白藜蘆醇對結腸癌惡性生物學行為的抑制作用研究

顧 勇，楊 艷，符 翠，崔 婷，王 艷

(1.武警陜西省總隊醫院消化內科，陜西 西安 710054；2.空軍軍醫大學西京消化病醫院，陜西 西安 710032；3.西安交通大學第二附屬醫院消化內科，陜西 西安 710004)

伴隨著人們生活方式調整，飲食成分和結構變化，以及環境污染、生態破壞等因素，大腸癌在我國的發病率與病死率逐年上升的趨勢仍舊明顯，盡管近年在防治上有一定成效，但是年齡標化5年相對生存率仍以每年2.9%的速率上升，總生存率依舊維持在50%～60%。結直腸癌發病率和病死率在全部惡性腫瘤中分別位居第3位和第5位，嚴重危害我國人民的生命健康[1-3]。體內外研究[4-6]證實白藜蘆醇(Resveratrol，Res)作為天然植物藥物，可通過不同信號途徑抑制癌細胞及腫瘤干細胞增殖，促進細胞凋亡，還可通過抗炎、抗氧化和抗血管生成等起到防癌和抑癌作用。隨著研究的不斷深入，發現Res對消化系統(肝臟、胃、食管等)腫瘤、血液系統腫瘤以及卵巢癌、宮頸癌、子宮內膜癌、前列腺癌、黑色素瘤等其他多種惡性腫瘤細胞均具有顯著的抑制作用[7-9]，而其對結腸癌的作用目前研究相對較少。本研究采用體內試驗和體外實驗相結合的方式，進一步深入探討Res對結腸癌生物學行為的影響，為有效防治結腸癌提供新的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 HT-29、SW480和 LoVo細胞購于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；Res(批號：BJ-ATCC0154)購于美國Santa Cruz公司；DMEM高糖培養基、胎牛血清購于美國Gibco公司；Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒購于碧云天生物有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養：于37 ℃、5% CO2培養箱中，在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養基中培養HT-29、SW480和LoVo細胞。收集對數生長期細胞(105/ml)，采用不同劑量Res進行處理并分組。對照組不加Res；低劑量組加入Res 25 μmol/L；中劑量組加入Res 50 μmol/L；高劑量組加入Res 100 μmol/L。處理時間為24 h。

1.2.2 CCK-8細胞增殖實驗：取對數生長期HT-29、SW480和LoVo細胞接種于96孔板中，分別在0、24、48、72、96 h時向每孔加入10 μl CCK-8溶液，用酶標儀測定在450 nm波長處的吸光度值。

1.2.3 流式細胞儀檢測：收集各組處理后的對數生長期的HT-29、SW480和 LoVo細胞，用預冷PBS洗滌2次，重懸后用70%預冷乙醇固定，PBS洗滌2次，加入碘化丙錠(PI)染液(PI 50 mg/L,Triton X-100 1.0%，核糖核酸酶A 10 mg/L)染色30 min后4 ℃避光過濾，用流式細胞儀測定DNA含量，計算結腸癌細胞周期分布與細胞凋亡率。

1.2.4 動物模型構建：80只SPF級健康SD大鼠(8周齡，200 g，雌雄各半)在屏障系統內適應飼養1周后隨機分成四組，即對照組、模型組、Res低劑量組(20 mg/kg)和Res高劑量組(40 mg/kg)。連續12周給予模型組和實驗組(Res低劑量組和Res高劑量組)大鼠皮下注射1,2-二甲基肼(DMH)30 mg/kg(隔天1次)和1%葡聚糖硫酸鈉鹽(DSS)水自由飲用。對照組給予等體積0.9%氯化鈉溶液。模型構建后，分別給予每只模型大鼠20、40 mg/kg Res連續灌胃30 d，計算結腸癌誘癌率(荷瘤動物只數/受檢動物只數×100%)和結腸癌抑制率[(模型組腫瘤誘癌率-實驗組腫瘤誘癌率)/模型組腫瘤誘癌率]。

1.2.5 病理學組織檢測：實驗結束后收集病變腸道組織，用10%福爾馬林緩沖液固定后包埋。將組織切成4 μm厚的連續切片，HE染色后在光學顯微鏡下評估腫瘤病理組織學改變。

1.2.6 結腸組織凋亡細胞檢測(TUNEL法)：組織切片脫蠟、水化后，利用蛋白酶K充分作用通透細胞膜和核膜。滴加3%過氧化氫溶液室溫孵育以滅活切片內源過氧化物酶，隨后用PBS洗滌3次。在樣品上加50 μl TUNEL反應混合液，37 ℃孵育60 min，用PBS洗滌3次。樣品上滴加50 μl DAB顯色液，室溫孵育15 min。用PBS洗滌3次后依次進行蘇木素復染、梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。正常細胞核顯示為藍色，呈棕褐色則為凋亡細胞核陽性表達。采用 Image-Pro Plus 6.0 圖像測量軟件進行分析。

1.3 統計學方法 采用SPSS 22.0統計學軟件進行分析。對數據行正態性和方差齊性檢驗，計量資料用均數±標準差表示，采用單因素方差分析或SNK-q檢驗；多實驗組與一個對照組比較采用Dunnett-t檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 不同劑量Res對結腸癌細胞增殖能力的影響 見圖1。CCK-8實驗結果顯示，低劑量Res可以抑制HT-29、LoVo細胞活力，且隨著Res劑量的增加，細胞活力顯著降低，呈濃度依賴性；雖然低劑量Res處理后SW480細胞活力變化不明顯，但隨著Res劑量的增加，SW480細胞活力仍受到了明顯抑制，考慮與細胞特異性相關。

