21基因檢測對早期Luminal A型乳腺癌治療指導作用研究

韓金怡，蘇志勇

(1.錦州醫(yī)科大學赤峰學院培養(yǎng)基地，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；2.赤峰學院附屬醫(yī)院乳腺外科，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；3.赤峰學院附屬醫(yī)院胸外科，內(nèi)蒙古 赤峰 024000)

近年來臨床采用以手術(shù)為中心，以放化療、內(nèi)分泌治療為輔助的綜合治療模式顯著降低了乳腺癌復發(fā)和病死率，但有一部分患者化療獲益甚少，在予以相同臨床干預情況下，后期疾病轉(zhuǎn)歸大不相同，醫(yī)生對化療獲益程度及復發(fā)風險等級的判斷缺乏客觀指標支持，因此乳腺癌尤其是早期乳腺癌患者術(shù)后管理及治療決策一直是臨床爭議的焦點，準確對其復發(fā)風險進行評估有重要意義[1-2]。基于此背景，乳腺癌21基因檢測應運而生。相關(guān)研究[3-4]發(fā)現(xiàn)，21個腫瘤相關(guān)基因的表達量和乳腺癌復發(fā)風險相關(guān)，該21個基因由6組基因組合而成。Luminal A型是乳腺癌患者常見的分子分型，研究[5]發(fā)現(xiàn)有脈管轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑>2 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是Luminal A型乳腺癌患者術(shù)后復發(fā)轉(zhuǎn)移的危險因素，但利用21基因檢測評估乳腺癌患者復發(fā)風險影響因素的研究甚少。本研究主要分析乳腺癌21基因檢測對早期Luminal A型乳腺癌治療的指導作用及其相關(guān)因素。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月至2019年12月內(nèi)蒙古赤峰學院第一附屬醫(yī)院接受相關(guān)診治的雌激素受體(ER)和(或)孕激素受體(PR)陽性、人表皮生長因子受體-2(HER-2)陰性、經(jīng)病理認定腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性的早期Luminal A型乳腺癌患者174例，均為女性，年齡18～70歲，平均(44.19±4.57)歲。病例納入標準：①術(shù)后經(jīng)組織病理學確診為非特殊型浸潤性乳腺癌[6]；②ER/PR(+)，HER-2(-)或HER-2(+)或HER-2()，如果為HER-2()，則需經(jīng)熒光原位雜交技術(shù)檢測且結(jié)果為陰性；③腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移經(jīng)病理檢測為陰性；④血常規(guī)、肝腎功能無明顯異常；⑤患者及家屬同意行21基因檢測并得出復發(fā)風險分數(shù)(RS)。排除標準：①全身檢查如磁共振、超聲、CT及PET/CT等發(fā)現(xiàn)有其他臟器轉(zhuǎn)移者；②對內(nèi)分泌治療有禁忌證或在化療前經(jīng)相關(guān)檢查有化療禁忌證者；③處于育齡期患者，經(jīng)血清妊娠試驗結(jié)果為陽性，或正在哺乳期者；④有嚴重內(nèi)臟器質(zhì)性病變或體力狀況評分在1分以上、臨床資料不完整者。本研究經(jīng)醫(yī)院相關(guān)倫理委員會書面同意，且患者或家屬均已簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 免疫組織化學染色：采用組織芯片制作機細針打孔方法從患者組織蠟塊(稱為供體蠟塊)中采集數(shù)十至上百圓柱形小組織(組織芯)，并將組織芯整齊排列到另一空白蠟塊(受體蠟塊)中，隨即制成組織芯片蠟塊。對組織芯片蠟塊進行切片后轉(zhuǎn)移到載玻片上制成組織芯片。將采集到的組織芯片制成4 μm連續(xù)切片，以二甲苯脫蠟和梯度酒精水化，切片后經(jīng)檸檬酸鹽緩沖液(pH=6.0)微波抗原修復，以3% H2O2及非免疫血清分別滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性與非特異性結(jié)合位點，再與一抗ER、PR、HER-2及Ki67于4 ℃條件下孵育過夜。第2天切片經(jīng)PBS沖洗后滴加生物素標記的二抗，DAB顯色，蘇木素復染。PBS代替一抗做陰性對照，以排除二抗非特異性結(jié)合。

