肺腺癌移植瘤裸鼠模型侵襲組織中酪氨酸蛋白激酶受體A7、表皮生長因子受體和Ki67蛋白表達及意義

王 徽，白玉勤

(1.錦州醫(yī)科大學，遼寧 錦州 121001；2.赤峰學院附屬醫(yī)院神經(jīng)內科，內蒙古 赤峰 024000；3.赤峰學院第二附屬醫(yī)院 赤峰市腫瘤醫(yī)院病理科，內蒙古 赤峰 024000)

肺癌的發(fā)生率和病死率居我國惡性腫瘤之首，研究肺癌發(fā)生與發(fā)展的分子機制對于臨床診療具有重要意義[1]。肺癌蛋白組學是目前的研究熱點，分析肺癌相關蛋白質表達差異可為肺癌的藥物治療研發(fā)提供依據(jù)。研究[2-3]發(fā)現(xiàn)酪氨酸蛋白激酶受體A7(Ephrin receptor A7，EphA7)在惡性腫瘤中呈高表達，可能與腫瘤的轉移和預后相關，但其與肺腺癌侵襲轉移機制的研究尚未見報道。表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor，EGFR)是一種信號傳導通路的分子受體，但其與肺腺癌侵襲轉移的關系尚存在爭議[4-5]。Ki67蛋白是細胞有絲分裂與增殖的重要蛋白，反映腫瘤細胞增殖的活躍度[6]，但其對肺腺癌侵襲轉移是否存在影響值得研究。因此，本研究通過制備A549肺腺癌移植瘤裸鼠模型探討肺腺癌移植瘤侵襲組織中EphA7、EGFR、Ki67蛋白表達水平及意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與細胞 Balb/C裸鼠20只，雄性，鼠齡7～8周，體重24～28 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK(滬)2012-0005。裸鼠飼養(yǎng)符合我國動物飼養(yǎng)標準，飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～26 ℃，相對濕度40%～70%，實驗前均經(jīng)過適應性喂養(yǎng)。肺腺癌A549細胞株由日本東北大學生物醫(yī)學研究所提供。

1.2 實驗試劑 羊抗鼠血清蛋白(批號：ZA16388)購自北京中杉金橋公司；兔抗人EGFR單克隆抗體(批號：ZA0568)購自北京中杉金橋公司；兔抗人EphA7多克隆抗體(批號：715-475-150)購自美國Santa Cruz公司；兔抗人Ki67單克隆抗體(批號：180321)購自北京泰澤瑞達科技有限公司；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒(批號：190805)購自北京杰輝博高生物技術有限公司；20%小牛血清(批號：180803)和RPMI-1640培養(yǎng)液(批號：191024)購自上海江萊生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 肺腺癌移植瘤裸鼠模型制備：肺腺癌A549細胞株培養(yǎng)于含有20%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，采用細胞培養(yǎng)移植法，先進行細胞培養(yǎng)并傳代，每個培養(yǎng)皿中僅加入1 ml完全培養(yǎng)的肺腺癌A549細胞株，置于37 ℃、含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2 d觀察細胞貼壁生長情況，當發(fā)現(xiàn)大量細胞貼壁后更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的肺腺癌A549細胞制備5×107個/ml細胞懸液，皮下注射到裸鼠背部靠近頭部區(qū)域。接種后第2周若發(fā)現(xiàn)接種部位出現(xiàn)皮下結節(jié)，游標卡尺測量瘤體直徑在30 mm以上，體積在1000 mm3以上，表示模型制備成功。

1.3.2 肺腺癌移植瘤組織標本處理：使用乙醚麻醉肺腺癌移植瘤模型裸鼠，剪開背部皮膚，暴露移植瘤。利用活體冷凍技術，使用-196 ℃液氮下異戊烷-丙烷冷凍液將肺腺癌移植瘤組織冷凍，并用電鉆取下肺腺癌移植瘤侵襲組織和旁邊2 cm外的非侵襲組織。將取下的瘤組織置于4%多聚甲醛中固定72 h，然后石蠟包埋，分別制作侵襲組織切片和非侵襲組織切片。

1.3.3 免疫組化法檢測EphA7、EGFR、Ki67蛋白表達：石蠟切片浸泡于抗原修復工作液中加熱煮沸20 min，磷酸鹽緩沖液沖洗5 min×3次。滴加10%羊抗鼠血清蛋白孵育30 min。按照SP法免疫組化染色，先加入兔抗人EphA7單克隆抗體(一抗)100 μl，室溫孵育60 min，再4 ℃孵育過夜。磷酸鹽緩沖液沖洗5 min×3次。磷酸鹽緩沖液作為一抗的陰性對照。加入辣根過氧化物酶標記的EphA7二抗，室溫孵育30 min，磷酸鹽緩沖液沖洗5 min×3次。滴加DAB顯色液50 μl處理5～10 min，自來水終止顯色，在顯微鏡下觀察切片。由病理中心2名醫(yī)師獨立閱片，采用Bresalier半定量法分析，每張切片隨機選擇5個高倍鏡視野，分染色深淺度評分和陽性細胞率評分兩部分。①染色深淺度評分：0分為不顯色；1分為淺黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色。②陽性細胞率評分：0分為陽性細胞率<5%；1分為陽性細胞率5%～25%；2分為陽性細胞率26%～50%；3分為陽性細胞率51%～75%；4分為陽性細胞率≥76%。上述累計得分0～1分為陰性，2～3分為弱陽性，4～5分為中度陽性，6～7分為強陽性。EGFR蛋白采用的免疫組化染色步驟和方法同上，使用兔抗人EGFR單克隆抗體試劑盒。Ki67蛋白采用的免疫組化染色步驟和方法同上，使用兔抗人Ki67單克隆抗體試劑盒。

