外周血血小板裂解產物對人臍帶間充質干細胞增殖、分化影響的實驗研究

李雙雙，曾瑞霞

(1.錦州醫科大學基礎醫學院解剖學教研室，遼寧 錦州 121001；2.錦州市中心醫院血液科，遼寧 錦州 121001)

目前，間充質干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)主要應用于再生醫學和細胞治療，因此需要在體外培養并大量擴增以供應臨床移植使用[1-5]。迄今為止，在擴增MSCs時多使用胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)作為輔助添加劑[6]。FBS在培養MSCs時展現出來一些良好的性質，如含有很多細胞生長和增殖所需的因子，能夠在MSCs擴增很多代后仍保持原始屬性，具有支持MSCs多向分化潛能等。然而，人們對于FBS的安全性產生了許多擔憂，因為FBS可以攜帶朊病毒(引起瘋牛病)、異種抗原或其他引起人畜共患傳播病原體并感染培養細胞，繼而這些細胞將給接受移植治療的患者造成嚴重的并發癥[7]。為了解決以上這些問題，我們準備改進或設計新的培養/擴增細胞的方法，并將重點放在無任何動物衍生產品添加劑的培養基上。有研究[8]嘗試用人血清替換FBS，但發現其對MSCs的擴增、增殖和分化作用不佳。而人血小板裂解產物(Platelet lysis product，PL)在培養MSCs時具有非常好的前景，因為PL中包含大量轉化生長因子-β1(TGF-β1)、成纖維細胞生長因子(FGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)和胰島素樣生長因子(IGF)，可以有效地支持MSCs體外培養。因此，本研究將人外周血血小板裂解物(Peripheral blood platelet lysate，PB-PL)與FBS進行對照研究，以評估其作為培養人臍帶MSCs添加劑使用的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 外周血和臍帶收集：從血站收集剛過期的外周血，每份大約500 ml，共10份。在患者知情同意后，從正常分娩(妊娠36～40周)胎盤上收集新鮮人類臍帶(5～10 cm)5個，由產科手術室助產士完成。臍帶存儲在4 ℃磷酸緩沖鹽(添加10 U/ml青霉素和 10 μg/ml鏈霉素)中，在 12 h內完成細胞分離處理。

1.1.2 主要試劑：低糖DMEM/F12、FBS、地塞米松、抗壞血酸、抗壞血酸2-磷酸酯、MEM培養基、DMEM-G培養基、PBS(Gibco公司)；茜素紅、阿新蘭、臺盼藍、油紅O、胰蛋白酶-EDTA (武漢博士德公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 PB-PL制備：將5份外周血混合到一起迅速進行裂解離心，提取裂解產物。用血液分析儀分析每份血液的血小板總數。900 g離心15 min后，收集含有血漿和血小板的上清液，再次對上清以4000 g離心15 min并收集上清。在-80 ℃儲存至少12 h后，在4 ℃下解凍溶解12 h，并以4000 g離心30 min。使用0.65 μm過濾器過濾上清，制備PB-PL，儲存在-80 ℃冰箱中備用。

1.2.2 臍帶MSCs分離、培養及形態觀察：將臍帶內的華通膠組織剪成小塊(1～3 mm3)，放入6孔培養板中，在培養箱(37 ℃、5% CO2)中培養。當附著細胞數量足夠時，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，PBS清洗后重新放入75 cm2培養瓶中，加入10 U/ml青霉素和10 μg/ml鏈霉素的低糖DMEM/F12培養基繼續培養。向培養基中分別添加15% FBS(FBS組)和10% PB-PL(PB-PL組)進行培養，在達到80%融合時，細胞再次傳代，采用第3代細胞進行研究。

1.2.3 MSCs細胞生長動力學觀察：將對數生長期的細胞用胰蛋白酶消化，0.5 ml懸液加入試管中。加入0.4%臺盼蘭染液染色2～3 min。吸取少許懸液涂于載玻片上，鏡下取幾個任意視野分別統計死亡細胞和活細胞數，計算細胞活性。細胞活性(%)=未染色細胞數/細胞總數×100%。采用第3代細胞，以1000個/cm2密度種植于培養皿中，計算細胞倍增時間(CDT)。CDT=[lg(N/N0)/lg2]×T，其中N為終止培養時的細胞數量，N0為種植開始時的細胞數量，T為培養時間。

1.2.4 人臍帶MSCs分化能力檢測：細胞植入6孔板中。成骨分化采用基礎培養基(MEM)培養臍帶MSCs，添加成骨性添加物(0.01 mmol/L地塞米松和50 μg/ml抗壞血酸)，25 d后用茜素紅染色法對成骨分化進行評估。成軟骨分化采用DMEM-G(高糖)培養基，添加0.01 mmol/L地塞米松、35 μg/ml抗壞血酸2-磷酸酯、10 ng/ml TGF-β1，培養28 d后10%福爾馬林固定，阿新蘭染色檢測。成脂肪分化采用含成脂肪添加成分的基礎培養基(MEM)對MSCs進行脂肪分化，25 d后通過油紅O染色檢測成脂情況。