1.2.2 21基因檢測：采用羅氏Roche 480熒光定量PCR(RT-PCR)儀進行21基因檢測。由廣州閱微醫(yī)學檢驗所(以下簡稱檢驗所)與赤峰學院附屬醫(yī)院簽訂外送協(xié)議，檢驗所將21基因檢測結(jié)果與美國Oncotype Dx?試驗數(shù)據(jù)進行對比，結(jié)果應完全一致，以液相芯片技術(shù)替代傳統(tǒng)RT-PCR擴增技術(shù)檢測所有患者乳腺癌組織石蠟切片21基因在腫瘤組織中的表達情況。將檢測結(jié)果量化為RS。RS=20×(RSu-6.7)，其中Rsu為未校正的RS評分。RS范圍0～100分，數(shù)值越大，復發(fā)風險越高，越能從化療中獲益。RS<18分確定為低度復發(fā)風險，18分≤RS<31分確定為中度復發(fā)風險，RS≥31分確定為高度復發(fā)風險[7]。在本研究中，預先設(shè)定RS<18分為低風險組，RS≥18分為中高風險組。

1.2.3 治療方案選擇與評估：對患者進行術(shù)前病情評估，術(shù)后標本經(jīng)組織芯片制備及免疫組織化學染色得出患者免疫組化結(jié)果及TNM分期，依據(jù)美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)指南[8]分為低復發(fā)風險組及高復發(fā)風險組，均由內(nèi)蒙古赤峰學院第一附屬醫(yī)院乳腺外科科室根據(jù)指南討論后制定治療方案，對低復發(fā)風險組[進行單純內(nèi)分泌治療(H方案)]和高復發(fā)風險組[進行化療序貫內(nèi)分泌治療(CH方案)]。兩組患者均在其同意下進行21基因檢測并得出RS，再根據(jù)RS制定方案，當RS<18分時(低風險組)可單純進行H方案治療，當RS≥18分時(中/高風險組)可進行CH方案治療。利用傳統(tǒng)TNM分期結(jié)合NCCN指南制定兩組患者的不同治療方法，分別與21基因檢測所得出的RS及不同分組治療意見進行對比，總結(jié)兩組患者經(jīng)不同檢測方法制定的治療方法間的差異，進而得出目前應用21基因檢測所帶來相應治療方案選擇上的精準度。

1.2.4 患者隨訪：對所有患者隨訪至2019年12月，中位隨訪時間36個月。隨訪方式為患者出院后定期復查結(jié)果、電話隨訪，21基因檢測前及檢測后所有患者均未出現(xiàn)局部或遠位臟器轉(zhuǎn)移情況。

1.2.5 資料收集：收集所有患者臨床資料，包括年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、腫瘤直徑、病理組織學分級、脈管癌栓、Ki67等，分析其與RS的相關(guān)性。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)，計數(shù)資料以[例(%)]表示，組間比較采用χ2檢驗或配對卡方檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 患者組織染色結(jié)果 見圖1。早期Luminal A型乳腺癌患者中ER、PR均為陽性表達。部分患者HER-2呈陽性表達或陰性表達，Ki67呈高表達或低表達。根據(jù)NCCN指南，只要ER、PR為陽性，即進行內(nèi)分泌治療，且隨ER、PR陽性率增高，其內(nèi)分泌治療效果越明顯。