2.2 不同劑量Res對結腸癌細胞凋亡率及細胞周期的影響 見表1～3。與對照組比較，不同劑量組HT-29、SW48和LoVo細胞凋亡率明顯上升，且三種細胞S期和G2/M期細胞比例顯著提高，G0/G1期細胞減少，均呈劑量依賴性(均P<0.05)。

表1 不同劑量Res對結腸癌HT-29細胞凋亡率及細胞周期的影響(%)

2.3 四組大鼠結腸癌誘癌率及抑制率比較 見表4。與模型組相比，低劑量組和高劑量組大鼠結腸內腫瘤數目和誘癌率明顯降低(均P<0.05)。高劑量組大鼠結腸癌抑制率高于低劑量組(P<0.05)。

表2 不同劑量Res對結腸癌SW480細胞凋亡率及細胞周期的影響(%)

表3 不同劑量Res對結腸癌LoVo細胞凋亡率及細胞周期的影響(%)

表4 四組大鼠結腸癌誘癌率及抑制率比較

2.4 四組大鼠結腸組織HE染色結果 見圖2。對照組黏膜紅潤正常，皺褶規則，腺管結構正常，無明顯炎癥細胞浸潤。模型組黏膜異常增厚，皺褶變粗且形狀不規則；可見大小不等的腫瘤結節，浸潤深達漿膜，貫穿整個結腸；腺管排列擁擠紊亂，間質少，正常腺管結構消失；癌細胞大小不一，呈條索狀、簇狀排列；腫瘤細胞和炎性細胞大量浸潤，細胞間隙消失。Res低劑量組和Res高劑量組病理改變較模型組減輕，腫瘤僅局限于黏膜層和肌層。

對照組 模型組 Res低劑量組 Res高劑量組

A、B：對照組；C、D：模型組；E、F：Res低劑量組；G、H：Res高劑量組。放大倍數：A、C、E、G，×40；B、D、F、H，×100

2.5 四組大鼠結腸組織凋亡細胞檢測結果 見圖3。與模型組相比，隨著Res劑量的增高，Res低劑量組和Res高劑量組凋亡細胞數明顯增多(P<0.05)。

3 討 論

有研究認為結腸癌發病率可作為國民經濟和社會發展的一個重要標志，在一些有過發展大轉型經歷的國家，其發病率隨著人類發展指數升高而上升[10-11]。目前，盡管在機制研究和臨床診療方面取得了一定進展，但是各種治療方案在耐受性、療效和交叉抗性方面都有缺陷，進展期結腸癌遠期療效仍然較差[12]。在我國，中醫藥資源相對豐富，在傳統中草藥中探求高效低毒的抑癌成分及相關機制將促進腫瘤綜合治療的發展。

Res為多酚類化合物，又稱芪三酚，是腫瘤的化學預防劑，也可以作為減少血小板聚集、預防和治療心腦血管疾病的化學預防劑[13]。目前它已被證實具有抗血栓、抗突變、抗自由基、抗心血管疾病、抗氧化、抗炎及抗腫瘤等生物活性劑藥理作用。Res還可以保護神經系統、保護肝臟、調節免疫系統及促進組織器官損傷愈合等[14]。其中，它的抗腫瘤作用成為多學科研究的熱點。多項研究[15-16]顯示，Res對正常組織和細胞僅有較低毒性或者無毒，有可能成為更精準的新型綠色抗腫瘤藥物，故其在腫瘤輔助治療中具有較大的潛在臨床價值。本研究首先在體外利用CCK8細胞增殖實驗檢測Res對結腸癌HT-29、SW480和LoVo細胞增殖能力的影響，發現Res可顯著抑制結腸癌細胞的增殖，且呈劑量依賴性。既往研究[17-18]在腦膠質瘤、乳腺癌中也發現了類似結果，證實Res對多種腫瘤細胞增殖均具有抑制作用。

細胞周期阻滯在抑制腫瘤細胞惡性增殖中起到重要作用[19]。研究[20]表明，Res可通過阻滯細胞周期抑制口腔癌的增殖。Res還可以通過上調促凋亡基因抑制抗凋亡基因的表達，將前列腺癌細胞阻滯在G2/M期，從而抑制前列腺癌增殖，促進腫瘤細胞凋亡[21-22]。本研究利用流式細胞術檢測了不同劑量Res處理后結腸癌細胞的細胞周期，發現隨著Res劑量的增高，HT-29、SW480和LoVo細胞S期和G2/M期細胞比例提高，G0/G1期細胞減少，且呈劑量依賴性。但Res影響結腸癌細胞周期的具體機制仍需進一步研究。

為了進一步證實Res能否在體內抑制結腸癌增殖，本研究利用DSS水構建大鼠結腸癌模型并給予不同劑量Res，結果發現Res顯著抑制了結腸癌模型大鼠的腫瘤大小。TUNEL法檢測發現，Res可顯著促進體內結腸癌細胞凋亡，從而抑制結腸癌發展。此結果與上述體外實驗結果一致，進一步證實了Res對結腸癌的抑制作用。

綜上所述，Res可抑制體外結腸癌HT-29、SW480和LoVo細胞增殖，促進體內結腸癌細胞凋亡，且呈劑量依賴性，為結腸癌的新型藥物治療提供了新的思路。但由于Res生物利用率低，目前市場上出現的產品主要為保健用品，而非藥品，因此需要開展更大規模的研究,以促進Res藥用價值的開發，使其成為新型、高效、低毒的抗結腸癌藥物。