1.2.5 集落形成能力檢測：第2、3、4和5代MSCs分別用含FBS或PB-PL的培養基培養，行成纖維細胞克隆形成單位(CFU-F)檢測。各組MSCs經胰酶消化、計數，以500個細胞/孔的密度接種在6孔培養板上，以添加FBS或PB-PL的MSCs生長培養基在37 ℃、飽和濕度的培養箱中培養。每周更換2次培養基，經過15 d培養后，細胞用10%福爾馬林固定，采用吉姆薩染色，計算染色的CFU-F數量。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19.0統計學軟件進行數據分析，計量資料采用均值±標準差形式表示，組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組MSCs生長情況比較 見圖1。FBS組第4天可見黏附性貼壁細胞出現，而PB-PL組第6天時可見貼壁細胞出現。12 d后進行傳代，貼壁細胞生長過程中形態較一致，為梭形。PB-PL組細胞體積較小。兩組MSCs形態均能維持8代以上。

2.2 兩組MSCs生長動力學指標比較 見表1。在第2代時，FBS組MSCs細胞活性低于PB-PL組(P<0.05)。在第5 代時，FBS組MSCs的CDT高于PB-PL組(P<0.01)。

表1 兩組MSCs生長動力學指標比較

2.3 兩組MSCs分化能力比較 見圖2。將第3代MSCs置于成骨分化培養基中培養3周，兩組MSCs都出現了鈣化組織沉積，茜素紅染色陽性。與FBS組相比，PB-PL組細胞染色更強，鈣沉積更穩定。在成脂肪培養條件下培養21 d后，兩組MSCs均表現出油紅O染色陽性，可見少量脂質包裹體，提示脂肪細胞分化欠成熟。誘導MSCs向軟骨系分化時發現，PB-PL組MSCs糖胺聚糖含量高于FBS組。

A-C：PB-PL組第1、5、10代臍帶MSCs形態；D-F：FBS組第1、5、10代臍帶MSCs形態

2.4 兩組MSCs成纖維細胞集落形成能力比較 見表2。經15 d培養，采用吉姆薩法固定并染色后發現，MSCs在培養初期能夠快速形成集落樣成纖維細胞群，第4代時FBS組MSCs集落生成數量達到最大，而PB-PL組MSCs集落生成數量最多的時期出現在第5代。經統計分析后發現，第2～5代兩組MSCs集落生成能力比較無統計學差異(均P>0.05)。

表2 兩組MSCs成纖維細胞集落形成能力比較(個)

3 討 論

本研究在擴增臍帶MSCs的培養基中添加15% FBS或10% PB-PL，以對比不同添加劑對人臍帶MSCs增殖及分化的影響。血小板裂解產物從剛剛過期的人外周血中提取，平均血小板濃度為(2.23±0.16)×106/ml。為避免不同批次外周血性質的變化，我們將收集的外周血混合到一起，然后迅速進行裂解離心并提取裂解產物的辦法，這樣可以有效地避免血小板裂解物個體屬性差異性大的問題。

本研究顯示，在標準條件下培養6 d后，15% FBS和10% PB-PL都成功地從人臍帶組織中分離培養出MSCs。臍帶MSCs在15% FBS或10% PB-PL培養基中擴增后，其形態一直能維持傳代到第8代以上。經10% PB-PL擴增的臍帶MSCs的體積較Chevallier等[8]報道的添加15% FBS培養的臍帶MSCs要小。經兩種不同添加劑培養基培養后的臍帶MSCs均向成骨和成軟骨系方向分化。與Chevallier等的研究進行比較時發現，MSCs成脂肪分化結果不是十分理想，最終分化的是一種不成熟的脂肪表型，油紅O染色后幾乎沒有發現有脂質包裹體[9]，這可能是由于臍帶MSCs的胚胎起源以及我們采用的分化方案有所不同所致[10-14]。阿新蘭染色顯示，在10% PB-PL培養的臍帶MSCs中，糖胺聚糖含量高于15% FBS培養的臍帶MSCs，與既往研究[15-17]一致。在誘導臍帶MSCs向成骨分化時，與Chevallier等的研究相比，我們發現10% PB-PL培養的臍帶MSCs中鈣沉積增加，且沉積更穩定。在這兩項研究中，從開始分離到擴增MSCs都是使用PB-PL培養基。而成骨誘導后的礦化水平不同可能是所使用的MSCs來源不同所致，一個是骨髓來源，一個是臍帶來源[18]。

與FBS培養基相比，在培養基中使用相對少量的PB-PL，細胞生長加快，細胞數量增加。通過計算第1～5代臍帶MSCs的CDT證實了這一點。特別是在第5代，PB-PL培養的臍帶MSCs平均CDT短于FBS培養的臍帶MSCs平均CDT。因此，PB-PL培養臍帶MSCs時可能吸收了更多的生長因子，使其擴增速度大大增加[19]。在第5代時，兩組細胞的生存能力沒有任何差異，FBS擴增的臍帶MSCs的平均值為(85±4%)，而PB-PL擴增的臍帶MSCs為(86±3)%。針對臍帶MSCs的集落形成能力，我們進行了CFU-F檢測。與FBS擴增的臍帶MSCs相比，PB-PL培養的MSCs的CFU-F數量雖然更高，但分析發現并沒有統計學差異。臍帶MSCs的集落形成和維持能力進一步表明了其自我更新和復制能力[20]。

綜上所述，通過在培養基中添加PB-PL，能夠成功分離和擴增臍帶MSCs。此外，當比較PB-PL和FBS培養的臍帶MSCs特性時，PB-PL培養的MSCs顯示出了更高的生長速率、三系分化和干細胞原始屬性，這為臨床上使用PB-PL替代傳統FBS作為添加劑培養MSCs提供了依據。