兒童EB病毒感染非腫瘤性疾病與病毒潛伏期膜蛋白基因多態性的相關性研究

史利歡，陳 靜，謝 昕，劉 煒

(河南省兒童醫院·鄭州兒童醫院，河南省小兒血液醫學重點實驗室，河南 鄭州 450000)

EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)是一種多發于兒童的皰疹病毒科γ亞科DNA病毒，主要通過感染人B淋巴細胞，引起免疫功能紊亂而發病，還可以長期潛伏在體內，通過影響多種潛伏基因表達，引起全身各系統和器官疾病[1]。研究顯示，兒童EBV感染可以誘發嚴重的免疫功能紊亂，引起一系列的免疫病理損傷，包括傳染性單核細胞增多癥(infectious mononucleosis，IM)[2]、EBV相關噬血細胞性淋巴組織細胞增生癥(EBV-associatedhemophagocyticlymphohistiocytosis，EBV-HLH)[3]、慢性活動性EBV感染(Chronic active EBV，CAEBV)[4]等，少部分甚至可發展為惡性腫瘤。IM是EBV感染引起的一種良性免疫病理性疾病，大部分患者均預后良好，而EBV-HLH和CAEBV病情相對較為嚴重，預后相對較差，甚至可以危及患者生命[5，6]。目前有關IM、EBV-HLH及CAEBV等EBV感染相關非腫瘤性疾病的發病機制尚未闡明，分析疾病發生和進展的機制，指導臨床治療具有重要意義。EBV 潛伏膜蛋白(latent membrane protein 1，LMP1)是EBV潛伏感染主要的基因表達產物，不僅可以參與EBV感染相關腫瘤的發生，還可以影響機體的免疫功能，參與IM、EBV-HLH等多種EBV感染相關非腫瘤性疾病的發生[7]。既往研究分析了LMP1基因變異與兒童EB病毒感染相關腫瘤性疾病的關系[8]，但LMP1基因多態性與兒童EBV感染相關非腫瘤性疾病之間的關系尚不清楚。本研究檢測了兒童EBV感染相關非腫瘤性疾病的LMP1基因多態性，并分析了其基因多態性與疾病發生和進展之間的關系，旨在為EBV感染患兒的防治提供一定的理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2017年12月至2020年12月在鄭州兒童醫院確診的94例EBV感染相關非腫瘤性疾病患兒，納入標準：均符合2016年中華醫學會制定的《兒童主要非腫瘤性EB病毒感染相關疾病的診斷和治療原則建議》中EBV感染相關非腫瘤性疾病的診斷標準[9]，所有患兒均在癥狀發作48 h內入院檢查；EBV抗體檢測均為陽性，且均獲得了患兒家屬的知情同意。排除標準：EB病毒感染相關腫瘤性疾病；存在貧血、出血及其它血液系統疾病者；存在自身免疫性疾病和惡性腫瘤等者。94例EBV患兒中男63例，女31例，年齡1～12歲[(6.08±2.03)歲]，其中IM患兒40例，EBV-HLH患兒30例，CAEBV患兒24例。隨機選取同期攜帶EBV病毒的無癥狀兒童94例為對照組，所有患兒均在健康體檢時經血常規檢測發現中性細胞降低，淋巴細胞偏高，并經EBV抗體檢測為陽性，同時排除存在既往EBV感染癥狀患兒。男61例，女33例，年齡1～12歲[(5.83±1.93)歲]。兩組患兒的年齡、性別差異無統計學意義(P>0.05)。本研究經鄭州兒童醫院倫理委員會審核通過。

