)順鉑引起的ERS 強度和細胞凋亡Fig.2 miR-346 modulates ER strength and cellular apoptosis caused by cisplatin

2.3 miR-346 抑制IRE1a 的表達促進宮頸癌細胞順鉑耐藥生物信息學預測提示miR-346 可以調(diào)控IRE1a 的表達，雙熒光素酶報告實驗結(jié)果證實miR-346 可以靶定野生型IRE1a 3′ UTR（圖3A）。在親本細胞中過表達外源性miR-346 可以導致IRE1a mRNA 和蛋白水平均降低，而在順鉑耐藥細胞中封閉內(nèi)源性miR-346 則導致IRE1a mRNA和蛋白水平升高（圖3B、C）。封閉順鉑耐藥細胞內(nèi)源性miR-346 可降低順鉑的半數(shù)抑制濃度，增加順鉑誘導的細胞凋亡；封閉順鉑耐藥細胞內(nèi)源性miR-346 同時通過siRNA 敲降內(nèi)源性IRE1a 的表達，可以部分挽救封閉內(nèi)源性miR-346 引起的細胞凋亡（圖3D、E）。封閉順鉑耐藥細胞內(nèi)源性miR-346 可導致ERS 強度增加，同時敲降內(nèi)源性IRE1a可以部分逆轉(zhuǎn)ERS 強度的增加（圖3F）。

圖3 IRE1a 是miR-346 的功能性靶基因Fig.3 IRE1a is functional target of miR-346

2.4 miR-125b 受IRE1a-miR-346 軸調(diào)節(jié)并參與宮頸癌細胞順鉑耐藥在宮頸癌細胞中過表達外源性IRE1a 可顯著降低宮頸癌細胞中pre-miR-125b 和miR-12b 的表達水平，而過表達外源性miR-346 可導致宮頸癌細胞中pre-miR-125b 和miR-125b 水平升高（圖4A）。在順鉑耐藥細胞中封閉miR-346 可導致細胞中pre-miR-125b 和miR-125b水平的降低，而同時敲降IRE1a 的表達部分逆轉(zhuǎn)pre-miR-125b 和miR-125b 水平的降低（圖4B）。封閉順鉑耐藥細胞內(nèi)源性miR-346 可導致順鉑半數(shù)抑制濃度的降低和細胞凋亡水平的增加，封閉miR-346 同時過表達外源性miR-125b 可以部分逆轉(zhuǎn)封閉內(nèi)源性miR-346 引起的順鉑半數(shù)抑制濃度的降低和細胞凋亡水平的增加（圖4C、D）。

圖4 miR-125b 受IRE1a-miR-346 軸調(diào)節(jié)并參與宮頸癌細胞順鉑耐藥Fig.4 miR-125b is regulated by IRE1a-miR-346 axis and involves in cervical cell cisplatin-resistant regualtion

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)相對于順鉑敏感的親代細胞，順鉑耐藥細胞存在基礎水平的ERS 避免順鉑引起強度過大的ERS。耐藥細胞中miR-346 的表達高于親本細胞，且miR-346 在宮頸癌順鉑耐藥中發(fā)揮著重要的功能。當細胞發(fā)生ERS 時，UPR 的三條通路將被激活以恢復細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，IRE1α、PERK以及ATF6是三條UPR通路的關(guān)鍵分子［19-21］。本研究中，特異性抑制IRE1a 通路可以抑制耐藥細胞miR-346 表達并促進順鉑誘導細胞凋亡，提示IRE1a 是ERS 調(diào)控宮頸癌細胞順鉑耐藥的關(guān)鍵分子。

IRE1a 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的跨膜蛋白。在輕度ERS條件下，IRE1a 通過剪切XBP1 mRNA 編碼區(qū)的一個選擇性內(nèi)含子，生成具有超強轉(zhuǎn)錄能力的轉(zhuǎn)錄因子XBP1（s），促進多種應激基因的表達，使細胞內(nèi)環(huán)境恢復穩(wěn)態(tài)［15］；但是長時間的ERS 或者ERS強度過大，IRE1a 導致多種mRNA 降解，細胞內(nèi)環(huán)境無法恢復從而啟動細胞凋亡［17］。ERS 條件下IRE1a 活性的調(diào)控受多種因素調(diào)控，研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上IRE1a 的分布密度與其激活形式有關(guān)，而不同激活狀態(tài)下IRE1a 對細胞活性的調(diào)節(jié)存在差異［21］。順鉑耐藥細胞中miR-346 可以抑制IRE1a表達，影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上IRE1a 的分布密度，繼而影響其對細胞活性的調(diào)節(jié)。

miRNA 是調(diào)控基因表達的重要因子，其異常表達與多種疾病相關(guān)。miR-346 位于GRID1 基因第二內(nèi)含子區(qū)，其表達獨立于其宿主基因，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激條件下XBP1（s）可以促進miR-346 表達［15］。通過調(diào)節(jié)不同靶基因的表達，miR-346 在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和腫瘤對治療的應答中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用［22-24］。在宮頸癌細胞中，miR-346 通過調(diào)控hTERT 和GSK3β的表達促進宮頸癌細胞在應激條件下存活［18］，但是miR-346 是否參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激本身的調(diào)控還未見有報道。本研究發(fā)現(xiàn)在宮頸癌細胞中miR-346 可以調(diào)控IRE1a 的表達，封閉內(nèi)源性miR-346 導致IRE1a 的 表 達增加，ERS 強 度 增加，宮頸癌細胞對順鉑的耐藥性降低。研究［15］已經(jīng)證實IRE1a 可以通過XBP1 促進miR-346 的表達，而XBP1 可以反饋抑制IRE1a 的表達［25］。本研究提示miR-346 可能是XBP1 反饋抑制IRE1a 表達的中間分子，在ERS 條件下miR-346 通過負反饋抑制IRE1a 的表達，使ERS 強度維持在適當水平，避免ERS 強度過大引起細胞凋亡。

在持續(xù)ERS 存在條件下，IRE1a 核酸內(nèi)切酶活性增強，其作用的RNA 譜發(fā)生變化，可以導致多種miRNA 的表達異常［17］。在ERS 條件下IRE1a 可以降解miR-125b 初始轉(zhuǎn)錄本，導致成熟miR-125b水平降低，解除miR-125b 對其靶基因caspase2 表達的抑制，導致細胞的凋亡［17］。在宮頸癌細胞中miR-125b 的表達受到IRE1a 和miR-346 的調(diào)控，且miR-125b 可以部分挽救封閉內(nèi)源性miR-346 引起的耐藥細胞順鉑半數(shù)抑制濃度的降低和細胞凋亡的增加，提示miR-125b 可能是miR-346 的下游分子。

綜上所述，順鉑耐藥宮頸癌細胞中基礎水平ERS 通過上調(diào)miR-346，負反饋抑制ERS 調(diào)節(jié)因子IRE1a 表達，使得ERS 維持在適當水平，避免IRE1a 過度活化導致miR-125b 異常表達，維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，促進宮頸癌細胞順鉑耐藥。在本次研究中，僅使用了前期實驗篩選的宮頸癌順鉑耐藥細胞進行實驗，因此本研究結(jié)論是否具有普遍性還有待進一步驗證。此外，本研究都是細胞/分子水平的研究，暫未開展動物實驗，因此尚未明確體內(nèi)是否存在調(diào)控關(guān)系。后期將在其他不同細胞系開展實驗，進行動物實驗，收集臨床順鉑治療有效和無效的宮頸癌患者腫瘤組織標本進行驗證。