神經生長因子、酪氨酸激酶及B7-H4與宮頸癌病情進展、預后的關系研究

劉海龍，李 娟，蒲雪峰，龍樹林，滕 蕓

(四川省岳池縣人民醫院婦產科，四川 廣安 638300)

宮頸癌是女性生殖系統常見的惡性腫瘤，且近年來該病的發病率和死亡率呈現逐年上升的趨勢[1]。相關研究表示，宮頸癌盡早干預患者預后較好，故尋找有效的分子標記物用來評價宮頸癌患者預后有重要意義[2]。神經生長因子(nerve growth factor，NGF)是神經營養因子家族成員之一，可與靶細胞受體結合，經過不同的信號傳導途徑調節細胞的增殖、存活和凋亡等生物學作用[3]。而酪氨酸激酶(tyrosine kinase，TrkA)是NGF的其中一類受體，相關研究表示，當NGF與TrkA結合可促進血管內皮生長因子表達，進而促進腫瘤血管生成，考慮與腫瘤進展密切相關[4]。此外，B7-H4作為B7家族新發現的成員，研究表示其可抑制T細胞增殖及細胞周期進展調控T細胞免疫應答，被臨床認為對早期宮頸癌具有診斷價值；然而其表達與宮頸癌患者各項臨床指標及預后的關系尚不明確[5]。本研究就宮頸癌NGF、TrkA及B7-H4的表達情況及與病理特征、預后的關系進行分析，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集我院病理科于2016年6月至2018年6月經術后病理確診為宮頸癌的109例患者臨床資料，納入標準：①所有患者有明確的病理學診斷依據，均確診為宮頸癌；②入組前未接受放療及化療；③臨床資料完整且真實；排除標準：①合并血液疾病者；②嚴重精神疾患或癡呆等無法配合本研究者；③合并其他原發性惡性腫瘤者；④中途退出研究者。年齡20～60歲[(35.71±3.82)歲]。收集腫瘤組織及腫瘤旁的正常宮頸黏膜組織，分別作為癌組織組(n=109)和癌旁正常組織組(n=109)。本研究均經本院倫理委員會批準，患者均簽署相關知情同意。

1.2 NGF、TrkA及B7-H4水平檢測方法

1.2.1儀器與試劑 SP試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)、免疫組織化學二抗試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)、磷酸鹽緩沖液(PBS)(北京賽默飛世爾生物化學制品有限公司)、兔抗人B7-H4抗體(北京博奧森生物技術有限公司)、兔單克隆NGF抗體(美國 Abcam公司)、兔單克隆TrkA抗體(美國Abcam公司)。

1.2.2檢測方法 采集所有研究對象宮頸癌組織及癌旁組織，使用生理鹽水清洗表面后保存在10%甲醛溶液中并置于-80 ℃恒溫箱，分為三份。NGF、TrkA及B7-H4水平的檢測采用免疫組織化學方法進行：鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法(SP)[6]，石蠟切片標本厚2 μm，烘烤60 ℃，二甲苯脫蠟，浸泡3次。3次離子水中浸泡抗原修復切片，磷酸鹽緩沖液(PBST)洗3次。內源性過氧化物酶阻斷劑滴加，室溫孵育15 min，沖洗。一抗滴加，室溫孵育1 h，沖洗。辣根酶標羊抗小鼠/兔 IgG聚合物滴加，室溫孵育30 min。對照組采用磷酸鹽緩沖液(PBS) 代替一抗；滴加山羊抗兔二抗(eBioscience)室溫孵育 30 min。二氨基聯苯胺顯色，蘇木精復染，梯度酒精脫水，樹膠封片。

1.3 結果判斷判斷NGF、TrkA及B7-H4蛋白范圍的標準：每張切片在鏡下分別以低倍鏡及高倍鏡進行觀察，對每張切片上中下及里外中9個位置進行觀察，最后對2位專家判斷結果進行比對(差異較大時，需重新同時共同讀片確定)。采用Volm雙評分法[7]進行判定，在染色均勻的腫瘤區，選取5個高倍鏡視野(×400)，按陽性細胞百分率(A值)評分：<25%為1分，25%～50%為2分，>50%為3分；按染色強度(B值)評分：不著色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。綜合染色陽性細胞數與染色強度判斷結果[8]：陰性(-)：0分，弱陽性(+)：1～2分，中度陽性(++)：3～4分，強陽性(+++)：5～6分；兩種計分的乘積為每例的加權分數，加權分數為0為陰性，其余均為陽性。

1.4 隨訪所有患者治療結束后通過電話、微信、到院復診等方式進行隨訪2年，隨訪截止日期為2020年6月30日。

1.5 統計學方法本研究數據均采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。計數資料以n(%)表示，采用t檢驗，計量資料以均數±標準差描述，行χ2檢驗；采用多元Logistic回歸分析影響宮頸癌患者預后生存的危險因素；采用ROC分析NGF、TrkA及B7-H4對宮頸癌患者預后生存的預測價值。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組NGF、TrkA及B7-H4的表達情況比較宮頸癌組織中NGF、TrkA及B7-H4陽性表達率顯著高于癌旁正常組織，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1、圖1。

表1 兩組NGF、TrkA及B7-H4的表達情況比較 [n(%)]

圖1 宮頸癌組織免疫組化染色圖(×500) A：NGF陽性表達；B：NGF陰性表達；C：TrkA陽性表達；D：TrkA陰性表達；E：B7-H4陽性表達；F：B7-H4陰性表達