A：ER(+)；B：ER(-)；C：PR(+)；D：PR(-)；E：HER-2()；F：HER-2(-)；G：Ki67高表達；H：Ki67低表達

2.2 21基因檢測及RS評估前后治療決策對比 見表1。21基因檢測及RS評估前，初步確定66例(37.9%)適用于H方案，均為低復發(fā)風險者；108例(62.1%)患者適用于CH方案，其中低風險者66例(37.9%)，中高風險者42例(24.2%)。經(jīng)21基因檢測進行復發(fā)風險評估后決策發(fā)生變化，共132例(75.9%)建議進行H方案治療，其中66例(37.9%)從建議進行CH方案治療改為H方案治療，低風險者48例(27.6%)，中高風險者18例(10.3%)；建議進行CH方案者42例(24.2%)，其中低復發(fā)風險者6例(3.5%)，中高復發(fā)風險者36例(20.7%)，無增加輔助化療者。經(jīng)統(tǒng)計學分析，21基因檢測及RS評估前后治療方案比較有統(tǒng)計學差異(P<0.01)。

表1 21基因檢測及RS評估前后治療決策對比[例(% )]

2.3 臨床特征與RS相關(guān)性分析 見表2。復發(fā)風險與年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、腫瘤直徑、病理組織學分級等無明顯相關(guān)性(均P>0.05)，而與Ki67表達及脈管癌栓相關(guān)(均P<0.01)。

表2 臨床特征與RS相關(guān)性分析[例(% )]

3 討 論

多數(shù)惡性腫瘤早期均無明顯癥狀、體征，乳腺癌患者在這方面尤其顯得突出。但隨著人們健康意識增強，很多乳腺癌患者通過體檢發(fā)現(xiàn)乳腺腫塊并通過其他手段得以確診，因此早期乳腺癌患者增加。隨著診療技術(shù)逐漸完善，早期乳腺癌患者經(jīng)系統(tǒng)規(guī)范的綜合治療后，大多數(shù)取得較好預后[9]。乳腺癌為高度異質(zhì)性疾病，其分子分型又稱為Luminal分型，是臨床上根據(jù)乳腺癌的免疫組化染色結(jié)果表現(xiàn)進行劃分的，至少分為十幾個亞型，因技術(shù)條件所限，臨床上無法精準分型，常分為Luminal A型、Luminal B型、HER-2陽性及三陰性乳腺癌[10-11]，其中Luminal A型為較常見分子亞型，復發(fā)率低，對內(nèi)分泌治療敏感，對化療不敏感。乳腺癌21基因檢測的21個基因由6組基因組合而成，其中5組腫瘤相關(guān)基因包括增殖相關(guān)基因(Ki67、STK15、Survivin、Cyclin B1、Mybl2)、侵襲相關(guān)基因(Stromely sin3、Cathepsin L2)、HER-2相關(guān)基因(GRB7、HER-2)、激素相關(guān)基因(ER、PR、Bcl-2、Scube2)、其他基因(GSTM1、BAG1、CD68)以及內(nèi)參基因(β-actin、GAPDH、RPLPO、GUS、TFRC)[12-13]，然而目前關(guān)于21基因檢測在Luminal A型患者治療中的指導意義研究甚少。

楊玉慶等[14]發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌患者中，與低危組比較，中高危組接受化療的患者更多；相較于21基因檢測之前，低危浸潤性癌有較明顯的治療決策改變。本研究中，21基因檢測及RS評估前初步確定66例適用于采用H方案，均為低復發(fā)風險者分別，占37.9%，而108例患者適用于CH方案，其中低風險、中高復發(fā)風險者分別占37.9%和24.2%；經(jīng)21基因檢測進行復發(fā)風險評估后決策發(fā)生變化，共計132例建議進行H方案治療，其中66例(37.9%)從建議進行CH方案治療改為H方案治療，低風險者48例(27.6%)，中高風險者18例(10.3%)；建議進行CH方案治療者42例(24.2%)，其中低復發(fā)風險者6例，中高復發(fā)風險者36例，無增加輔助化療者。經(jīng)統(tǒng)計學分析，21基因檢測及RS評估前后治療方法比較有統(tǒng)計學差異，表明21基因檢測對指導Luminal A型乳腺癌患者的治療有積極意義。