1.2 方法①臨床癥狀：記錄EBV感染相關非腫瘤性疾病患兒入院時的臨床癥狀。②免疫球蛋白水平檢測：入院第2 d，采集患兒空腹血液2 ml，離心(3000 rpm，10 min)，取血清，采用日立7600全自動生化分析儀檢測血清中免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)、IgA、IgM、IgE、補體3(complement，C3)和C4水平。③外周血淋巴細胞EBV病毒載量和LMP1表達水平：入院第2 d，采集所有EBV感染患兒的靜脈血2 ml，采用密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，提取PBMC細胞的DNA，采用EBV檢測試劑盒(上海谷研實業有限公司)進行RT-PCR反應，檢測EBV DNA載量，嚴格按照說明書進行操作。入組第2 d，采用RT-PCR檢測LMP1 mRNA水平，上游引物：5’-CTAGGAAGAAGGCCAAAA-3’，下游引物：5’-AACGCAGTCTTAGGTATC-3’。Western blot方法檢測PBMC中LMP1蛋白表達水平。④EBV患兒LMP1基因多態性檢測：入組第2 d，參考已有文獻[10]，采用巢式PCR擴增LMP1基因，引物序列見表1，采用末端終止法對PCR擴增產物進行雙向測序，以EBV標準株B95-8序列作為參比進行分析。

表1 LMP1基因擴增和測序引物

1.3 統計學方法應用SPSS 22.0軟件分析所得實驗數據。滿足正態分布且方差齊的計量資料以均數±標準差表示，采用單因素方差分析比較多組間差異性，SNK-q比較多組兩兩組間的差異；計數資料采用例(率)表示，采用χ2檢驗分析比較；采用Pearson相關性分析LMP1基因多態性與EBV DNA載量、LMP1表達和免疫球蛋白水平變化之間的相關性。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EBV感染相關非腫瘤疾病患兒的臨床表現EBV-HLH組患兒脾腫大和肝腫大的發生率明顯高于IM組，咽峽炎、淋巴結腫大和眼瞼水腫的發生率明顯低于IM組(P<0.05)；CAEBV組脾腫大和肝腫大的發生率明顯高于IM組，咽峽炎和眼瞼水腫的發生率明顯低于IM組，淋巴結腫大的發生率明顯高于EBV-HLH組(P<0.05)。見表2。

表2 EBV感染相關非腫瘤疾病患兒的臨床表現比較 [n(%)]

2.2 EBV感染相關非腫瘤疾病患兒的血清免疫球蛋白水平變化各組患兒免疫球蛋白水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 EBV感染相關非腫瘤疾病患兒的血清免疫球蛋白水平變化 (g/L)

2.3 EBV感染相關非腫瘤疾病患兒的血LMP1表達水平各組患兒EBV-DNA載量和LMP1表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 EBV感染相關非腫瘤疾病患兒的血LMP1表達水平

2.4 EBV感染相關非腫瘤疾病患兒的LMP1基因變異類型EBV-HLH組患兒LMP1基因XhoⅠ位點(-)和del-LMP1的發生率明顯高于IM組和對照組(P<0.05)；CAEBV組LMP1基因XhoⅠ位點(-)和del-LMP1的發生率與EBV-HLH組、IM組和對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表5。

表5 EBV感染相關非腫瘤疾病患兒的LMP1基因變異類型 [n(%)]

2.5 EBV感染相關非腫瘤疾病患兒的LMP1基因變異與EBV-DNA病毒載量之間的關系采用變量賦值，XhoⅠ位點(+)=0，XhoⅠ位點(-)=1；wt-LMP1=0，del-LMP1=1。EBV感染相關非腫瘤疾病患兒LMP1基因XhoⅠ位點(-)變異和del-LMP1位點變異與EBV-DNA、LMP1蛋白和LMP1 mRNA 呈顯著正相關關系(P<0.05)。見表6。