2 結 果

2.1 侵襲組織與非侵襲組織EphA7蛋白表達情況比較 見表1(圖1)。肺腺癌移植瘤侵襲組織與非侵襲組織EphA7蛋白表達均為陽性，陽性細胞表達率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 侵襲組織與非侵襲組織EphA7蛋白表達情況比較

A：陰性對照，無EphA7蛋白表達(×100)；B：侵襲組織EphA7蛋白表達陽性(×400)；C：非侵襲組織EphA7蛋白表達陽性(×400)

2.2 侵襲組織與非侵襲組織EGFR蛋白表達情況比較 見圖2A。肺腺癌移植瘤侵襲組織與非侵襲組織EGFR蛋白表達均為陰性。

2.3 侵襲組織與非侵襲組織Ki67蛋白表達情況比較 見表2(圖2B、C)。肺腺癌移植瘤侵襲組織Ki67蛋白表達均為陽性，非侵襲組織Ki67蛋白表達為陰性或弱陽性，侵襲組織陽性細胞表達率高于非侵襲組織(P<0.05)。

表2 侵襲組織與非侵襲組織Ki67蛋白表達情況比較

A：侵襲組織EGFR蛋白表達陰性(×200)；B：侵襲組織Ki67蛋白表達陽性(×400)；C：非侵襲組織Ki67蛋白表達陰性(×400)

3 討 論

腫瘤侵襲是肺癌患者發(fā)生轉移、進展的重要病理基礎。本研究通過皮下接種肺腺癌A549細胞的方式建立肺腺癌移植瘤裸鼠模型，再通過免疫組化染色觀察肺腺癌移植瘤侵襲組織與非侵襲組織中EphA7、EGFR、Ki67蛋白表達情況并進行半定量分析，可為病理機制研究提供參考。常規(guī)的免疫組化染色容易受組織細胞壞死變性、抗原封閉等影響而產生假陽性或假陰性結果，導致結果判定誤差較大。基于此，本研究利用活體冷凍技術，使用-196 ℃液氮下異戊烷-丙烷冷凍液將肺腺癌移植瘤組織冷凍，在活體狀態(tài)下瞬間冷凍靶器官組織，最大限度地保留組織原有形態(tài)和代謝，減少組織細胞壞死變性、紅細胞破裂釋放的過氧化酶與底物作用而產生非抗原特異性的陽性著色，提高本研究免疫組化染色的準確性[7]。

EphA7是Eph受體家族中的一員[8]。近年來研究[9-11]發(fā)現(xiàn)EphA7蛋白在骨肉瘤、前列腺癌、口腔鱗癌中呈陽性表達，與腫瘤發(fā)生、轉移密切相關，其高表達預示著總生存期縮短。本研究顯示，肺腺癌移植瘤侵襲組織與非侵襲組織EphA7蛋白表達均為陽性，但陽性細胞表達率比較差異無統(tǒng)計學意義，說明EphA7蛋白表達與肺腺癌侵襲進展無明顯關系，無論是在侵襲組織還是在非侵襲組織中均表達上調。金紅等[12]研究發(fā)現(xiàn)，EphA7可能通過PTEN-AKT通路調控癌細胞的遷移和侵襲。國外研究[13-14]發(fā)現(xiàn)，EphA7蛋白與腫瘤血管形成有密切關系，可誘導內皮細胞增殖，促進腫瘤血管形成，從而增加腫瘤血管微密度，保障腫瘤血供，為腫瘤侵襲創(chuàng)造條件。

EGFR是一種跨膜糖蛋白，其信號通路與細胞生長、增殖密切相關[15]。EGFR在許多惡性腫瘤中高表達，其機制可能是EGFR增強下游信號傳導，如RAS/RAF/MAPK通路、PI3K/AKT通路和JAK/STAT通路[16]。突變型EGFR受體表達增加也會導致EGFR持續(xù)活化，促進細胞增殖與抗凋亡，EGFR突變一般預示著腫瘤預后差[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，肺腺癌移植瘤侵襲組織與非侵襲組織中EGFR蛋白表達均為陰性，提示EGFR蛋白表達與肺腺癌侵襲進展無明顯關系，與既往研究[19]結果相似。

Ki67是惡性腫瘤預后不良的臨床常見標志物[20]。Ki67蛋白參與細胞有絲分裂與增殖，一般認為Ki67蛋白表達越高，惡性腫瘤細胞增殖活性越強，惡性程度越高。本研究顯示，肺腺癌移植瘤侵襲組織Ki67蛋白表達均為陽性，非侵襲組織Ki67蛋白表達為陰性或弱陽性，侵襲組織陽性細胞表達率高于非侵襲組織，說明Ki67蛋白表達可能會影響肺腺癌侵襲，Ki67陽性表達率越高，肺癌細胞增殖活性越強。

綜上所述，EphA7、EGFR蛋白表達與肺腺癌侵襲進展無明顯關系，Ki67蛋白表達可能影響肺腺癌侵襲。