通過21基因檢測獲得的RS針對早期Luminal A型乳腺癌患者比傳統(tǒng)臨床病理指標更能準確預測臨床結(jié)果并用于臨床實踐。RS可作為預測早期Luminal A型乳腺癌患者遠期是否有復發(fā)風險的量化指標。高RS早期Luminal A型乳腺癌患者從CH方案治療中會有較大獲益；對于低RS早期Luminal A型乳腺癌患者來說，無需輔助化療，進行H方案治療即可；對中RS早期Luminal A型乳腺癌患者來說，CH方案治療能否降低疾病復發(fā)風險目前沒有明確結(jié)論，還需要后續(xù)進一步研究。本研究證明，使用21基因檢測及RS分級來判斷患者復發(fā)風險的高低對早期Luminal A型乳腺癌患者治療方案選擇具有重要臨床指導意義[15]。Wang等[16]也發(fā)現(xiàn)，在所有乳腺癌患者中，高RS被認為是推薦化療最重要的影響因素。對具有高RS的Luminal A樣亞型患者或具有低RS的Luminal B型患者，已證明21基因的RS為推薦化療最重要的獨立因素。因此，21基因RS是影響化學療法決策的重要因素，值得進一步臨床評估。

洪進等[17]發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、年齡、月經(jīng)狀態(tài)為影響Luminal A型早期乳腺癌化療決策的重要因素，70歲以上患者或淋巴結(jié)陰性的絕經(jīng)后患者傾向于不接受化療。Wu等[18]認為，組織分級、PR狀態(tài)、Ki67均為RS的獨立影響因素。瞿飛麟等[19]發(fā)現(xiàn)，在激素受體陽性早期乳腺癌患者中，孕激素受體(PGR)、Ki67及組織學分級為影響RS的獨立影響因素。由于缺乏統(tǒng)一的標本制作程序以及Ki67表達陽性率檢測方法及其臨床界值界定，目前區(qū)分Ki67高低表達的臨界值從3.5%～34%均有報道。本研究考慮到不同實驗室Ki67表達陽性率檢測方法不同可能造成結(jié)果很大程度上的差異，及對化療可能受益的Luminal A型乳腺癌治療不足的可能，因此選擇較低界值(14%)進行界定，發(fā)現(xiàn)其對21基因RS有一定影響。本研究也發(fā)現(xiàn)21基因檢測及復發(fā)風險分組與早期Luminal A型乳腺癌患者年齡、組織病理學分級(1～2級)、女性月經(jīng)狀態(tài)、腫瘤直徑等無相關(guān)性，而與Ki67及有無脈管癌栓呈正相關(guān)。對于早期Luminal A型乳腺癌患者來說，這些既往被歸為增加復發(fā)危險分級的因素可通過21基因檢測給予RS所替代，RS分析的作用顯著優(yōu)于年齡和腫瘤大小作為獨立預后因素的作用[20-21]。

綜上所述，21基因檢測對早期Luminal A型乳腺癌患者的治療決策具有一定指導意義，RS僅與Ki67表達、脈管癌栓有相關(guān)性，因此可通過21基因檢測給予RS替代年齡、腫瘤直徑等作為獨立預后因素。但本研究也有一定不足之處：對于早期Luminal A型乳腺癌患者無病生存和總生存數(shù)據(jù)仍在進一步收集中，目前還無法得出結(jié)論；此外，由于研究周期及經(jīng)濟成本等原因，本研究患者入組例數(shù)較少，暫無法從經(jīng)濟學角度對21基因檢測進行成本效益分析。上述不足將在后續(xù)工作中加以完善，以提高21基因檢測及RS在早期Luminal A型乳腺癌患者臨床實踐中的地位。