表6 EBV感染相關非腫瘤疾病患兒的LMP1基因變異與EBV-DNA病毒載量之間的關系

3 討論

EBV是兒科臨床常見的一種雙鏈DNA病毒感染性疾病，主要通過感染人B淋巴細胞，引起一系列的免疫病理損傷[11]。既往已有多項研究分析了EBV感染相關腫瘤性疾病的臨床特征和LMP1基因變異情況，但對EBV感染相關非腫瘤性疾病的關注較少[12，13]。本研究分析了幾種常見EBV感染相關非腫瘤性疾病IM、EBV-HLH和CAEBV的臨床表現，發現EBV-HLH和CAEBV患兒肝脾腫大的發生率高于IM患兒，咽峽炎、淋巴結腫大和眼瞼水腫的發生率低于IM患兒。研究顯示[14]，IM 患兒最常見的臨床表現是發熱、咽峽炎、淋巴結腫大等，CAEBV患兒臨床主要表現為慢性的或反復出現的IM樣癥狀，隨病情發展可導致HLH，引起多組織器官功能損傷，危及患兒生命[15]。結合本研究結果表明，隨著IM病情進展，疾病可發展為CAEBV，甚至EBV-HLH，臨床癥狀逐漸加重，提示臨床可根據EBV感染患兒的臨床表現和癥狀嚴重程度，評估疾病進展，指導臨床治療。本研究中，隨著IM向CAEBV 和EBV-HLH組進展，血清IgG、IgA、C3和C4水平明顯降低。已有多項研究顯示，EBV感染可引起患者免疫功能下降，其中IM 組患兒血清免疫球蛋白水平變化不明顯，EBV-HLH 患兒免疫球蛋白水平出現明顯下降[16，17]，本研究結果與其基本類似，提示隨著病情進展，機體免疫功能下降。

本研究中，隨著IM向CAEBV 和EBV-HLH組進展，患兒EBV-DNA載量和LMP1表達水平明顯升高。LMP1基因是公認的EBV致癌基因，近年來研究顯示，LMP1可以通過誘導核因子κB信號通路活化，調節多種免疫炎癥介質釋放，參與IM的疾病進展[18]，提示LMP1與EBV感染的病情進展有關，臨床可根據患兒血清LMP1水平，評估疾病進展，指導臨床個體化治療方案的進行。本研究中，EBV-HLH組患兒LMP1基因XhoⅠ位點(-)和Del-LMP1的發生率明顯高于IM組和對照組，說明LMP1基因多態性與EBV感染進展有關。LMP1基因位于在EBV標準株B95-8中的nt169474-168193 之間，編碼含 386 個氨基酸(amino acid，aa)的跨膜蛋白LMP1。XhoI(-)變異是指LMP1 基因N 端第 17 位氨基酸出現核苷酸t→g突變，導致XhoI酶切位點丟失，del-LMP1變異是指C端胞漿區(aa187～386)出現30 bp缺失(aa343-352 GGGHSHDSGH)[19]。Wang等[20]研究顯示，XhoI(-)和del-LMP1變異與EBV感染相關淋巴瘤的發生有關。本研究中，EBV感染相關非腫瘤疾病患兒LMP1基因XhoⅠ位點(-)變異和del-LMP1位點變異與EBV-DNA、LMP1蛋白和LMP1 mRNA 呈顯著正相關關系，說明XhoI(-)和del-LMP1變異可能通過影響EBV感染相關蛋白LMP1表達，推進疾病進展。

綜上所述，EBV-HLH患兒的免疫功能明顯低于CAEBV患兒，低于IM患兒，EBV-DNA載量和LMP1表達水平明顯高于CAEBV患兒，高于IM患兒，且EBV感染相關非腫瘤疾病患兒LMP1基因XhoⅠ位點(-)變異和del-LMP1位點變異與EBV-DNA、LMP1蛋白和LMP1 mRNA 呈顯著正相關關系，臨床可根據EBV患兒LMP1基因多態性和血清中水平變化，指導臨床治療工作的進行。

本研究不足之處在于樣本數量較少，且本研究主要探討了EBV感染相關非腫瘤疾病患兒LMP1基因多態性變化，但基因多態性影響EBV感染進展的具體機制尚不明確，需進一步研究探索。