2.2 NGF、TrkA及B7-H4與宮頸癌患者不同病理參數的比較有淋巴結轉移、FIGO分期處于Ⅱa期、宮頸間質浸潤深度>1/2 mm、組織分化為G2、G3的患者NGF、TrkA及B7-H4陽性表達率顯著高于無淋巴結轉移、FIGO分期處于Ⅰb期、宮頸間質浸潤深度≤1/2 mm、組織分化為G1的患者，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 NGF、TrkA及B7-H4與宮頸癌患者不同病理參數的比較

2.3 宮頸癌患者預后情況109例患者經兩年隨訪后顯示，患者2年生存率為59.63%(65/109)。

2.4 影響宮頸癌患者預后生存的單因素分析表3顯示，不同FIGO分期、分化程度、淋巴轉移、宮頸間質浸潤深度、腫瘤直徑、NGF、TrkA及B7-H4的宮頸癌患者生存率比較差異無統計學意義(P<0.05)；而不同年齡、宮旁浸潤患者的生存率比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表3 影響宮頸癌患者預后生存的單因素分析

2.5 影響宮頸癌患者預后生存的多因素分析表4顯示，FIGO分期、分化程度、淋巴轉移、宮頸間質浸潤深度、NGF、TrkA及B7-H4是影響患者預后的獨立危險因素(P<0.05)。

表4 影響宮頸癌患者預后生存的多因素分析

2.6 NGF、TrkA及B7-H4對宮頸癌患者預后生存的預測價值采用ROC曲線分析 NGF、TrkA及B7-H4及三者聯合對宮頸癌患者預后生存的預測價值，NGF、TrkA及B7-H4及三者聯合曲線下面積分別為0.761、0.733、0738、0.853，各指標曲線下面積以聯合檢測最大。見表5、見圖2。

表5 NGF、TrkA及B7-H4對宮頸癌患者預后生存的預測價值

圖2 NGF、TrkA及B7-H4對宮頸癌患者預后生存的預測價值

3 討論

近年來我國宮頸癌發病率逐年上升，盡管目前宮頸癌的外科手術已取得長足的進步，但術后復發轉移及死亡的風險仍較高[9]。本研究顯示，109例宮頸癌患者死亡率為40.36%，基本與既往研究相似，故尋求有效治療靶點對降低宮頸癌患者死亡率有重要意義。

NGF是一種多功能、多肽性的物質，通過與靶細胞表面上的神經生長因子受體結合，介導發生生物學效應[10]。NGF一方面可作為絲裂原促進腫瘤分離、增殖；另一方面還可以通過自分泌和旁分泌作用促進骨髓瘤、纖維肉瘤、胃癌等多種惡性腫瘤細胞的血管新生及神經周圍浸潤[11，12]。而TrkA是trkA原癌基因編碼的產物，對 NGF親和力高，具有內在酪氨酸激酶活性，是NGF的功能性受體[13]。研究發現，當TrkA與NGF結合，可形成跨膜氨基酸激酶gp140 Trk 組成二聚體，催化酪氨酸殘基磷酸化，增強酪氨酸激酶活性；同時，在ras原癌基因的協助下，使信號向細胞內傳導，激活RAS-MAPK通路，影響基因翻譯、轉錄，進而調控細胞生長；影響惡性腫瘤細胞增殖、侵襲及轉移[14]。此外，B7-H4是B7家族近年來研究較廣泛的共刺激分子，通過抑制T淋巴細胞增殖，控制細胞周期，降低細胞因子產生發揮負性調節T細胞免疫應答作用，對機體內環境維持具有重要意義[15]。Lin[16]表示B7-H4分子異常表達可使機體對腫瘤免疫監視發展為免疫耐受，引發腫瘤免疫逃逸，導致腫瘤進展。目前已在前列腺癌、宮內膜癌、乳腺癌、卵巢癌等多種腫瘤證實關系密切[17]。而本研究顯示宮頸胃癌組織組NGF、TrkA及B7-H4陽性表達率顯著高于癌旁正常組織組，且與FIGO分期、淋巴結轉移及分化程度有關，與既往Faulkner[18]等學者對宮頸癌中研究一致，說明NGF、TrkA及B7-H4在宮頸癌患者中惡變程度、侵襲轉移中占有重要作用。

同時，為明確影響宮頸癌患者預后影響的危險因素，研究對宮頸癌患者進行為期2年隨訪發現，患者死亡率為40.36%。相關研究發現，B7-H4與宮頸癌細胞胞增殖和凋亡、細胞周期調節、信號傳導有關蛋白相互作用在腫瘤發生發展過程發揮作用，其水平與宮頸癌患者3年生存率密切相關[19]。而相關國外研究也曾表示，NGF表達水平可作為宮頸癌患者疾病程度與預后的生物學標志[20]。本研究予以Logistic回歸分析中顯示，FIGO分期、分化程度、淋巴轉移、浸潤深度、NGF、TrkA及B7-H4是影響患者預后的獨立危險因素(P<0.05)。與上述研究一致，有力證明了NGF、TrkA及B7-H4與宮頸癌患者關系密切。此外，本文為深入了解NGF、TrkA及B7-H4與宮頸癌患者預后生存的價值，本研究采用ROC曲線研究顯示，三者水平聯合檢測最大，進一步證實NGF、TrkA及B7-H4與宮頸癌患者預后死亡的重要指標；考慮與NGF、TrkA及B7-H4通過參與腫瘤細胞的分化、浸潤和轉移影響宮頸癌患者臨床結局。但本研究由于納入的樣本量有限，研究結果有待通過進一步擴大樣本量或多中心合作研究予以證實。

綜上所述，NGF、TrkA及B7-H4在宮頸癌組織中呈異常表達狀態；其表達水平與患者的腫瘤臨床病理特征及預后有關，可作為預測宮頸癌患者預后的分子標志物和潛在的治療靶點。